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PLOS ONE: A PK2 /BV8 /PROK2 Antagonista Suprime Procesos tumorigenos por inhibición de la angiogénesis en el glioma y bloqueo de la infiltración de células mieloides en el cáncer de páncreas

2015/8/3


Extracto

La infiltración de las células mieloides en el microambiente tumoral se asocia a menudo con una mejora de la angiogénesis y la progresión del tumor, dando como resultado un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer. La quimioquina polipéptido PK2 (BV8, PROK2) se ha demostrado que regulan la movilización de células mieloides de la médula ósea, lo que lleva a la activación del proceso angiogénico, así como la acumulación de macrófagos y neutrófilos en el sitio del tumor. Se muestran los anticuerpos neutralizantes contra PK2 para mostrar la eficacia antitumoral potente, lo que ilustra el potencial de PK2 antagonistas como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer. En este estudio se demuestra la actividad anti-tumor de un antagonista de molécula pequeña PK2, PKRA7, en el contexto de modelos de tumor de xenoinjerto de cáncer de páncreas y glioblastoma. Para el glioblastoma altamente vascularizado, PKRA7 se asoció con una disminución de la densidad de los vasos sanguíneos y el aumento de las áreas necróticas en la masa tumoral. En consonancia con la actividad anti-angiogénica de PKRA7
in vivo
, este compuesto reduce eficazmente las células endoteliales microvasculares PK2 inducida por ramificación
in vitro
. Para el cáncer de páncreas pobremente vascularizado, el efecto anti-tumor primario de PKRA7 parece estar mediada por el bloqueo de la migración de células /infiltración mieloide. A nivel molecular, PKRA7 inhibe la expresión inducida por PK2 de ciertas quimiocinas pro-migratorias y receptores de quimioquinas en los macrófagos. La combinación de tratamiento PKRA7 con agentes quimioterapéuticos estándar dio como resultado efectos mejorados en modelos de xenoinjerto para ambos tipos de tumor. En conjunto, nuestros resultados indican que la actividad anti-tumor de PKRA7 puede estar mediada por dos mecanismos distintos que son relevantes para las características patológicas del tipo específico de cáncer. Esta pequeña molécula PK2 antagonista mantiene la promesa que desarrollarse más como un agente eficaz para el tratamiento del cáncer combinatoria

Visto:. Curtis VF, Wang H, Yang P, McLendon RE, Li X, Zhou Q-Y, et al. (2013) Un PK2 /BV8 /PROK2 Antagonista Suprime Procesos tumorigenos por inhibición de la angiogénesis en el glioma y bloqueo de la infiltración de células mieloides en el cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (1): e54916. doi: 10.1371 /journal.pone.0054916

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón

Recibido: 25 Junio, 2011; Aceptado: 17 de diciembre de 2012; Publicado: 23 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Curtis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este era apoyada por CA151541 a XFW del Instituto Nacional del cáncer (www.cancer.gov) y por MH67753 a QYZ de los Institutos nacionales de Salud (www.nimh.nih.gov). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

El microambiente tumoral complejo es un importante contribuyente a la tumorigénesis. En los últimos años, mayor atención se ha colocado en la orientación de las células del estroma en el microambiente tumoral que son responsables de varios aspectos del proceso tumorigénico. las células mieloides derivadas de la médula ósea, que son los precursores de los macrófagos, neutrófilos y células supresoras de origen mieloide, representan una subpoblación de células del estroma que desempeñan papeles importantes durante la progresión tumoral [1]. En respuesta a las citocinas /quimiocinas secretadas por las células tumorales, las células mieloides pueden movilizarse desde la médula ósea y se infiltran en los sitios del tumor en el que puedan promover el crecimiento, la invasión y la angiogénesis para apoyar la expansión del tumor y la metástasis [2]. Por ejemplo, CSF3 (factor estimulante de colonias 3), también conocido como G-CSF, producido por las células tumorales puede conducir a la diferenciación de CD11b
+ Gr1
+ células mieloides en neutrófilos, macrófagos y células dendríticas, que se ha demostrado que ser producido en exceso en pacientes con cáncer y ratones portadores de tumores [1], [3] - [4]. En el sitio del tumor, estos CD11b
+ Gr1
+ células mieloides secretan una variedad de factores que pueden contribuir directamente a la angiogénesis y el crecimiento tumoral [5] - [6].

