Extracto
activación aberrante de la vía Wnt contribuye a la progresión del cáncer humano. Los antagonistas que interfieren con las interacciones ligando /receptor de Wnt pueden ser útiles en tratamientos de cáncer. En este estudio, se evaluó el potencial terapéutico de un señuelo soluble del receptor de Wnt en la terapia génica del cáncer. Se diseñó un antagonista Wnt sLRP6E1E2, y generamos una incompetente para la replicación de adenovirus (Ad), dE1-K35 /sLRP6E1E2, y un anuncio oncolítico de replicación competente, RDB-K35 /sLRP6E1E2, tanto sLRP6E1E2 expresar. sLRP6E1E2 impedido la estabilización mediada por Wnt de citoplásmica β-catenina, disminución de Wnt /β-catenina de señalización y la proliferación celular a través de la proteína quinasa activada por mitógeno, y fosfatidilinositol 3-quinasa vías. apoptosis inducida sLRP6E1E2, citocromo
c
liberación, y una mayor división de PARP y caspasa-3. sLRP6E1E2 suprimió el crecimiento del xenoinjerto de tumor de pulmón humano, y reduce la motilidad y la invasión de las células cancerosas. Además, sLRP6E1E2 upregulated expresión de genes marcadores epiteliales, mientras que sLRP6E1E2 downregulated genes marcadores mesenquimales. Tomados en conjunto, sLRP6E1E2, mediante la inhibición de la interacción entre Wnt y su receptor, suprime Wnt-inducida por la proliferación celular y la transición epitelio-mesenquimal transición
Visto:. Lee JS, Hur MW, Lee SK, Choi WI, Kwon YG , CO Yun (2012) a Novel sLRP6E1E2 inhibe la señalización Wnt canónica, la transición epitelio-mesenquimal transición, e induce la apoptosis dependiente de mitocondrias en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (5): e36520. doi: 10.1371 /journal.pone.0036520
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 6 de Noviembre de 2011; Aceptado: 3 Abril de 2012; Publicado: 14 de mayo de 2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Ministerio de Economía del conocimiento (10030051, el Dr. Yun CO), la Fundación de Ciencias e Ingeniería de Corea (2009K001644, 2.010-0029220, el Dr. Yun CO), y la Administración de Alimentos y Medicamentos de Corea (KFDA-10172- 332 para el Dr. Yun CO). Jung-Sun Lee es un estudiante de tercer ciclo patrocinado por el Proyecto Cerebro Corea 21 para la Ciencia Médica, Yonsei University College of Medicine, Seúl, Corea del Sur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es muy agresivo y la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo. En 2009, la Sociedad Americana del Cáncer estima que hubo 219,440 nuevos casos de cáncer de pulmón en los Estados Unidos. terapias estándar, tales como la cirugía y la radiación no son eficaces en muchos casos [1]; sin embargo, una mayor comprensión de los mecanismos moleculares de cáncer de pulmón ha conducido al desarrollo de nuevas terapias prometedoras [2]. A pesar de los avances de la quimioterapia han mejorado la supervivencia global de los pacientes con cáncer agresivo no microcítico de pulmón de células, la quimio-resistencia sigue siendo una de las principales causas de fracaso del tratamiento [3]. Muchos cánceres de pulmón agresivos muestran alteraciones en varios genes asociados con el cáncer, incluyendo Wnt, K-ras, señal extracelular regulada quinasa (ERK), Akt, y la ciclooxigenasa-2, lo que sugiere una vía molecular diferente para la carcinogénesis en adenocarcinomas de pulmón [4] - [6].
el papel de la señalización de Wnt en el cáncer fue sugerido por primera vez hace 20 años con el descubrimiento de Wnt-1 como un sitio de integración para el virus del tumor mamario de ratón [7]. Muchos estudios han informado de que la expresión alterada de ligandos Wnt, receptores y antagonistas extracelulares están asociados con el desarrollo del cáncer /progresión y células madre de auto-renovación /diferenciación [8]. La expresión del ligando Wnt, la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5), y LRP6 son upregulated en los cánceres de pulmón, mientras que los antagonistas de Wnt que se unen ligandos Wnt para bloquear la interacción con receptores (por ejemplo, Wnt Factor Inhibidor-1 (WIF- 1), proteínas secretadas relacionadas frizzled-(sFRP) y Dickkopf proteínas (DKK) son downregulated o inactivados [9], [10]. de acuerdo con ello, los anticuerpos monoclonales y los pequeños RNAs de interferencia contra Wnt y la sobreexpresión de antagonistas de Wnt suprimir el crecimiento tumoral en varios
in vitro
y
in vivo
modelos tumorales.
