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PLOS ONE: AKT Inhibidores de promover la muerte celular en el cáncer de cuello uterino a través interrupción de mTOR Signaling y la captación de glucosa

2015/7/13


Extracto

Antecedentes

PI3K /Akt alteraciones están asociadas con respuesta incompleta a la quimiorradioterapia en el cáncer de cuello de útero humano. Este estudio se realizó para detectar si existen mutaciones en la vía PI3K y para evaluar los efectos de los inhibidores de AKT en la captación de glucosa y la viabilidad celular.

Diseño Experimental
análisis
mutacional de ADN a partir de biopsias de tumores de pretratamiento 140 y se realizó 8 líneas celulares de cáncer cervical humano. células C33A (
PIK3CAR88Q
y
PTENR233 *
) fueron tratados con concentraciones crecientes de dos inhibidores alostéricos AKT (SC-66 y MK-2206) con o sin el análogo de la glucosa 2-desoxiglucosa (2 -DG). La viabilidad celular y el estado de activación de la vía AKT /mTOR se determinaron en respuesta al tratamiento. La captación de glucosa se evaluó mediante incubación con
18 F-FDG (FDG). La migración celular se evaluó mediante el ensayo de cero.

Resultados

Activar
PIK3CA gratis (E545K, E542K) y se identificaron inactivación de
PTEN gratis (R233 *) mutaciones en cáncer de cuello uterino humano. AKT efectivamente inhibe SC-66, mTOR y sustratos de mTOR en las células C33A. SC-66 inhibe la captación de glucosa a través de la entrega reducida de Glut1 y Glut4 a la membrana celular. tratamiento SC-66 (1 mg /ml-56%) y MK-2206 (30 mM-49%) disminuyó la viabilidad celular a través de un mecanismo no apoptótica. Disminuciones en la viabilidad celular se mejoraron cuando los inhibidores de AKT se combinaron con 2-DG. El ensayo cero mostró una reducción sustancial en la migración celular tras el tratamiento SC-66.

Conclusiones

El espectro mutacional de la vía PI3K /AKT en el cáncer cervical es complejo. AKT inhibidores bloquean eficazmente mTORC1 /2, disminuyen la absorción de glucosa, glucólisis, y disminuyen la viabilidad celular
in vitro
. Estos resultados sugieren que los inhibidores de AKT pueden mejorar la respuesta a la quimiorradioterapia en el cáncer de cuello de útero

Visto:. Rashmi R, DeSelm C, C Helms, Bowcock A, Rogers BE, Rader J, et al. Inhibidores (2014) AKT promover la muerte celular en el cáncer de cuello uterino a través interrupción de mTOR Signaling y la captación de glucosa. PLoS ONE 9 (4): e92948. doi: 10.1371 /journal.pone.0092948

Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América

Recibido: 22 Agosto, 2013; Aceptado: 27 Febrero 2014; Publicado: 4 Abril 2014

Derechos de Autor © 2014 Rashmi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (NIH de EE.UU. 5K12HD00145910) a Julie K. Schwarz, MD, PhD. CD fue apoyada por la investigación del estudiante de medicina Grant (# RMS113) de la Sociedad Radiológica de América del Norte (Julie K. Schwarz mentor). El Centro de Cáncer Siteman es apoyado por el NCI Cancer Center de Soporte de Grant CA91842#P30. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

a nivel mundial, el cáncer cervical es el tercer tipo de cáncer femenino más común, y ocupa el cuarto lugar en términos de mortalidad [1]. quimiorradioterapia concomitante (irradiación pélvica con la administración simultánea de quimioterapia con cisplatino) es el estándar de cuidado para los pacientes con cáncer de cuello uterino localmente avanzado. Hemos demostrado anteriormente que los resultados de la terapia post-[
18F] fluoro-deoxi-glucosa-positrones La tomografía por emisión (FDG-PET) son predictivos de la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global que los resultados tras quimiorradioterapia [2] - [4 ]. En la actualidad no hay opciones de tratamiento eficaces disponibles para los pacientes cuyos tumores no responden a la quimiorradioterapia tradicional.

Recientemente, hemos identificado PI3K /AKT vía de alteraciones en los tumores de pacientes con una terapia de post-positivo-FDG PET. También se observó una alta expresión de p-AKT en las muestras de biopsia antes del tratamiento, y los pacientes cuyos tumores expresaron altos niveles de p-AKT habían disminuido los resultados de supervivencia y el aumento de la enfermedad metastásica después de la quimiorradiación estándar [5]. Las alteraciones genéticas que conducen a la activación de la vía PI3K /AKT /mTOR se asocian con la resistencia al tratamiento en una variedad de tumores sólidos [6]. Varios inhibidores de PI3K /Akt se han evaluado en ensayos clínicos de mama y otros cánceres con respuestas positivas en pacientes con alteraciones PI3K /Akt [7]. Hay informes que sugieren que los cánceres con
PIK3CA
mutaciones son más sensibles a AKT o PI3K /inhibidores de mTOR [8], [9].