Entre esos factores producidos por el CD11b
+ Gr1
+ células mieloides se Prokineticin 2 (PROK2), referido como PK2 en este documento, también conocido como BV8. Como uno de los dos miembros de la familia Prokineticin, PK2 se une a dos receptores acoplados a la proteína G altamente relacionados (GPCRs), PROKR1, referido como PKR1 y PROKR2, conocido como PKR2, y afecta a múltiples procesos biológicos incluyendo la nocicepción, ritmo circadiano , la motilidad gastrointestinal, la neurogénesis, la hematopoyesis y la angiogénesis [7]. producción PK2 por CD11b
+ Gr1
+ células mieloides pueden conducir a la formación de un bucle de realimentación positiva, con una mejora de la diferenciación de estas células precursoras mieloides en macrófagos, así como aumento de la movilización de estas células de la médula ósea en la corriente de la sangre [8]. Estos macrófagos diferenciados pueden infiltrarse en el microambiente tumoral y continuar para secretar más PK2, dando lugar a aumento de la proliferación y migración de células endoteliales que expresan PKR1 y PKR2, contribuyendo así a una mayor angiogénesis [8]. Además de estimular las células endoteliales, PK2 fue demostrado que afectan a la producción de citoquinas en los linfocitos de ratón, el aumento de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1B e IL-12 y la disminución de citocinas anti-inflamatorias IL-4 e IL-10 [9] - [10] . receptores PK2 se expresan también en los macrófagos de ratón y células endoteliales; en consecuencia, PK2 puede inducir la migración de estos macrófagos y afectar a la formación de estructuras similares a capilares de las células endoteliales [10] - [13]

Debido a las importantes funciones de PK2 en la creación de un tumor microambiente tumoral favoreciendo. el crecimiento y la progresión, PK2 se ha convertido en un objetivo para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Un número de estudios han demostrado de forma convincente que los anticuerpos neutralizantes contra PK2 podría exhibir un efecto anti-tumor potente en varios tipos de cánceres humanos en modelos de ratón [1], [6], [8]. Esos resultados positivos del tipo de experimentos de prueba de principio han sentado las bases para un mayor desarrollo de agentes anti-PK2 en la terapéutica. En este estudio, se presenta nuestros hallazgos sobre la actividad anti-tumor de una pequeña molécula sintética de antagonista PK2, PKRA7 que puede competir por la unión de PK2 a sus receptores PKR1 y PKR2, en consecuencia, la inhibición de la capacidad de PK2 para activar las vías aguas abajo [ ,,,0],Zhou, manuscrito en preparación]. Elegimos para probar PKRA7 en dos tipos de tumores, glioblastoma y el cáncer de páncreas, que han mostrado persistentemente los peores pronósticos entre todos los tipos de cáncer debido a la falta de una terapia eficaz. Los dos tipos de pantalla cáncer drásticamente diferentes características patológicas. El glioblastoma es altamente vascularizado y se ha mostrado algo de sensibilidad a la terapia anti-angiogénica, mientras que el cáncer de páncreas es a menudo mal vascularizada pero altamente fibróticos con una gran parte de la masa tumoral que consiste en los componentes del estroma incluyendo los macrófagos infiltrados [14] - [16]. Sin embargo, una característica común de ambos glioblastoma y el cáncer de páncreas es la participación de las células mieloides [17] - [20]. Esperábamos determinar si PKRA7 podría tener un impacto en el crecimiento del tumor a través de su efecto inhibidor sobre las células mieloides. En consonancia con esta postulación, nuestros resultados demuestran claramente que PKRA7 posee una actividad anti-tumor fuerte para ambos tipos de cánceres, aunque a través de diferentes mecanismos. Por otra parte, nuestro estudio indica que PKRA7 tiene el potencial para convertirse en uno de los componentes de las terapias combinadas con la atención estándar utilizado actualmente en la clínica y este compuesto es una promesa para un mayor desarrollo para el tratamiento de los cánceres que actualmente tienen muy mal pronóstico.