LRP6, un miembro de la superfamilia de PRL, se requiere para la activación de la vía canónica de señalización Wnt, lo que conduce a la estabilización y la translocación nuclear de β-catenina, la molécula clave efector [11] LRP6 consta de pares de dominio de cuatro distinta YWTD β-hélice /similares a EGF;. se requiere que los primer y segundo dominios YWTD (E1 y E2) para la unión a Wnt [ ,,,0],12] - [14]. En el presente estudio, hemos explorado el potencial terapéutico de una novela soluble receptor Wnt, sLRP6E1E2, que se compone de las regiones LRP6 E1 y E2. Se examinaron los efectos biológicos de sLRP6E1E2 unión a ligandos Wnt extracelular y el bloqueo de las interacciones ligando-receptor. Nuestros resultados proporcionan evidencia directa de que las interacciones específicas ligando /receptor Wnt tienen un uso potencial como agentes terapéuticos contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Cuidado de los animales se realizó de acuerdo con directrices nacionales e internacionales, en una instalación para animales acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC). se redujo al mínimo el número de animales utilizados, y se tomaron todas las precauciones necesarias para mitigar el dolor o sufrimiento. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el sistema de salud de la Universidad de Yonsei (desde 2010 hasta 0160).
Materiales
Los anticuerpos policlonales contra MAPK quinasa (MEK1 /2), p44 /42 mitogen activado por la proteína quinasa (MAPK; Erk1 /2), mTOR, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y Akt, y anticuerpos monoclonales contra Wnt3a, Dvl2, Axin, la glucógeno sintasa quinasa (GSK3-β), poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), y se escindió de la caspasa-3 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra epitelial a mesenquimal transición (EMT) moléculas relacionados con la PI β-catenina, E-cadherina y vimentina se obtuvieron de Cell Signaling Technology, y el anticuerpo contra el N-cadherina se adquirió de eBioscience (San Diego, CA). Los anticuerpos contra la ciclina D1 (H-295), el citocromo
c
(C-20 para el análisis de transferencia Western), y LRP6 (C-10), y /G perlas de agarosa con proteína A se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA). anticuerpo monoclonal contra la caspasa-3 fue de StressGen Biotecnologías (Victoria, BC). anticuerpo policlonal contra citocromo
c
(6H2.B4 para inmunohistoquímica) era de BD Pharmingen (San Diego, CA). Los anticuerpos IgG anti-conejo conjugados 488 y Alexa Fluor 568-conjugado Alexa Fluor se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). DAPI (1 mg /ml), Hoechst 33342, e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) faloidina conjugada fueron de Sigma (St. Louis, MO). Wnt3a proteína purificada se adquirió de I + amp;.; D Systems (Minneapolis, MN)
Líneas celulares y condiciones de cultivo
de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células A549 líneas, H460, H358, H596 y eran se mantuvieron en medio de alta glucosa de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY); líneas celulares H322, H2009 y H1299 se cultivaron en RPMI 1640 (Life Technologies) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% de ácidos MEM no esencial amino, penicilina-estreptomicina (100 IU /ml), y la solución salina equilibrada de Hank (Life Technologies). Las células fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se mantuvieron a 37 ° C en una cámara humidificada a 5% de CO
2.