La hipótesis de que los inhibidores de PI3K /AKT mejorarán respuesta a quimiorradioterapia en tumores cervicales con alteraciones de la vía PI3K /AKT. Para la prueba de las mutaciones en la vía PI3K /AKT, se analizaron 140 de pretratamiento biopsias de tumores cervicales y 8 líneas celulares de cáncer cervical humano [10]. Luego seleccionamos la C33A línea celular de cáncer de cuello de útero, que está mutado tanto para
PIK3CA
y
PTEN gratis (
PIK3CA
R88Q,
PTEN
R233 *) y expresa altos niveles de p-AKT al inicio del estudio, para evaluar la respuesta a dos inhibidores alostéricos AKT, SC-66 y MK-2206.

Materiales y Métodos

los pacientes

la población del estudio incluyó a 140 pacientes incluidos de forma prospectiva en los estudios bancarios del tumor en el momento del diagnóstico de cáncer de cuello uterino (marzo de 1998 hasta julio de 2011). Se obtuvo la aprobación de la Oficina de Protección de la Investigación Humana institucional para este estudio, y todos los pacientes firmaron el consentimiento informado. El seguimiento clínico incluyendo la FDG-PET se realizó para cada paciente de acuerdo con las directrices institucionales como se describe anteriormente [3]. En el momento del último seguimiento, 76 pacientes no tenían evidencia de enfermedad, y 8 pacientes estaban vivos con la enfermedad; 7 pacientes habían muerto debido a una enfermedad intercurrente; 2 pacientes habían muerto debido a la toxicidad relacionada con el tratamiento, y 47 pacientes habían muerto a causa de cáncer de cuello uterino. La mediana de seguimiento de los pacientes vivos en el momento del último seguimiento fue de 41 meses (rango de 4 a 161 meses).

El análisis estadístico

La supervivencia y la recurrencia del tumor se midieron a partir de la finalización del tratamiento. El método de Kaplan-Meier (producto-límite) se utilizó para derivar estimaciones de la supervivencia [11]. Las pruebas de la equivalencia de las estimaciones de supervivencia entre los grupos de pacientes se realizaron mediante la prueba de log-rank generalizada de Wilcoxon. Statview versión de software 5.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC) se utilizó para el análisis.

El análisis mutacional mediante MALDI-TOF

biopsias tumorales se seccionaron y revisados ​​por el contenido de las células tumorales como se describe anteriormente [5]. ADN tumoral se preparó usando métodos estándar por el Fondo para el Core Tissue Procurement la Universidad de Washington. Los ensayos para un subconjunto de 32 mutaciones oncogénicas específicas (
AKT1
,
AKT2
,
PIK3CA
y
PTEN
) a partir de [10] fueron rediseñadas en tres multicines de genotipado, utilizando software del diseñador de Ensayo de Sequenom, versión 3.1.2.2. (Sequenom Inc, San Diego, CA). Los multicines fueron diseñados para usar la química IPLEX. El sistema de Sequenom MassARRAY (http://www.sequenom.com) emplea MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption /ionización - tiempo de vuelo) espectrometría de masas para medir diferencias de masa siguientes adiciones de una sola base a los cebadores de extensión. picos espectrales correspondientes a masas esperados para cada cebador extendido se transforman en las llamadas de genotipo de la muestra. Utilizando el protocolo estándar IPLEX, el genotipado de la Universidad de Washington (St. Louis, MO, EE.UU.) procesa la muestra de ADN 15 ng por múltiplex a través del sistema MassARRAY. áreas de los picos que representan adiciones de base normales y mutantes se obtuvieron de espectro de masas de cada muestra. Una mutación se consideró presente en una muestra cuando el pico mutante era responsable del 25% o más de las áreas de los picos combinados, y ausente cuando el área del pico mutante era menor que 25% del total. Lista de mutaciones OncoMap que se probaron en nuestros multicines son OM_00970-AKT1-E17K, OM_00032-AKT2-S302G, OM_00033-AKT2-R371H, OM_00241-PIK3CA-R88Q, OM_00242-PIK3CA-N345K, OM_00243-PIK3CA-C420R, OM_00246A-PIK3CA -E545K, OM_00248-PIK3CA-H701P, OM_00249-PIK3CA-H1047L, OM_00250A-PIK3CA-H1047R, OM_00250B-PIK3CA-H1047R, OM_00251-PIK3CA-H1047Y, OM_01017-PIK3CA-E545A, OM_01018B-PIK3CA-N1068fs*4,OM_0102-PIK3CA-Y1021C,OM_00839-PTEN-R173C,OM_00840-PTEN-R173H,OM_00841-PTEN-R233*,OM_00842-PTEN-R335*, OM_01038-PTEN-K267fs * 9 OM_01039-PTEN-V317fs * 3, OM_01069-PTEN-K6fs * 4.