resultados

PKRA7 suprime el crecimiento tumoral en Nude (nu /nu) ratón modelo de xenoinjerto de glioblastoma través de inhibición de la angiogénesis

a pesar de un anticuerpo neutralizante anti-PK2 fue encontrado por estudios previos para mostrar anti- la actividad tumoral, exploramos la posibilidad de que las moléculas pequeñas pueden ser desarrollados para conseguir la misma eficacia anti-tumor con menores costes y facilitar la administración. Después de definir bioquímicamente la naturaleza molecular de las interacciones entre PK2 y sus receptores [21], se ha determinado la secuencia de hexapéptido amino ácido AVTIGA en el N-terminal de PK2 está completamente conversado entre las especies de mamíferos y no mamíferos y es crítica para la activación de PKR1 y PKR2 [22]. Las mutaciones en esta región incluyendo una A1M (alanina a metionina) sustitución o adición de metionina al extremo N-terminal muestran una fuerte actividad antagonista en presencia de tanto PKR1 y PKR2 expresado de forma estable en células de ovario de hámster chino (CHO) [22]. Después de este descubrimiento inicial, se han sintetizado más de 200 compuestos de pequeñas moléculas que estructuralmente imitan los péptidos mutantes región PK2 N-terminal y probado su capacidad para inhibir competitivamente la activación de los receptores PK2. A partir de esta pantalla inicial, encontramos más de 60 compuestos solubles en agua que exhiben un efecto inhibidor sobre la interacción PK2-receptor con la unión constante por debajo de 20 nM (Zhou, manuscrito en preparación). Hemos elegido PKRA7 compuesto para nuestros experimentos, ya que potencialmente podría inhibir los receptores PK2, con valores de IC50 de 5,0 y 8,2 nM para PKR1 y PKR2, respectivamente (Figura S1), y, más importante, podría penetrar la barrera hematoencefálica, una característica que podría ser crítico para el tratamiento de glioblastoma.

para estudiar el
in vivo
efecto de PKRA7 en el crecimiento del tumor glioblastoma, que primero genera xenoinjertos de tumor de glioblastoma humano subcutáneo en ratones desnudos. 5 × 10
células de glioma 4 D456MG se implantaron en diez ratones desnudos subcutáneamente y los ratones fueron separados en dos grupos de tratamiento 14 días después de la implantación. Los ratones en el primer grupo recibió una inyección intraperitoneal (IP) de tratamiento de control de PEG400 (polietilenglicol) diluido 1:10 en PBS, mientras que el segundo grupo de ratones recibieron inyecciones ip de PKRA7 en la misma solución a una dosis de 20 mg /kg /día. tamaños de los tumores fueron monitoreados cada tres días y las curvas de crecimiento fueron generados (Figura 1A). 30 días después de la implantación, se aislaron los tumores después de que los ratones se sacrificaron y se pesaron (Figura 1B). Los ratones tratados con PKRA7 mostraron una clara disminución tanto en la tasa de crecimiento del tumor D456MG y el peso del tumor. Para determinar el mecanismo por el cual PKRA7 inhibió el crecimiento del tumor de xenoinjerto, que mide los cambios potenciales en la densidad de los vasos sanguíneos y el grado de necrosis en los tumores D456MG tratados o no tratados con este compuesto. Como se muestra en la Figura 1C-F, una disminución notable en la densidad de los vasos sanguíneos relativa y un aumento significativo en las áreas de las regiones necróticas de los tumores PKRA7 tratados se observaron en comparación con los controles, lo que sugiere que PKRA7 puede suprimir la formación de tumores, principalmente mediante la inhibición de la angiogénesis a través PKR1 y PKR2 expresan en las células endoteliales de una manera similar como los anticuerpos PK2-neutrolizing [8], [12] -. D456MG células [13]

(a) eran SC inyecta en ratones desnudos, y de control ( n = 5) o PKRA7 (n = 5) de tratamiento se inició cuando los tumores se hicieron visualmente detectables (14 días). Las mediciones se realizaron cada 2-3 días. (B) El peso medio del tumor de control y los tumores de ratones tratados con PKRA7 después de la eliminación. tinción (C) IHC usando CD34 marcador de células endoteliales en los tumores D456MG SC de ratones tratados con control o PKRA7. (D) La probabilidad acumulativa del buque densidad relativa, medido por tinción CD34. densidad vascular de los tumores disminuyó con el tratamiento PKRA7. (E) imágenes representativas de H & amp; E tinción de secciones de control y tumores SC PKRA7 tratados (F) La cuantificación de regiones necróticas de 5 diapositivas de cada tumor por grupo de tratamiento, los porcentajes de áreas necróticas se midieron mediante ImageJ (* p = 0.05 ). (G) 1 × 10
células 4 D456MG eran IC inyecta en ratones desnudos y el tratamiento comenzó 7 días después de la implantación del tumor. Los ratones de control (n = 8) o tratamiento PKRA7 (n = 9) grupo fueron sacrificados cuando desarrollaron fenotipo neurológico grave indicativo del crecimiento del tumor intracraneal.

