En este artículo se utiliza principalmente para examinar la tirosina quinasa estimulada por la insulina. anticuerpo antifosfotirosina se utiliza para detectar los receptores fosforilados, que pueden ser separados por SDS-PAGE.
Reactivos y kits
rata purificada membrana de la célula de hígado, un receptor de insulina parcialmente purificado, purificado del receptor de insulina, insulina porcina, ATP , un anti-dos tampón contra la autofosforilación, solución de partida, tampón de muestra de SDS-PAGE, fluido de transferencia de Western Blot, tampón de bloqueo Tris-HCl, NaCl y Tween-20
Equipo
gel Protein aparato de electroforesis, Whatman papel 3MM de filtro, membrana de nitrocelulosa, tanque de transferencia electroforética y el kit de ensayo de inmunotransferencia ECLTM
Procedimiento experimental
autofosforilación
1. Configuración de la siguiente mezcla: Preparar seis tubos. La adición de 25 ul plasmalema en los dos primeros tubos, 25 ul WGA-muestra en los dos segundos tubos, y la muestra de insulina 25 ul en la tercera dos tubos. Preparación de tampón 4UL en seis tubos. La adición de la insulina de cerdo en el segundo, cuarto y sexto tubos. Y a continuación, añadir agua destilada 5 ul en la primera, tercera y quinta tubos.
2. Incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min.
3. A partir de la reacción de fosforilación mediante la adición de 2 ul 20 mmol /ATP y 4UL 10X solución de partida. Ajuste a temperatura ambiente después de la mezcla. Y entonces se debe incubó durante 15 min.
4. La adición de 10 ul 5 * tampón de muestra SDS-PAGE para terminar la reacción.
5. Hirviendo las muestras durante 5 min.
6. La muestra se cargó en 7,5% de gel de SDS-poliacrilamida y se procesa en la electroforesis bajo tensión de 170V hasta que el frente de colorante se elimina de la gel.
Transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa
1. En primer lugar poner un calor fibrosa en un lado de las carpetas de gel, en el que existe un papel mojado MM Whatman 3 (almohadilla de fibra).
2. El gel se coloca en la parte superior del papel de filtro.
3. Una membrana de nitrocelulosa está cubierto en el gel después se humedece con agua. La eliminación de las burbujas de aire entre el filtro y el gel.
4. Poner un papel Whatman 3 MM húmeda por encima de la membrana de nitrocelulosa. Y entonces será cubierta por otra estera de fibra.
5. Cierre el clip de gel de
6. La abrazadera de gel se pone en el tanque tampón, la membrana de nitrocelulosa se enfrenta al lado del ánodo de la ranura. La mencionada "sándwich" debería tener el siguiente orden:
• Un cátodo (negro)
• La fibra estera
• 3 MM de papel membrana
• Gel
• La nitrocelulosa
papel 3 MM
Fibra estera sobre An ánodo (rojo)
7. El tanque se llena con solución de transferencia de western blot.
8. Ponga en el compartimiento de refrigeración bajo la condición de tensión de 100 V, procesado en la transferencia de electroforesis durante 2 horas.
Western blot
1. Poner membrana de nitrocelulosa en tampón de bloqueo, se incubaron durante una hora bajo la condición de 37 ° C.
2. La colocación de la membrana de nitrocelulosa en una bandeja, que contiene solución de TBST con un (10.000 veces diluido de anticuerpo anti-fosfotirosina) anti-.
3. Shacking la bandeja a temperatura ambiente durante una a dos horas.
4. El lavado de la membrana de nitrocelulosa con 5 ml solución de PBS durante cinco minutos y repetir este cuatro veces. Página 5. Adición de una cantidad suficiente de un segundo anticuerpo (5000 veces de rábano picante diluido conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón), el mantenimiento de la membrana de nitrocelulosa húmeda. Y la incubación a temperatura ambiente durante una hora. Página 6. El lavado de la membrana de nitrocelulosa con una solución de 5 ml TEST durante cinco minutos y repetir esto cuatro veces.
7. Mezcla igual de reactivo 1 y el reactivo 2 tomado de kit de reactivos de transferencia de Western ECL de formular quimioluminiscencia medido de líquido, que luego debe ser vertida sobre una membrana de nitrocelulosa reaccionar durante 1 minuto.
8. Drenar el exceso de reactivo inmediatamente.
9. La colocación de la membrana de nitrocelulosa en una película de envases de plástico.
10. Adición de puntos de orientación. Fosforescentes página 11. proteínas de membrana para la exposición secante 5S, tiempo de 1 minuto o más a la luz hasta la obtención de los resultados deseados.