Cultivo celular y reactivos

líneas celulares de cáncer de cuello uterino se mantuvieron en medio IMDM (Vida Technologies, CA) con calor al 10% de FBS inactivado y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2. SC-66 se adquirió de Biovision (Milpitas, CA) y MK-2206 de Selleck Químicos (Houston, TX). de glucosa, de la proteasa y el inhibidor de fosfatasa cócteles 2-desoxi fueron adquiridos de Sigma (Saint Louis, MO). Todos los fármacos para el cultivo celular se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). oligos siRNA contra
AKT1
,
AKT2
y
Rictor
fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO).

Western Blot y el aislamiento de membrana

la fosforilación de AKT y las dianas moleculares de AKT y mTOR con o sin (6-10 g /ml) y MK-2206 (0-2,5 M) se determinaron por Western Blot con anticuerpos primarios contra fosforilada y SC-66 formas totales de mTOR, p70s6k, 4E-BP1, S6, GSK3-beta, FOXO pAKT
Thr308, pAKT
Thr450 y pAKT
Ser473 (1:1000; Cell Signaling Technology, MA), formas totales de AKT, mTOR y 4-EBP1 (1:1000, Cell Signaling Technology, MA), formas totales de p70s6k y β-actina HRP de Santa Cruz Biotechnology, CA y formas totales de PRAS40 y FOXO de Millipore (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, CA). ß-actina se utilizó como control interno. Las transferencias se probaron con conjugado con HRP anti-conejo (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) o anti-ratón policlonal IgG anticuerpos secundarios (Santa Cruz Biotechnology, CA) durante 1 h a TA. Para la detección Pierce West Dura sustrato (Pierce Biotechnology) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante y expuestos en la película de rayos X.

La viabilidad celular y la tinción con anexina

En las células C33A ensayo de viabilidad celular fueron tratados con los inhibidores alostéricos AKT SC-66 (0.0001 g /ml-5 g /ml) y MK-2206 (125 nM-30 mM) con o sin el análogo de la glucosa 2-desoxiglucosa (2-DG) (5-20 mM) mediante ajuste de la dosis y cursos de tiempo. Para los experimentos de siRNA, células C33A se transfectaron de forma transitoria y se evaluaron para la expresión de proteína después de 48 horas. La viabilidad celular se ensayó usando Alamar Blue de Life Technologies, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Anexina /7-AAD tinción se realizó 24 h después del tratamiento, utilizando un kit de BD, Biociencias siguiendo las instrucciones del fabricante, y las células se analizaron por citometría de flujo.

ensayos de captación de FDG

La FDG ensayo de absorción se realizó como se describe anteriormente [5]. Brevemente, las células se sembraron y tratados previamente con el bloque (citocalasina B) durante 30 min seguido de inhibidores de AKT por 30 minutos adicionales. Después de esto, se añadió
18 FDG en glucosa medio libre durante 1 h. Las células se lavaron, se recogieron y se contaron en un contador gamma.

inmunofluorescencia

En un portaobjetos de cámara (8 pocillos) 25.000 células se sembraron y se trataron con SC-66 1 mg /ml para 3 h y se fija usando 4% de p-formaldehído de Microscopía Electrónica de Ciencias (Hatfield, PA) durante 10 minutos. Los portaobjetos se bloquearon en 5% de suero normal de cabra (Jackson ImmumoResearch, West Grove, PA) durante 1 h, seguido de extensos lavados con PBS. A continuación, los anticuerpos primarios y Glut1 Glut4 (Abcam, Cambridge, MA) se añadieron seguido por anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Las diapositivas fueron finalmente montadas usando Prolong Oro anti-fade (Life Technologies, Inc. Grand Island, NY).

ensayos metabólicos

ensayo de lactato se realizó utilizando un kit de (Sigma, Saint Louis , MO) según las instrucciones del fabricante usando los medios de cultivo recogidos después de la desproteinización usando 10 filtros de columna de centrifugado kDa. ensayos de ATP y NADP /NADPH se realizaron utilizando los kits disponibles en el mercado fluorométricos de (Abcam, Cambridge, MA) según las instrucciones del fabricante, utilizando lisados ​​de células.