Con base en estos resultados prometedores con la supresión de la subcutánea la formación de tumores por PKRA7, hemos empleado la inoculación intracraneal de células de glioma para evaluar la capacidad de PKRA7 para inhibir el crecimiento del tumor en un entorno patológicamente relevantes. Esta vez, el tratamiento iniciado hace 7 días después de 1 × 10
4 D456MG la inoculación de células de glioma con inyecciones IP diarias de PKRA7 o control del vehículo. Los ratones fueron sacrificados cuando los signos neurológicos de la creciente carga tumoral se hicieron evidentes y las fechas se registraron para generar una curva de Kaplan-Meier (Figura 1G). En este ensayo, el tratamiento con PKRA7 prolonga notablemente la aparición de los signos neurológicos de la carga tumoral (supervivencia media de 38,4 días frente a 34,1 días para PKRA7 y control, respectivamente, p = 0.05), indicando que PKRA7 fue eficaz en la inhibición de crecimiento tumoral en el ambiente intracraneal. Se obtuvieron resultados similares con otra línea celular de glioma como para las células D456G (datos no mostrados).

PKRA7 suprime el crecimiento tumoral en Nude (nu /nu) Ratón modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas a través de la inhibición de la infiltración de macrófagos

a continuación se probó si PKRA7 podría tener un impacto en el crecimiento de xenoinjertos de células de cáncer de páncreas humanos debido al papel bien establecido de células mieloides en la formación de cáncer de páncreas. 5 × 10
5 células ASPC-1 fueron inoculadas en ratones desnudos por vía subcutánea y el tratamiento comenzó 7 días después de la implantación, siguiendo el mismo procedimiento que con las células de glioma D456MG. Como se muestra en la Figura 2A, la tasa de crecimiento de las células ASPC-1 fue suprimida por PKRA7, resultando en una reducción significativa en el peso medio de los tumores (Figura 2B). Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó una línea diferente de páncreas humano de células de cáncer, CFPAC-1, en lugar de ASPC-1 en las células (Figura S2).

células (A) ASPC-1 eran SC inyecta en ratones desnudos y control (n = 4) o PKRA7 (n = 5) de tratamiento se inició cuando los tumores se hicieron visualmente detectables (9 días). Las mediciones se realizaron cada 2-3 días. (B) El peso medio del tumor de control y los tumores de ratones tratados con PKRA7 después de la eliminación (* p = 0.05). (C) Representante H & amp; E diapositivas de control y los tumores tratados PKRA7. (D) La cuantificación de regiones necróticas de 5 diapositivas de cada tumor por grupo de tratamiento, los porcentajes de áreas necróticas se midieron mediante ImageJ (p = 0,205719). tinción (E) IHC usando F4 /80 del ratón macrófagos marcador de ASPC-1 SC tumores tratados con el control o PKRA7. (F) La cuantificación de la infiltración de macrófagos promedio de los tumores ASPC-1 tratados con control (n = 4) o PKRA7 (n = 5), 5 diapositivas de cada tumor por grupo de tratamiento (* p = 0.05).

para determinar el posible mecanismo subyacente a la reducción significativa en el crecimiento del tumor debido al tratamiento PKRA7, se examinaron las secciones tumorales para detectar signos de los cambios en la angiogénesis y la necrosis. No hubo diferencias en la densidad de los vasos sanguíneos de que había menos vasos por campo de visión observada en comparación con las secciones de glioblastoma (datos no presentados) y se observaron niveles similares de necrosis de los tumores derivados de tratados y los ratones de control (Figura 2C, RE). En contraste, no hubo una disminución significativa en el número de macrófagos infiltrados en los tumores aisladas de ratones tratados con PKRA7 como se mide por intensidad de la tinción de los macrófagos de ratón marcador F4 /80 (Figura 2E, F). Estos resultados sugieren fuertemente que PKRA7 podría inhibir el crecimiento del tumor de páncreas a través de un mecanismo diferente al bloquear PKR1- y macrófagos PKR2 expresan se infiltren en el microambiente tumoral en lugar de suprimir la angiogénesis, una observación consistente con las características fenotípicas de cáncer de páncreas humano como pobremente vascularizado pero exhibiendo abundante fibrosis desmoplásico y que contiene gran cantidad de células mieloides infiltrados incluyendo los macrófagos [10], [15].