Generación de adenovirus vectores que expresan Soluble LRP6 Receptor
Para estudiar la función bioquímica de los receptores LRP6 soluble (sLRP6E1E2), se generaron construcciones de los dominios extracelulares E1 y E2 (Wnt-sitios de unión) de LRP6 [15] y la bandera de etiquetado sLRP6E1E2 se subclonó en un vector lanzadera pCA14 [ ,,,0],dieciséis]. Este vector pCA14-sLRP6E1E2 se co-transforma con un adenovirus incompetente para la replicación 5/35 vector quimérico (dE1-K35) o quimérico vector adenovirus oncolítico de replicación competente (RdB-K35) [17], la generación de PDE1-K35 /sLRP6E1E2 y pRdB -k35 /sLRP6E1E2, respectivamente. Estos plásmidos recombinantes se transfectaron en células HEK293 para generar dE1-K35 /sLRP6E1E2 y RDB-K35 /sLRP6E1E2. El dE1-K35 /LacZ incompetente para la replicación y vectores RdB-K35 oncolíticos competentes para la replicación se utilizaron como controles negativos [18] (Fig. 1A). Se obtuvieron todos los virus como se describe anteriormente [19].
(a) Representación esquemática de la estructura genómica de vectores de Ad utilizado. (B) endógena Wnt3a (panel izquierdo) y LRP6 (panel derecho) expresión en varias líneas celulares de cáncer de pulmón humano. (C) la secreción y la expresión de sLRP6E1E2. sobrenadantes de cultivos celulares fueron evaluados con FLAG Ab específico (panel superior). Ponceau tinción se muestra como control de carga (panel inferior). (D) células H322 y H460 se transdujeron con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 (50 MOI) durante 48 horas. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con antisueros frente a Wnt3a (IP: Wnt3a) o LRP6 (IP: LRP6). seguida de Western blot con los mismos anticuerpos
luciferasa reportero de ensayo para la actividad β-catenina
TOPflash y FOPFLASH vectores indicadores de luciferasa (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) se utilizaron para medir β-catenina /factor de las células T (TCF) la actividad de señalización. A549, H322 y células H460 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 0,3 g TOPflash (que contiene de tipo salvaje sitios de unión TCF) o FOPFLASH (que contiene sitios de unión TVC mutados) control negativo con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 (20, 50 MOI) en medio libre de suero. Después de 12 h, el medio se reemplazó con 1% de DMEM con o sin 100 ng /ml de Wnt3a, y se incubaron las células durante otras 24 hr. Las células se lisaron con tampón de lisis pasivo, y se analizó 20 l de extracto de células usando el Dual Luciferase-Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
Se realizó la transfección de siRNA
siRNA transfección como se describe anteriormente [20]. Brevemente, las células fueron cultivadas en placa de seis pocillos a 60% de confluencia e inmediatamente antes de la transfección se lavan con medio libre de suero, y se añadieron 800 l de medio libre de suero por pocillo. Mezcla de 0,3 g TOPflash vector, LRP6-específico o controlar siRNA (10 nM) y 5 l de lipofectamina (Invitrogen) en 200 l de medio libre de suero y luego se incubó durante 20 min a temperatura ambiente y se añadió en cada pocillo. El suero se añadió 8 horas más tarde a una concentración final de 10%. El día siguiente, las células se estimularon con o sin Wnt3a recombinante (100 ng /ml) para un 16 hr adicional.
Ensayo de proliferación celular
El ensayo de proliferación celular se determinó por 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo (Sigma). células A549 y H322 se sembraron en placas de 24 pocillos (2 × 10
4 células /pocillo). Después de 24 horas, las células fueron tratadas con PBS, dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2. El día siguiente, las células se estimularon con o sin Wnt3a recombinante (100 ng /ml) para un 48 hr adicional. La absorbancia a 540 nm se leyó en un lector de microplacas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Western Blotting
Las células cultivadas en DMEM con suero bovino fetal al 1% en 100-mm placas fueron transducidas con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 . El día siguiente, las células se trataron con o sin Wnt3a (100 ng /ml) durante 16 hr. La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [17]. membranas bloqueadas se incubaron con anticuerpos contra Wnt3a, FLAG, LRP6, Dvl2, Axin, ciclina D1, GSK3-β, MEK1 /2, p44 /42 MAPK (Erk1 /2), survivina, mTOR, PI3K, Akt, PARP, pro- caspasa 3, caspasa-3 escinde, y el citocromo
c
la noche a 4 ° C. Las transferencias se incubaron con los siguientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante: de cabra anti-IgG de conejo, de cabra anti-IgG de ratón, o IgG de ratón anti-cabra (Cell Signaling Technology) y se desarrolló usando un aumento de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia ).