Cicatrización de heridas ensayo

Un millón de células C33A se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm y se cultivaron hasta confluencia. Dos rayas paralelas se realizaron con una punta de pipeta 200 l por placa y la anchura cero se midió que era la línea de base [12]. La anchura de la herida se midió en un mínimo de seis puntos diferentes para cada herida. se añadieron SC-66 (1 y 2,5 g /ml) y MK-2206 (2,5 y 5 mM) durante 24 horas. La anchura de los arañazos se midió utilizando software Qcapture Pro y ver utilizando OLYMPUS 1 × 70 microscopio. la curación de la herida por ciento se calculó dividiendo la anchura de cero después de la adición del fármaco por el ancho de control menos 100%. Los resultados presentados son la media ± SEM.

Resultados
vía
PI3K /Akt /mTOR es activo en líneas celulares de cáncer de cuello uterino

Un panel de líneas celulares de cáncer cervical humano se ensayó para el patrón de expresión y el estado de activación de las moléculas de la vía PI3K /Akt /mTOR. Los lisados ​​celulares se prepararon sin ningún tratamiento y se realizaron transferencias de Western de línea de base. P70s6k, el marcador de la activación de la vía mTOR, se fosforiló en la mayoría de las líneas de células HeLa a excepción de, C41 y C33A donde se encontró a ser fosforilados débilmente (fig. 1A). La fosforilación de 4E-BP1 y S6 se encontraron a ser baja en la mayoría de las líneas celulares estudiadas. En SiHa y SW756, los niveles de expresión de las formas no fosforiladas de mTOR, p70s6k, 4E-BP1 y S6 eran bajos en comparación con las otras líneas celulares. Por otra parte, se encontró que la fosforilación de mTOR ser similar en las líneas celulares (Fig. 1A). Se determinó la expresión de línea de base de las formas fosforiladas de AKT como Ser473, Thr308 y Thr450. C33A expresa todas las tres formas de p-AKT. Para determinar el estado de los reguladores aguas arriba de AKT tales como PI3K y PTEN, la línea de base p-PI3K y los niveles de p-PTEN se examinaron. PTEN nivel fosforilada fue similar en las líneas celulares, excepto por C33A donde el nivel de banda total de PTEN fue mínima. PI3K se activó en la mayoría de las líneas celulares estudiadas aquí. SiHa exhibió muy baja activación de PI3K (fig. 1B). Todos estos resultados sugieren que las líneas celulares de cáncer cervical han activado vía mTOR en condiciones basales y variaciones de ancho existido en los niveles de p-AKT.

(A-B) componentes de la vía de mTOR y formas fosforiladas de AKT se ensayaron usando disponible comercialmente anticuerpos en ocho lisados ​​celulares de cáncer de cuello uterino preparan sin ningún tratamiento. (C)
PIK3CA
,
AKT
, y
PTEN
estado mutacional del gen de 8 líneas celulares de cáncer cervical humano.

análisis mutacional Sequenom PIK3CA, PTEN y AKT genes en el cáncer de cuello de útero

para la prueba de mutaciones en la vía PI3K /AKT, llevamos a cabo un análisis mutacional Sequenom de mutaciones oncogénicas en genes
PIK3CA
,
PTEN
y
AKT
. No se detectó ninguna
AKT1
o
AKT2
mutaciones en las líneas celulares de cáncer de cuello uterino. C33A albergaba un R88Q
PIK3CA
mutación. R88Q es una mutación activadora que se encuentra en el dominio de la subunidad ABD p110α de la
PIK3CA
gen. Este defecto está asociada con la activación enzimática mejorada de actividad de la proteína AKT y PI3K
in vitro
[13], [14]. Se encontró que la E545K
PIK3CA
mutación estaba presente en las células CaSki (Fig. 1C) ME-180 y. El
PIK3CA mutación E545K
es una mutación activadora en el dominio helicoidal de la subunidad de la proteína PI3K p110α. Esta mutación es conocida para conferir actividad de la quinasa mejorada y para activar constitutivamente AKT [15]. También encontramos un R173C
PTEN
mutación genética en CaSki y un
PTEN
R233 * mutación en células C33A (Fig. 1C). El
PTEN
mutación R173C se asocia con una disminución de la actividad fosfatasa contra PIP
3 [16]. La
PTEN
R233 * mutación en el exón 7 induce un codón de parada prematuro en el gen, lo que explica la ausencia de
PTEN
expresión de proteínas en células C33A [17] (Fig. 1B).