PKRA7 Inhibe la célula endotelial capilar ramas y migración de células mieloides

los resultados de la
in vivo
estudios de xenoinjerto en de glioma humano y células de cáncer pancreático apoyaron firmemente la idea de que la actividad anti-tumor de PKRA7 podría ser mediada a través de dos mecanismos muy diferentes. Para investigar más a fondo a nivel celular, se realizó
in vitro
ensayos para evaluar el impacto de PKRA7 en la actividad angiogénica de las células endoteliales, así como la capacidad migratoria de las células mieloides. células para determinar si PKRA7 afecta a la capacidad de las células endoteliales para formar la red en forma de tubo capilar como un indicador importante de la angiogénesis [23], hemos empleado inmortalizadas humanas endoteliales microvasculares (IHMVECs). Las células fueron tratadas con 200 ng /ml PK2 recombinante solo o PK2 más 1 mg /ml PKRA7 y se sembraron sobre una capa fina de Matrigel. Se utilizó esta concentración de PKRA7 en nuestros
in vitro
experimentos, ya que está cerca de la concentración de PKRA7 en la circulación de los ratones de nuestro
in vivo
experimentos restantes, mientras que no es tóxico para las células en el cultivo de tejidos (datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 3A, PKRA7 inhibido eficazmente capilar PK2 inducida de ramificación tal como se mide por el número de conexiones entre las células, pero no tuvo efecto sobre capilar inducida por VEGFA de ramificación (cuantificación presentado en la Figura 3B). Se obtuvieron resultados idénticos usando dos líneas adicionales de células endoteliales: las células endoteliales embrionarias de ratón y células endoteliales microvasculares humanas primarias (datos no mostrados). La especificidad de la actividad anti-PK2 en este ensayo se confirmó adicionalmente por la demostración de un efecto similar por el antisuero policlonal anti-PK2 (Figura S3 y datos no presentados). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que PKRA7 puede inhibir específicamente el efecto angiogénico de PK2 en las células endoteliales.

IHMVECs (A) se sembraron en Matrigel en los grupos de tratamiento indicados. fotografías representativas fueron tomadas a las 8 horas después de la siembra. (B) Número medio de conexiones entre las células se contó y se analizó. Los resultados son datos normalizados a partir de 3 experimentos independientes. La adición de PKRA7 significativamente bloques capilar de ramificación (* p = 0.05) PK2-inducida. (C) 1 × 10
se permitió 5 células THP-1 en la parte superior de la cámara de los cultivos polarizados para migrar durante 4 horas. Las células se fijaron, se tiñeron y el número de células por campo de visión se contaron. Los resultados son la media normalizada de 3 experimentos independientes. La adición de PKRA7 bloqueado significativamente la migración de monocitos inducida por PK2 (* p = 0.05). (D) 7,5 × 10
se les permitió 4 RAW264.7 células en la parte superior de la cámara de los cultivos polarizados para migrar durante 18 horas. Las células se fijaron, se tiñeron y el número de células por campo de visión se contaron. Los resultados son la media normalizada de 3 experimentos independientes. La adición de PKRA7 bloqueado significativamente la migración de macrófagos inducida por PK2 (* p = 0.05). (E) luminiscencia medida media de sitio del tumor después de la inyección IP de células RAW de luciferasa-marcado en el control (n = 4) o PKRA7 (n = 4) Los ratones tratados con SC ASPC-1 tumores 30 días después de la implantación. Promedio de los recuentos totales de luciferasa fueron más bajos en los ratones tratados con PKRA7 comparación con el control (* p = 0.05). ensayo (F) qPCR para medir el efecto de PKRA7 en la expresión de quimiocinas y receptores de quimiocinas que se identificaron a ser inducida por el tratamiento PK2. Los datos sobre los cambios en el nivel de mRNA se muestran como log2 de los cambios en el valor de Ct. PKRA7 inhibe la regulación positiva de CCL27, CCR10, CCR4, CCR5 y CCR6 (* p = 0.05).