Análisis de inmunoprecipitación
H322 y H460 células sembradas en placas de 10 cm fueron infectadas con cada anuncio (MOI, 50). Cuarenta y ocho horas después de la infección, se cosecharon y se lisaron en tampón de lisis de las células (50 m
M
HEPES que contiene 0,15
M
NaCl, 0,5% Nonidet P-40, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo proteinasa inhibidores, tosil-L-lisina clorometil cetona, y
N
tosil-L-fenilalanina clorometil cetona). El lisado celular total (500 mg) se inmunoprecipitó primero con Wnt3a o anticuerpo LRP6 y analizada por Western blot con anti-Wnt3a y el anticuerpo anti-LRP6.
ensayo de inmunofluorescencia
Para la microscopía de inmunofluorescencia, se cultivaron las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente, y después se permeabilizaron mediante incubación durante 15 min con 0,1% Triton X-100 en PBS. Las muestras se bloquearon con albúmina de suero bovino 1% seguido de incubación con E-cadherina, β-catenina, o anti-citocromo
c
anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. El día siguiente, las células se lavaron con PBS y se incubaron con Alexa Flour 488 cabra conjugado anti-IgG de conejo anticuerpo secundario durante 60 min a temperatura ambiente. El tratamiento final de anticuerpo también contenía actina TRITC-conjugado y Hoechst 33342 o la mancha DAPI (ambos a 1 g /ml, Sigma) para la tinción nuclear. Los portaobjetos se montaron con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA), y las células se observa bajo un microscopio confocal láser de barrido (LSM510, Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY).
mitocondrial Fraccionamiento y Western Blotting
fracciones mitocondriales se prepararon usando el kit de aislamiento de mitocondrias Qproteome (QIAGEN, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron con solución de cloruro sódico al 0,9% se suspendieron con tampón de lisis enfriado en hielo pipeteando arriba y abajo. Después de una incubación de 10 min, lisado se centrifugó a 1000
g
durante 10 min a 4 ° C, y el sobrenadante que contiene las proteínas citosólicas se retiró cuidadosamente. El sedimento que contiene núcleos, restos de células, y las células sin romper se resuspendió con tampón de interrupción enfriada con hielo y se centrifugó a 1000
g
durante 10 min a 4 ° C, y el sobrenadante (fracción microsomal) se transfirió a un limpio microtubo. El sedimento resultante que contiene mitocondrias se lavó con el tampón de almacenamiento mitocondrias y se centrifugó a 6000
g
durante 20 min a 4 ° C; una banda hacia la parte inferior del tubo se recogió como una fracción mitocondrial. Western Blot se realizó con el anticuerpo anti-conejo citocromo
c
anticuerpo utilizando el procedimiento descrito anteriormente.
Efectos Anti-tumor en xenoinjerto Humano Modelo
pulmón de células no pequeñas humano cáncer (H460) de xenoinjertos se estableció en 6 a 8 semanas de edad nu /nu atímicos macho (Charles River Japón, Yokohama, Japón) mediante la implantación subcutánea de 1 x 10
7 H460 células en el abdomen. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 80 a 100 mm
3, los ratones se dividieron cinco grupos con los volúmenes tumorales medios similares. Los vectores adenovirales se administraron por vía intratumoral (2 × 10
10 partículas virales /ratón) en el primer día de tratamiento (día 1) y los días 3 y 5. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en el Colegio de Medicina de la Universidad Yonsei conforme a las disposiciones institucionales , en una instalación para animales acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC). El volumen del tumor (
V
) se calculó como
V
= 0,52 ×
a
2 ×
b gratis (
a
, diámetro superficial más pequeña;
b
, el mayor diámetro superficial)
histología del tumor y la inmunohistoquímica
El tejido tumoral se fijó en paraformaldehído al 4% y embebidos en cera de parafina para histológico. examen y tinción inmunohistoquímica. representante secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina y se examinaron por microscopía de luz. Para cuantificar la densidad capilar y la expresión de Wnt, las secciones de tumor se tiñeron con anti-ratón CD31 IgG (BD Pharmingen), anti-conejo β-catenina IgG (Cell Signaling Technology), o anti-ratón IgG Wnt3a (Santa Cruz Biotechnology). Después de inactivar la actividad de peroxidasa endógena y el bloqueo de la proteína de unión no específica con suero de cabra normal (Vector Laboratories), las secciones se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche, y luego con IgG secundario biotinilado (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). inmunorreactividad positiva se visualizó con kits de ABC-peroxidasa (kit ChemMate ™ Dako Envision ™ Detección; Dako). Los controles se prepararon mediante incubación con IgG de clase emparejados y emparejados por especies irrelevantes. Todas las diapositivas se counterstained con hematoxilina de Mayer. Los niveles de expresión de Wnt3a y β-catenina se evaluaron semi-cuantitativamente usando software de análisis de imágenes MetaMorph® (Universal Image Corp., Westchester, PA). Los resultados se expresaron como densidad óptica media de cinco imágenes digitales diferentes.
desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP Nick Fin Etiquetado Ensayo
El 5-m fijados en formalina y se deparaffinized secciones de tejido incluidas en parafina y rehidratada de acuerdo con protocolos estándar [21]. La apoptosis se detectó con el terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo (Sistema DeadEnd ™ fluorométrico TUNEL; Promega). Brevemente, las secciones de tejido se permeabilizaron con proteinasa K (20 mg /ml) durante 10 min a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y fluoresceína-12-dUTP en tampón TdT a temperatura ambiente durante 60 min y se lavaron con tampón TdT. Por último, los núcleos se contratiñeron con DAPI. Las muestras fueron analizadas por microscopía de fluorescencia utilizando un filtro fluorescente estándar.
migración y la invasión de ensayo
in vitro
ensayos de migración se realizaron como se describe anteriormente [22]. En pocas palabras, la superficie inferior de filtros de policarbonato de 6,5 mm (8-micras de tamaño de poro; Corning Costar, Cambridge, MA) se revistió por inmersión en 0,1% de gelatina. El medio condicionado se obtuvo a partir de células A549 transducidas con PBS, dE1-K35 /LacZ y dE1-K35 /sLRP6E1E2 después de tratamiento con o sin Wnt3a y colocado en la cámara Transwell inferior. Las células A549 se sembraron en la cámara superior (7 × 10
4 células /pocillo). Los cultivos se incubaron a 37 ° C durante 4 horas, se fijaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina.
in vitro
ensayos de invasión de Matrigel se realizaron utilizando cámaras de migración de células bio-capa. Filtros (8-micras de poro) fueron recubiertas con Matrigel matriz de membrana basal (37 mg /filtro; BD Biosciences, San Jose, CA), y el experimento se realizó como se describe para el ensayo de migración celular. Después de 24 h, se eliminaron las células no invasora, y las células invasoras en la superficie bajo del filtro fueron fijadas y teñidas. Las membranas se montaron en portaobjetos de vidrio, y se contaron las células migradas a 200 × magnificación. Cinco campos fueron contados para cada ensayo, y los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Resultados de los grupos se compararon mediante análisis de varianza de una sola vía, seguido de post-hoc de Student
t-test para
observaciones no apareados o la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples cuando sea apropiado.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Soluble Wnt Decoy receptor se expresa en líneas celulares de cáncer de pulmón y se une a Wnt3a
Endógeno Wnt3a y los niveles de LRP6 fueron evaluados en siete líneas no microcítico de pulmón de células cancerosas (A549, H322, H596, H460, H358, H2009, H1299) y Western blot. Tanto Wnt3a y LRP6 se expresaron con más fuerza en H322, H460, y las células H2009 que en otras líneas de células (Fig 1B y Figura S1.); por lo tanto, se seleccionaron las células H322 y H460 para evaluar la capacidad del receptor señuelo Wnt soluble (sLRP6E1E2) para inhibir la señalización de Wnt. Expresión de sLRP6E1E2 de dE1-K35 /células A549 transducidas con sLRP6E1E2 fue confirmada por análisis de Western blot utilizando anticuerpos anti-FLAG (Fig. 1C). La secreción de sLRP6E1E2 DE-K35 /células transducidas con sLRP6E1E2 era dependiente de la dosis. Para garantizar la igualdad de carga, proteínas transferidas se visualizaron por tinción con Rojo Ponceau.