Usando el ensayo de Sequenom, que después se prueba para las mutaciones en
PIK3CA
,
AKT
y
PTEN
genes en 140 biopsias pretratamiento recogidas en nuestro banco de tumores. No se detectó ninguna mutación ensayada en el
AKT
gen en nuestra población de pacientes. Hemos encontrado que los tumores en 7 de cada 140 pacientes albergado un
PIK3CA mutación E545K
y 1 de cada 140 tenían un
PIK3CA
E542K mutación. También se encontró que 1 de tumores albergaba un
PTEN
R233 * mutación. Los pacientes con mutaciones E545K y E542K en
PIK3CA
se encontraron para mostrar mal pronóstico y corta supervivencia libre de enfermedad después de la quimiorradiación estándar (irradiación pélvica y quimioterapia con cisplatino concurrente) (p = 0,05, Fig. 2).

curva de Kaplan-Meier para la supervivencia libre de progresión para los pacientes con cáncer de cuello uterino con PIK3CA tipo salvaje frente a E545K o E542K tumores mutantes (p = .05).

inhibidores de AKT SC-66 y MK-2206 inducen la muerte de células no apoptóticas en células C33A mutante PIK3CA y PTEN

el uso de células C33A como un modelo para el cáncer de PI3K /AKT mutante cervical, se determinó si la supervivencia de células tumorales era dependiente de la señalización de AKT. células C33A se incubaron con dosis crecientes de SC-66 y MK-2206 y se determinó la viabilidad después de 24 y 48 hrs. La viabilidad celular disminuyó a partir de 1 g /ml de SC-66 después de 24 y 48 horas, a 55% y 43%, respectivamente. Se encontró que la viabilidad a 5 mg /ml de SC-66 para ser 15% después de 24 h (Fig. 3A). células C33A también fueron sensibles a otro inhibidor de AKT alostérico, MK-2206. Se encontró viabilidad de las células para disminuir a partir de la concentración de 15 mM (58%) y la disminución de 2% en 48 h (Fig. 3B). Para confirmar que afecta sobre la viabilidad celular se debieron a la inhibición de AKT en lugar de efectos de destino fuera de SC-66 y MK-2206, se realizaron experimentos de siRNA. Como se muestra en la Figura 3C, la viabilidad celular C33A disminuyó en un grado similar cuando las células fueron transfectadas con siRNAs resultantes en desmontables de
AKT1
,
AKT2
, y
Rictor
(Fig . 3D).
células C33A
(a-B) se sembraron en placas de 48 pocillos y se trataron con dosis crecientes de SC-66 (0,0001 a 5 mg /ml) y MK-2206 (1.25-30 mu M ) por triplicado durante 24 y 48 hrs. La viabilidad se midió usando Alamar Blue. Se calculó el porcentaje de viabilidad basado en los controles tratados con vehículo. células C33A (C) se sembraron en placas de 48 pocillos y se transfectaron con oligos contra
AKT1
,
AKT2
y
Rictor
y tratados con SC-66 (1 mg /ml) y MK-2206 (20 M) por triplicado para 24. La viabilidad se midió usando Alamar Blue. Se calculó el porcentaje de viabilidad basado en los controles tratados con vehículo y controlar los controles transfectadas siRNA, p & lt; 0,001 para la comparación de control de siRNA frente siRNA para
AKT1
,
AKT2
y
Rictor
, SC-661 g /ml, MK-2206 20 M. (D) células C33A se sembraron en placas de 48 pocillos y se transfectaron con oligos contra
AKT1
,
AKT2
y
Rictor
y los lisados ​​se prepararon después de 48 h y transferencias Western fueron realizados. (E) células C33A se trataron con SC-66 (2,5 g /ml) y MK-2206 25 M durante 24 h después se tiñeron con Anexina /7-AAD y analizadas por citometría de flujo. El gráfico representa la viabilidad celular%. (F) C33A células fueron tratadas con SC-66 (0,0001 g /ml, 0,1 mg /ml) con o sin 20 mM de 2-DG durante 48 h.