Para determinar el efecto de PKRA7 sobre la migración PK2 inducida de células mieloides, Empleamos al monocitos humanos línea celular THP-1 usando un ensayo de migración transwell. Como se muestra en la Figura 3C, 1 mg /ml PKRA7 afectada eficazmente la migración PK2 inducida de las células THP-1, pero no la migración de estas células hacia CCL2 o monocitos proteína quimiotáctica 1 (MCP-1), un quimioatrayente conocido de THP -1 [24] - [25]. Casi se observaron resultados idénticos con la línea celular de macrófagos de ratón, RAW264.7 con PKRA7 bloqueando específicamente la migración inducida por PK2 pero no la migración inducida por CXCL12, aquí referido como SDF-1α (Figura 3D). Por lo tanto, PKRA7 inhibe específicamente la migración inducida por PK2 de las células mieloides de ambos orígenes humanos y murinos.

Para evaluar el impacto de la migración en PKRA7 /infiltración de macrófagos de ratón en el microambiente de xenoinjertos de tumores formados por células cancerosas pancreáticas humanas , que mide la acumulación en los tumores de células de macrófagos RAW264.7 luciferasa marcado 24 horas después de su inyección IP en los ratones nude 30 días después de la implantación subcutánea de células ASPC-1 de cáncer. Como se muestra en la Figura 3E, se observó una disminución significativa en la señal luminiscente emitida por las células de macrófagos de ratón en ratones tratados con PKRA7 en comparación con la de los ratones de control. Estos resultados indican que PKRA7 es capaz de bloquear la migración de macrófagos /infiltración en el sitio del tumor en un
in vivo
entorno, lo que inhibe la capacidad de los macrófagos para contribuir positivamente al crecimiento de tumores de xenoinjertos.

para examinar más a fondo el mecanismo por el cual los bloques PKRA7 PK2 inducida por la migración de macrófagos, se realizó una serie de citoquinas usando el tiempo real PCR cuantitativa en células THP-1 que fueron inducidas a diferenciarse en células de macrófagos. Entre una serie de 95 ligandos de quimioquinas /citoquinas y sus receptores humanos, cinco mostraron una inducción significativa en su expresión tras el tratamiento con PK2 incluyendo CCL27, CCR10, CCR4, CCR5 y CCR6 (figura S4). Es importante destacar que, al menos cuatro de estas moléculas inducidas se sabe que están implicados en la mejora de la migración de células mieloides y la totalidad de su inducción por PK2 fue mitigado por PKRA7 (Figura 3F), lo que sugiere fuertemente que la supresión de la producción PK2 inducida de estas quimiocinas y los receptores subyace en el mecanismo principal de la actividad antitumoral de PKRA7 en el contexto del cáncer de páncreas.

PKRA7 Mejora de la eficacia de la Norma Terapias para el glioblastoma y cáncer de páncreas en modelos de xenoinjertos

a pesar de que está representada PKRA7 fuertes actividades antitumorales en los contextos tanto de glioblastoma y el cáncer de páncreas, es poco probable que se convirtió en un agente terapéutico se utiliza solo. Para probar si PKRA7 podría aumentar la eficacia del tratamiento quimioterapéutico estándar para glioblastoma, se examinó el efecto de este compuesto en combinación con temozolomida que se utiliza actualmente en la clínica para esta enfermedad [26] - [27]. Siguiendo un procedimiento experimental establecido para evaluar el efecto de la terapia combinatoria en modelos de ratón de xenoinjerto [28] - [29], 1 × 10
4 células D456MG se implantaron por vía intracraneal y seguido de tratamiento con 10 mg /temozolomida kg durante cinco días, y luego, con o sin la administración PKRA7 durante los días restantes de los experimentos. Como se muestra en la Figura 4A, el tratamiento con ambos temozolomida y PKRA7 prolongó la aparición de los signos neurológicos de la carga tumoral en comparación con ratones que recibieron control, temozolomida o PKRA7 solo, lo que indica un mayor efecto de la terapia combinada con los agentes en la inhibición de crecimiento de glioma intracraneal en ratones desnudos (supervivencia media de 49,8 días para PKRA7 más temozolomida vs 44,6 días, ya sea para la temozolomida o PKRA7 sola vs 38,6 días para los controles).