Para investigar más a fondo si sLRP6E1E2 expresa a partir de dE1-K35 /sLRP6E1E2 puede interferir la capacidad de unión de LRP6 endógena de Wnt3a, lisados celulares de dE1-k35 /LacZ- o-K35 dE1 /sLRP6E1E2 transducidas H322 y H460 células que sobreexpresan de forma endógena Wnt3a se inmunoprecipitaron con niveles LRP6 total de (abajo) Wnt3a o anticuerpo LRP6 y, a continuación endógeno Wnt3a (arriba) y se detectaron con anti-Wnt3a y anti- anticuerpo LRP6. Hemos observado que tanto Wnt3a y los niveles de proteína LRP6 fueron más bajos en las células transducidas con dE1-K35 /sLRP6E1E2 que en las células transducidas con dE1-K35 /lacZ (Fig. 1D), lo que demuestra que expresa exógenamente sLRP6E1E2 puede unirse eficientemente a Wnt3a, lo que lleva a la prevención de la interacción entre LRP6 endógeno y Wnt3a.
Nivel Decoy Wnt receptor Disminuciones Citosólica β-catenina y TCF actividad transcripcional
a continuación hipótesis de que la proteína secretada sLRP6E1E2 inhibir la señalización de Wnt por unión directa a Wnt. Por lo tanto, para caracterizar los efectos sLRP6E1E2 en la señalización /β-catenina Wnt3a, se determinó su efecto sobre la β-catenina usando un sistema indicador de luciferasa activado por ß-catenina /TCF [23]. Como se muestra en la Fig. 2A, la actividad de luciferasa fue baja en células A549 transducidas con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 en ausencia de Wnt3a, ya que el nivel de expresión endógena de Wnt3a en A549 es muy mínimo (Fig. 1B). tratamiento Wnt3a el aumento de expresión de luciferasa de aproximadamente 7 a 8 veces en las células de control, pero no en las células-K35 dE1 /sLRP6E1E2 transducidas con, lo que sugiere que sLRP6E1E2 secretada podría bloquear el efecto de la señalización de exógenamente tratadas Wnt3a. En ausencia de Wnt3a, la actividad de luciferasa se redujo en dE1-K35 /sLRP6E1E2 en H460 (48%) y H322 (12%) de las células en comparación con dE1-K35 /controles LacZ (Figura 2B;.
P Hotel & lt ; 0,05). estimulación Wnt3a aumento de la actividad de luciferasa en H460 (53%) y H322 (102%) de las células transducidas con dE1-K35 /LacZ, pero la actividad de la luciferasa fue significativamente menor en dE1-K35 /sLRP6E1E2 transducidas H460 (48%) y H322 (52% células) en comparación con dE1-K35 /LacZ (
P Hotel & lt; 0,05). Con el fin de hacer que este resultado más convincente, se investigó el efecto de siRNA-LRP6 específica (si-LRP6) en la señalización /β-catenina Wnt3a. Como se muestra en la Figura S2, la actividad de luciferasa se redujo significativamente por el tratamiento de la si-LRP6 tanto en presencia y ausencia de Wnt3a, de acuerdo con resultado de más arriba (Fig. 2).
(a) TCF /LEF ensayo indicador de luciferasa en células A549. Para caracterizar los efectos sLRP6E1E2 en la señalización Wnt3a /β-catenina, las células fueron transfectadas con TOPflash (que contiene de tipo salvaje sitios de unión TCF) o FOPFLASH (que contiene los sitios de unión mutados TVC) vector de luciferasa. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a las células-k35 dE1 /LacZ o PBS-transducidas tratados. (B) ensayo informador de TCF /LEF luciferasa en H460 y H322 células. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a PBS o dE1-K35 /células con o sin Wnt3a LacZ transducidas. (C) células H322 se transdujeron con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 (50 MOI) con o sin Wnt3a. Las células se marcaron con anti-β-catenina. Aumento original, × 630. (D) el análisis semi-cuantitativo de los resultados del panel (c) usando el software de análisis de imágenes MetaMorph®. Cada punto de datos indica la media ± SEM (cada grupo, n = 5). **
P Hotel & lt; 0,001 células frente a PBS o dE1-K35 /LacZ-transducidas con Wnt3a
Para evaluar el efecto de sLRP6E1E2 en la localización β-catenina, la tinción de inmunofluorescencia fue. realizado en células H322 tratadas con PBS o transducidas con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2. En ausencia de Wnt3a, la tinción de β-catenina se restringió principalmente a los sitios de contacto célula-célula en todos los grupos. Tras la estimulación Wnt3a, las células de control (PBS y dE1-K35 /LacZ) demostraron una reducción de la localización β-catenina en la membrana plasmática, especialmente en las uniones célula-célula, y el aumento de los niveles de β-catenina en el citosol y el núcleo. Por el contrario, dE1-K35 /células transducidas-sLRP6E1E2 mostraron niveles más bajos de citosólico β-catenina, y los niveles más altos de membrana asociada a β-catenina (Fig. 2C). La cuantificación de la expresión núcleo β-catenina mostró una disminución 98,08% en dE1-K35 /Células sLRP6E1E2-transducidas en comparación con dE1-K35 /controles lacZ en la presencia de Wnt3a (Fig. 2D). Los resultados de estos estudios funcionales demuestran que las interacciones entre sLRP6E1E2 y Wnt pueden ser suficientes para bloquear la señalización de Wnt.