Para explorar el mecanismo a través del cual AKT inhibidores de inducir la muerte celular, se realizó Anexina /7-AAD tinción. Al SC-66 (2,5 g /ml) y MK-2206 (25 mM) de tratamiento había muy pocas células con anexina solamente las manchas y la fracción de células con tanto tinción fue 35% y menos del 20%, respectivamente. 7-AAD única tinción fue cercana al 80% en las células tratadas con MK-2206 (Fig. 3E). Para otros efectos enlace de SC-66 a través de la inhibición de la captación de glucosa, se combinaron SC-66 con 2-desoxi glucosa (2-DG), un inhibidor competitivo de la captación de glucosa. Por 48 hr después del tratamiento con SC-66 (0,01 g /ml) la viabilidad estaba en 107%, pero con la adición de 2-DG, la viabilidad celular se redujo hasta el 72% p & lt; 0,001 (Fig. 3F). MK-2206 exhibió efectos sinérgicos con 2-DG. Después de 24 horas, la viabilidad de las células tratadas MK-2206 fue del 78%, lo que disminuye hasta el 40% después de la adición de 20 mM de 2-DG (p & lt; 0,001, de datos A en S1 Archivo).

SC-66 y MK-2206 inhibe mTOR /AKT eficazmente en las células C33A

Para explorar los efectos de la inhibición de mTOR en AKT y de los objetivos en las células C33A, se analizó el estado de fosforilación de componentes de la vía mTOR por Western blot y usados p70S6K como un marcador para la activación de mTOR [18]. SC-66 inhibió completamente la fosforilación p70S6K por 3 horas (Fig. 4A). MK-2206 inhibe la activación p70S6K pero había una ligera reactivación por 4 h. MK-2206 inhibió componentes de la vía de mTOR, tales como mTOR, 4E-BP1 y S6 eficazmente por 2 horas. inhibición de MK-2206 de vía mTOR parece ser transitoria como p70s6k seguía activo después de 4 h (D datos en S3 Archivo). SC-66 y MK-2206 inhibió de manera efectiva todas las tres formas fosforiladas de AKT (Thr308, Thr450 y Ser 473) de una manera dependiente de la dosis lo que sugiere que MK-2206 actúa principalmente a través mTORC1 (Fig. 4C y datos F en S3 File). Esto es apoyado por la observación de que SC-66 fue más eficaz en la inhibición de sustratos AKT como PRAS 40, GSK3-β y FoxO1 (Fig. 4B) en comparación con MK-2206, en particular PRAS40 que está en mTORC1 complejo [19] (Data E en S3 File). P70s6k se fosforiló después de 4 h de tratamiento MK-2206 que sugiere la inhibición de mTOR fue transitoria (datos suplementarios).

(A-C) C33A células fueron tratadas con concentraciones crecientes de SC-66 (6-10 mg /ml) durante 3 h y los lisados ​​se prepararon para la transferencia de western.

la rapamicina, un inhibidor de mTOR, alivia la inhibición de retroalimentación e induce la fosforilación de AKT Ser473 de una manera dependiente de mTORC2 conducido a una mayor activación de AKT [20 ]. Para la prueba de este efecto utilizando nuestros inhibidores se realizó una incubación más larga de las células con SC-66 de 18 a 24 h. Se encontró que p70S6K, el marcador de la activación de mTOR, se redujo aún después del tratamiento 18 y 24 hrs. tratamiento SC-66 disminución de la activación de sustratos Akt, Thr308 y Thr450 by18 y 24 horas. niveles Thr308 han sufrido un aumento en comparación con la muestra 3 h, pero aún se muestra una tendencia decreciente en 18-24 horas (datos no mostrados). Todos estos resultados sugieren que SC-66 inhibió eficazmente tanto mTORC1 /2 y AKT. Se encontró MK-2206 que actúa principalmente a través de la vía mTORC1 con una ligera reactivación de la vía después de 4 horas.

SC-66 inhibe la captación de glucosa y la translocación de la membrana de los transportadores de glucosa

La captación de glucosa se ensayó mediante la realización de
in vitro
FDG ensayos de absorción en en presencia y ausencia del SC-66 (35 mg /ml). Se encontró que el 66 SC-glucosa inhibe la captación significativamente como se evidencia por los recuentos reducidos por minuto (Fig. 5A). Además se determinó el efecto de SC-66 en Glut1 y Glut4 translocación a la membrana. Para esto un fraccionamiento citoplasma membrana se llevó a cabo después de tratamiento de las células con SC-66 (5 mg /ml) durante 24 h. SC-66 inhibe Glut1 y Glut4 translocación desde el citoplasma a la membrana como se determina por transferencia de Western (Fig. 5C). Hemos confirmado esto con la tinción de inmunofluorescencia (Fig. 5D). Todos estos resultados sugieren que la inhibición de mTOR por SC-66 resultó en una disminución captación de glucosa a través de la retención de Glut1 y Glut4 en el citoplasma.