(A) curva de Kaplan-Meier de ratones desnudos después de temozolomida y tratamiento PKRA7 después de la inyección IC de 1 × 10
4 células D456MG. El tratamiento con 10 mg /kg temozolomida o control comenzó 3 días después de la inyección IC para un total de 5 tratamientos diarios consecutivos. El tratamiento con PKRA7 o control comenzó 7 días después de la inyección IC y continuó durante la duración del experimento. 5 ratones por condición. (B) ASPC-1 células fueron SC inyectado en ratones desnudos, y de control (n = 10) o PKRA7 (n = 10) de tratamiento se inició cuando los tumores eran visibles (7 días). El tratamiento con 100 mg /kg de gemcitabina (n = 10) o control (n = 10) se inició 7 días después de la implantación del tumor y se administró cada 4 días durante dos semanas para un total de 4 tratamientos (#). Las mediciones se realizaron cada 3 días. 5 ratones por condición. (C) El peso medio del tumor de control, gemcitabina, PKRA7 y gemcitabina más tumores en ratones tratados con PKRA7 después de su eliminación (* p = 0.05).

Para el cáncer de páncreas, gemcitabina es uno de los principales quimioterapéutico fármacos actualmente utilizados en la clínica y que fue probado previamente en estudios de terapia combinada con células ASPC-1 [30]. En nuestros experimentos, 5 × 10
5 células ASPC-1 se implantaron subcutáneamente en ratones desnudos que fueron tratados con PKRA7 y gemcitabina (100 mg /kg) 7 días más tarde. Como se muestra en la figura 4B, es evidente que los tumores de los ratones recibieron tanto gemcitabina y PKRA7 fueron significativamente más pequeños que los de ratones tratados sólo con gemcitabina o PKRA7. Estos resultados sugieren que la terapia combinada con gemcitabina y PKRA7 podría tener un efecto antitumoral más fuerte que la terapia estándar para reducir el crecimiento del tumor de páncreas xenoinjerto de cáncer en nuestro modelo.

Discusión

Tumorigénesis es un complejo proceso que implica mucho más que la proliferación de células tumorales. Las células tumorales son ayudados y apoyados por el estroma microambiente tumoral circundante que es rico con una mezcla heterogénea de células tales como fibroblastos, células endoteliales y células del sistema inmune [31]. Estas células responden a las señales del tumor en expansión por factores propios que pueden perpetuar la señal de crecimiento, la remodelación de la matriz extracelular, contribuir a la angiogénesis y reorientar el papel de las células inmunes secretoras. La angiogénesis durante mucho tiempo ha sido interpretado como una parte importante de la tumorigénesis y muchos estudios se han realizado para bloquear este proceso [32]. Mientras que los factores angiogénicos importantes han sido identificados como VEGF, agentes terapéuticos contra la vía de señalización VEGF no se han demostrado ser universalmente éxito. De hecho, muchos cánceres son resistentes a la terapia anti-VEGF o se vuelven refractarios a la administración de estas terapias, lo que resulta en la recurrencia que es a veces más agresivo que el tumor primario [14], [16], [33] - [38].

Hay una necesidad de identificar y apuntar a vías de señalización adicionales que pueden contribuir a la angiogénesis o de otros procesos que se han demostrado ser importantes para la progresión del tumor, tales como la infiltración de macrófagos. PK2 y sus receptores son parte de una vía de señalización implicados en células mieloides movilización [8]. Múltiples estudios han demostrado que la CD11b
+ Gr1
+ células precursoras mieloides puede contribuir a la angiogénesis y la tumorigénesis en una variedad de tipos de cáncer [8], [37], [39]. Los macrófagos derivados de esas células precursoras en el microambiente tumoral también pueden secretar citoquinas que afectan directamente el crecimiento de células tumorales. En estudios recientes, la eficacia antitumoral de un anticuerpo anti-PK2 ha sido comparado con el tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF y se encontró que casi tan eficaz en la prevención de la progresión de la enfermedad de un modelo de ratón transgénico de la tumorigénesis de células β de páncreas, mientras la combinación de los dos anticuerpos mostró un efecto incluso más pronunciado en la inhibición de crecimiento subcutáneo de diferentes líneas celulares de cáncer humano (cáncer de colon, el rabdomiosarcoma) y células tumorales de ratón (de mastocitoma, linfoma) [8], [39]. tratamiento con anticuerpos Anti-PK2 también redujo el número de circulación y el tumor infiltrante CD11b
+ Gr1
+ células mieloides, incluyendo los macrófagos derivados de médula ósea, que se han demostrado para mediar la refractariedad a las terapias anti-VEGF en varios mouse modelos de tumor de xenoinjerto [8], [37]. Estos estudios han indicado PK2 como un blanco legítimo para la terapia del cáncer.