Proliferación Celular Decoy Wnt Receptor sLRP6E1E2 inhibe el cáncer de pulmón
La vía de Wnt regula una amplia gama de celular funciones incluyendo la proliferación [24]. Para probar los efectos de sLRP6E1E2 sobre la proliferación de las células A549 y H322
in vitro
, las células se trataron con PBS o transducidas con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2. En 72 horas después de la transducción con dE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI), la proliferación celular se redujo en un 39% en las células A549 y 51% en H322 células transducidas en comparación con los controles-LacZ dE1-K35 /. estimulación Wnt3a aumento de la proliferación de aproximadamente 10 a 20% en las células control, pero no tuvo efecto aparente sobre dE1-K35 /células transducidas con sLRP6E1E2. La proliferación fue 54% menor en las células A549 y 61% menor en las células-k35 dE1 /sLRP6E1E2-H322 transducidas que las células-k35 dE1 /LacZ transducidas-(
P Hotel & lt; 0,001; Fig. 3A).
(a) células A549 y H322 se transdujeron con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI). El día siguiente, estas células se incubaron con o sin Wnt3a (100 ng /ml). Después de 3 días, la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTT (media ± SEM). *
P Hotel & lt; 0,05,
#
P Hotel & lt; 0,01 frente al control sin tratar para cada grupo; **
P Hotel & lt; 0,001 frente a las células-k35 dE1 /LacZ o PBS-transducidas tratados. N. S. = No significativo. (B) las células A549 se trataron como se ha indicado anteriormente (Fig. 3a). blot utilizando anticuerpos específicos para occidentales LRP6, Dvl2, Axin, ciclina D1, o GSK-3β. se cosecharon (c) células A549 a 6 hr después del tratamiento Wnt3a. El p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-PI3K, PI3K, P-Akt, Akt y proteínas fueron detectados por Western blot.
Para caracterizar las vías implicadas en la señalización antiproliferativo acción de sLRP6E1E2, hemos examinado sus efectos sobre la señalización de Wnt canónica. Como se muestra en la Fig. 3B, LRP6, Dvl2 y los niveles de proteína en las células Axin control (PBS y dE1-K35 /LacZ) se incrementaron en un Wnt3a, pero eran aparentemente inalterada por Wnt3a en las células-k35 dE1 /sLRP6E1E2 transducidas. Del mismo modo, la expresión de ciclina D1 se aumentó ligeramente en el control de las células después de la estimulación Wnt3a, pero disminuyó ligeramente en las células transducidas /sLRP6E1E2-dE1-K35. los niveles de GSK3 también apareció disminuyeron ligeramente después del tratamiento Wnt3a.
Wnt juega un papel fundamental en la proliferación mediante la activación de ERK1 /2 y las vías PI3K-Akt [25]. Por lo tanto, se investigó si sLRP6E1E2 puede regular a la baja estas vías. Como se muestra en la Fig. 3C, la fosforilación de Erk1 /2, PI3K, y Akt se upregulated por tratamiento Wnt3a, pero los niveles de phorphorylation fue menor en /de las células transducidas con sLRP6E1E2 dE1-K35 comparación con los de células tratadas con PBS y-K35 dE1 /LacZ-transducidas. Expresión de mTOR, PI3K, y Akt no se vio afectada por la estimulación Wnt3a, y fue menor en dE1-K35 /células sLRP6E1E2-transduced que los controles en células H460 (Figura S3). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que sLRP6E1E2 ejerce acciones antiproliferativas mediante la inhibición de la señalización de Wnt a través de MEK-ERK y PI3K- Akt vías.