) células C33A A fueron tratados con SC-66 (35 g /ml) o bloque (citocalasina B) durante 30 minutos antes de la incubación con
18F-fluorodeoxiglucosa como se describe en la sección de métodos. El gráfico representa recuentos por valores de minutos, p & lt; 0,01 para la comparación de FDG sola (sólo las células) frente a FDG + SC-66. B) Las células C33A se trataron con SC-66 (0-5 mg /ml) durante 3 h y 24 y los niveles de GLUT1 se analizaron por Western blot. ) las células C33A C fueron tratados con SC-66 (0, 1 y 5 g /ml) durante 24 h. Membrana y fracciones de citosol se prepararon utilizando un kit (MemPER) de Peirce Biotecnología. Estas fracciones subcelulares se mezclaron con tampón de muestra y se incubaron a 65 ° C durante 20 minutos antes de la carga en los geles para transferencia de western para Glut1 y Glut4. D) La inmunofluorescencia se realizó en células C33A después de tratarlos con SC-66 (1 mg /ml) durante 3 horas en una cámara de diapositivas.

inhibidor de AKT SC-66 inhibe la glucólisis

Para determinar si la inhibición de AKT resultó en la glucólisis reducida, que mide los niveles de ATP y NADPH después del tratamiento SC-66. Se encontró que los niveles de ATP se redujeron significativamente después del tratamiento SC-66, y se aumentaron los niveles de NADPH, lo que sugiere que las vías alternativas del metabolismo de la glucosa, tales como la derivación de las pentosas fosfato, pueden ser más activa en células C33A cuando la señalización de AKT se suprime (Fig. 6A y 6B). Los niveles totales de lactato también se redujeron en células C33A después del tratamiento con SC-66 (Fig. 6C y 6D). Todos estos resultados indican que la inhibición de AKT suprime la glucólisis en las células C33A. Para evaluar los efectos aguas abajo sobre el metabolismo de las células tumorales, que supervisó el estado de activación de un sustrato de AKT, ATP-citrato liasa (ACL) después del tratamiento SC-66. células C33A se incubaron con dosis crecientes de SC-66 y transferencias de Western se realizaron. células C33A SC-66 fosforilación ACL inhibida por 5 y 24 horas, lo que sugiere que la inhibición de AKT puede influir también otros aspectos del metabolismo de las células tumorales, incluyendo la síntesis de lípidos (Fig. 6E).

(A-B) eran sembradas en T 25 cm
se determinaron 2 frascos de cultivo de tejidos, tratados con niveles intracelulares NADPH SC-66 y y ATP. El gráfico representa los niveles de ATP y NADPH mu M basado en la curva, p & lt estándar; 0,01 para la comparación de control versus SC-66 10 mg /ml 1 y 3 h y p & lt; 0,001 para el control frente a 30 mg /ml para los niveles de ATP; p & lt; 0,01 para la comparación de control versus SC-66 5 mg /ml 3 h y p & lt; 0,01 frente a control de 10 mg /ml 3 h para los niveles de NADPH. células C33A (C-D) se sembraron en T 25 cm
2 frascos de cultivo de tejidos, se trató con SC-66 y los niveles de lactato excretados se midieron en concentraciones nM usando una curva, p & lt estándar; 0,001 para la comparación de control versus SC -66 5 and10 g /ml. (E) células C33A se trataron con concentraciones crecientes de SC-66 (0-5 mg /ml) durante 5 h y 24 h y los lisados ​​se prepararon para transferencia de western.

SC-66 reduce la migración de células C33A in vitro

Hay informes que muestran el papel de AKT en el proceso metastásico incluyendo la migración celular y la invasión [21]. Para estudiar los efectos de SC-66 y MK-2206 en la migración de células se trataron las células con 1 mg /ml SC-66 y 2,5 M MK-2206 durante 24 h y se realizó un ensayo de cero. Se encontró que el SC-66 inhibe la migración de células de alrededor del 50% comparado con el control, mientras que el MK-2206 no tuvo ningún efecto (Fig. 7).