terapias basadas en anticuerpos representan una parte significativa de las opciones de tratamiento del cáncer en las clínicas de hoy en día. Sin embargo, los estudios con pacientes y modelos de ratón de glioblastoma y el cáncer de páncreas han demostrado que estos tipos de cáncer pueden ser resistentes o refractarios a anti-VEGF terapias de señalización [14], [16], [33], [35] - [37] . Otros estudios han demostrado que esta respuesta resistente puede ser común a tipos adicionales de cáncer como el cáncer de mama y de colon [34], [40] - [41]. Por lo tanto, los pacientes pueden beneficiarse de terapias adicionales que se dirigen a las vías alternativas en combinación con terapias de señalización anti-VEGF para evitar respuestas refractarios. Así, los inhibidores de moléculas pequeñas ofrecen un enfoque terapéutico alternativo, ya que todavía pueden ser específicos para sus objetivos mientras que ser más rentable de fabricar. Además, se requieren algunas terapias con fármacos para cruzar la barrera hematoencefálica para tratar enfermedades tales como los inhibidores de glioblastoma y de moléculas pequeñas son buenos candidatos para este propósito. En este sentido, nuestra demostración de que PKRA7 es capaz de penetrar la barrera sangre-cerebro en el ratón y actúa para inhibir la formación de tumor de xenoinjerto intracraneal por células de glioma presenta una estrategia alternativa para inhibir la angiogénesis tumoral a través de un mecanismo distinto del de anti-VEGF desde PK2 aumenta la angiogénesis a través de sus G-receptores acoplados a proteína activada por vías [7].

estroma desmoplásico es una característica definitoria de cáncer de páncreas y puede contener altos niveles de macrófagos asociados a tumores (TAM), especialmente en el frente invasivo de cáncer de páncreas [15], [18]. Esta infiltración de macrófagos se cree que contribuyen a la progresión de la enfermedad y se asocia con un mal pronóstico [18]. Estudios recientes indican que las células se encontraron inmunosupresores incluyendo TAM, las células supresoras de origen mieloide (MDSCs) y las células T reguladoras (T
reg) en altos niveles en etapas tempranas y las tardías de la progresión del cáncer en comparación con el tejido normal en un modelo de ratón de pre-invasiva e invasiva adenocarcinoma ductal pancreático [42]. PK2 puede jugar un papel crítico en la relación compleja y dinámica entre las células de cáncer de páncreas y estas células del estroma a través de la regulación de la contratación y la actividad de las células mieloides. De hecho, hemos encontrado que PK2 induce la producción de quimiocinas y receptores implicados en la migración de células mieloides y PKRA7 podría bloquear esta inducción (Figura 3F). Los receptores de quimioquinas, CCR10 y CCR4, conocidos para responder a la quimio-atrayentes CCL27, MCP-1, y CCL22, se han demostrado ser crucial en la inducción de la movilización y el homing de las células mieloides y los leucocitos al sitio del tumor [43]. El receptor de quimioquinas CCR6 y su ligando CCL20 se han implicado en la migración de células dendríticas y parecen ser importantes para mantener un nivel normal de la población de macrófagos desde CCR6
- /- ratones mostraron una disminución del número de células macrófagos [44]. Nuestros estudios mostraron que los tumores pancreáticos son pobremente vascularizado y contienen relativamente pocas células endoteliales en los ratones no tratados y confirmaron que cualquier cambio en la densidad vascular debido a la inhibición de PKR por PKRA7 en los ratones tratados probablemente serían muy pequeños y difíciles de detectar.

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