Decoy Wnt Receptor sLRP6E1E2 induce la apoptosis
señalización Wnt puede prevenir la apoptosis y promover la proliferación celular y la supervivencia [26]. Para la caracterización de los mecanismos moleculares por los cuales sLRP6E1E2 inhibe la proliferación de cáncer no microcítico de pulmón de células, se evaluaron los efectos de sLRP6E1E2 sobre la apoptosis. A los 3 días después de dE1-K35 /sLRP6E1E2 transducción, se observó que el A549, H1299, H358 y células individual gradualmente de la placa de cultivo y se convirtió en más redondo y más pequeño que las células unidas (Fig. 4A), lo que sugiere que la apoptosis inducida sLRP6E1E2. Evidencia de apoptosis se buscó mediante la búsqueda de cuerpos apoptóticos nucleares (datos no mostrados), y luego evaluó usando el ensayo de TUNEL para detectar la fragmentación del ADN internucleosomal [27]. Como se muestra en la Fig. 4B, se observaron más células TUNEL positivas entre las células dE1-K35 /sLRP6E1E2 transducidas que entre las células de control en presencia o ausencia de Wnt3a. La cuantificación de la tinción TUNEL reveló que la tasa de apoptosis fue de aproximadamente 1,9 veces mayor (sin Wnt3a) y 2,8 veces mayor (con Wnt3a) en dE1-K35 /sLRP6E1E2-transduced células que en los controles-K35 dE1 /LacZ-transducidas
(P Hotel & lt; 0,001) (Fig. 4C)
(a) Las células fueron transducidas con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 al (20 MOI), y las fotografías fueron tomadas. a 72 horas más tarde. Aumento original, × 200. (B) Detección de apoptosis sLRP6E1E2-inducida por la tinción de TUNEL. Aumento original, × 400. (C) Número total de células TUNEL positivas por campos (media ± SEM). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a PBS o dE1-K35 /LacZ tratadas con Wnt3a; **
P Hotel & lt; 0,001 frente a los controles tratados con PBS o-k35 dE1 /LacZ-transducidas. N. S. = No significativo. (D) El análisis de Western de la apoptosis mediada por sLRP6E1E2. H460 células fueron transducidas con dE1-K35 /LacZ o dE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI). El Western blot utilizando anticuerpos específicos contra la PARP escindida, PARP escindida, la procaspasa-3, se escindió de la caspasa-3, y el citocromo
c
. (E) las células H460 se trataron como se ha indicado anteriormente (Fig. 4d). localización subcelular de citocromo
c
se determinó mediante Western blot de las fracciones citosólicas y microsomales.
Seguidamente, evaluó los reguladores de la apoptosis, de las cuales la familia de las caspasas y el citocromo
c ¿Cuáles son los mejor caracterizados. En ausencia y presencia de Wnt3a, de longitud completa de proteína PARP 116-kDa se redujo y 85-kDa fragmentos de escisión se aumentó en las células-K35 dE1 /sLRP6E1E2 transducidas-(Fig. 4D). Los niveles de la forma escindida (activo) de la caspasa-3 también se aumentó notablemente por sLRP6E1E2. Como se muestra en la Fig. 4E células, dE1-K35 /transducidas-sLRP6E1E2 también mostraron un aumento de citosólico citocromo
c
y la disminución del citocromo microsomal
c
. La estimulación con Wnt3a produce efectos similares.
Decoy Wnt Receptor sLRP6E1E2 Inhibe tumor de xenoinjerto Crecimiento
Seguidamente, evaluó la capacidad de los sLRP6E1E2 para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los tumores se generaron por inyección subcutánea de células H460 en la región abdominal de ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 80-100 mm
3, que fueron inyectados con PBS, dE1-k35, k35, RDB-dE1-K35 /sLRP6E1E2, o RDB-K35 /sLRP6E1E2 en los días 1, 3, y 5 . Higo. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.