C33A células fueron tratadas con A) SC-66 (1 y 2,5 g /ml) y B) MK-2206 (2,5 y 5 mM) durante 24 h. sanación por ciento de la herida se calculó como se describe en la sección de métodos, p & lt; 0,0001 para la comparación de control frente a 1 ug SC-66 y p & lt; 0,0001 para el control frente al 2,5 ug SC-66

Discusión

en este estudio, se realizó un análisis mutacional de 140 biopsias tumorales pretratamiento y 8 líneas celulares de cáncer cervical humano para la detección de mutaciones en la vía PI3K /AKT. Este es el primer estudio, a nuestro conocimiento, para analizar exhaustivamente mutaciones en la vía PI3K /AKT en el cáncer de cuello de útero humano. Se identificaron múltiples mutaciones en la vía PI3K /AKT en muestras de cáncer cervical humano, incluyendo la activación de mutaciones en
PIK3CA gratis (E545K, E542K) y la inactivación de las mutaciones en el
PTEN gratis (R233 *). El análisis mutacional de líneas celulares de cáncer cervical reveló defectos adicionales. C33A células tienen tanto un R233 *
PTEN
mutación y una R88Q
PIK3CA
mutación [22].

El presente estudio también fue diseñado para probar la hipótesis de que las células de cáncer de cuello uterino con la activación de AKT alterado sería sensible a los inhibidores de AKT. SC-66 y MK-2206 indujo eficazmente la muerte celular en células C33A a través de un mecanismo no apoptótica. Se encontró SC-66 que es un potente inhibidor de mTORC1 /2. SC-66 p70s6k eficazmente inhibida y sustratos 4E-BP1 mTORC1, además de inhibir la fosforilación de Ser473 y Thr308 de AKT, y la activación de AKT sustratos tales como PRAS40, GSK3-β y FOXO. SC-66 muestra los efectos sinérgicos con 2-DG, y el SC-66 inhibe los eventos más aguas abajo tales como la translocación de transportadores de glucosa a la membrana que produjo una disminución de la captación de glucosa. Además, la inhibición de AKT reduce la glucólisis como se evidencia por la disminución de los niveles de ATP y de lactato, y aumento de la actividad de las rutas metabólicas alternativas que resultan en un aumento de NADPH celular. Estos resultados sugieren que los inhibidores de AKT disminuyen la viabilidad del cáncer cervical mediante la interferencia con el metabolismo de la glucosa celular. Nuestra hipótesis es que los cánceres cervicales con alteraciones de la vía PI3K /AKT dependen de las altas tasas de captación de glucosa y la glucólisis para la supervivencia. Debe tenerse en cuenta que la activación de Akt por
PTEN
pérdida y /o
PIK3CA
mutaciones que pasar por alto la necesidad de que la activación de los receptores del factor de crecimiento (es decir, IGF-1R) para iniciar la PI3K /Akt /mTOR cascada de señalización. De esta manera, las células de cáncer de cuello uterino son capaces de regular positivamente la importación de glucosa y el metabolismo, incluso en ausencia de las señales externas apropiadas.

Anteriormente se ha demostrado que la inhibición de mTORC2 conduce a una rápida inhibición de la fosforilación de Akt Ser473, que acelera el proceso de desestabilización de Thr308 sitio de fosforilación [23]. De acuerdo con esto, también se observó que SC-66 mediada una reducción concomitante en la fosforilación de Ser473 y Thr308 en células C33A. Un trabajo anterior de los demás sugirió que la desfosforilación de AKT en Thr308 sitio conduce a más profunda inhibición de la función AKT de lo que se desprende de la desfosforilación de AKT en Ser473 sola [23]. Thr308 es un residuo en una tecla T-loop de la proteína AKT y considerado como un mejor indicador de la actividad quinasa AKT. Existen datos discordantes sobre la fosforilación y la actividad quinasa AKT Ser473 [24], [25]. Nuestros resultados muestran que el SC-66 inhibe todas las tres formas fosforiladas de AKT.

Hay informes de que mTORC2 se requiere para el desarrollo de ciertos tipos de cáncer con
PTEN
pérdida [26]. células C33A son
PTEN
defectuoso, y se encontró que SC-66 es un inhibidor potente mTORC2. El
PTEN
R233 * mutación encontrada en las células C33A puede conducir a una mayor acumulación intracelular de PIP
3 que resulta en la señalización de PI3K mejorada y mediada por el PDK-1 fosforilación de AKT Thr308 [25], [27], [ ,,,0],28]. Especulamos que SC-66 ejerce su efecto inhibidor sobre la fosforilación de AKT Thr308 indirectamente al actuar como un inhibidor de PDK-1. SC-66 podría no ser tan eficaz como un inhibidor de PDK-1, ya que es de mTOR y AKT, y esto explica los niveles ligeramente más altos Thr308 observados después de incubación más largo. Por otra parte, se observó que el SC-66 es un inductor potente de la muerte celular por 24 h, por tanto, la reactivación de AKT no puede ser un problema
in vivo
.

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