Extracto
Antecedentes
epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) a base de enumeración de tumorales circulantes células (CTC) tiene valor pronóstico en pacientes con tumores sólidos, como el de mama avanzado, el colon y el cáncer de próstata. Sin embargo, la mala sensibilidad se ha informado para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Para abordar este problema, se desarrolló un sistema de matriz de microcavidad (MCA) integrado con un dispositivo miniaturizado para el aislamiento CTC sin depender de expresión EpCAM. Aquí, se presenta los resultados de un estudio clínico sobre CTC de pacientes con cáncer de pulmón avanzado en el que comparó el sistema de MCA con el sistema CellSearch, que emplea el método basado en EpCAM convencional.
Métodos
muestras de sangre periférica apareadas se obtuvieron de 43 pacientes con cáncer de pulmón metastásico enumerar CTC utilizando el sistema de CellSearch de acuerdo con el protocolo del fabricante y el sistema de MCA por immunolabeling y análisis cytomorphological. La presencia de las CTC se evaluó a ciegas y de forma independiente por ambos sistemas.
Resultados
se detectaron
CTC en 17 de los 22 pacientes con CPNM que utilizan el sistema MCA frente a 7 de los 22 pacientes que utilizan el sistema CellSearch. Por otro lado, las CTC se detectó en 20 de 21 pacientes de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) utilizando el sistema de MCA frente a 12 de los 21 pacientes que utilizan el sistema CellSearch. Un número significativamente mayor CTC en pacientes con CPNM fueron detectados por el sistema de MCA (mediana 13, rango de 0-291 células /7,5 ml) que por el sistema CellSearch (mediana 0, rango de 0-37 células /7,5 ml) que demuestran la superioridad estadística (p = 0,0015 ). no se alcanzó significación estadística en el CPCP, aunque se observó la tendencia a favor del sistema de MCA sobre el sistema CellSearch (p = 0,2888). El sistema de CRM también grupos aislados de CTC de pacientes que habían sido identificados como CTC negativa usando el sistema CellSearch.
Conclusiones
El sistema de MCA tiene un potencial para aislar significativamente más CTC CTC y los racimos de anticipación pacientes con cáncer de pulmón en comparación con el sistema CellSearch
Visto: M. Hosokawa, Kenmotsu H, Koh Y, Yoshino T, T Yoshikawa, Naito T, et al. Aislamiento de células tumorales circulantes en pacientes con cáncer de pulmón El uso de un sistema microcavity Array (2013) Tamaño-base. PLoS ONE 8 (6): e67466. doi: 10.1371 /journal.pone.0067466
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 18 Enero, 2013; Aceptado: 17-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Hosokawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa regional Innovation Cluster y una subvención-en-Ayudas a la Investigación de becas para jóvenes científicos (11J11150) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. MH, TYoshino, HKanbara y TM han solicitado patentes relacionadas con el sistema CRM . HKanbara se emplea por Hitachi Chemical Co., Ltd. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los países más industrializados. cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) representa aproximadamente el 15% de los casos de cáncer de pulmón y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que incluye el adenocarcinoma (ADC) y el carcinoma de células escamosas (SCC), representa el 85% de los casos de cáncer de pulmón . Recientemente se ha demostrado que la identificación de pacientes de NSCLC mediante la detección de aberraciones genéticas, específicamente
EGFR
mutaciones -activating y la
EML4-ALK
gen de fusión, permite una mejor predicción de la respuesta a la tirosina EGFR inhibidores de la quinasa y los inhibidores de ALK, respectivamente [1], [2]. A pesar de los avances en la prevención y el tratamiento, los pacientes con CPNM a menudo se diagnostica en una etapa avanzada y tienen un mal pronóstico debido a la tendencia de la enfermedad hacia la metástasis distante, la primera causa de mortalidad entre los pacientes con CPNM. se definen caracteriza por un crecimiento agresivo del tumor y a menudo se presenta con metástasis en los ganglios regionales y órganos distantes, SCLC es inicialmente muy sensible a la quimioterapia, pero tiende a adquirir la quimiorresistencia, que conduce a la recaída inevitable
.
Las células tumorales circulantes (CTC) como células tumorales circulantes en la sangre periférica de pacientes con cáncer metastásico. Cuando se mide usando la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA): aprobado sistema de CellSearch (Veridex, Raritan, NJ, EE.UU.), el número de CTC en sangre periférica se puede utilizar para predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer de mama metastásico [3], cáncer colorrectal [4], cáncer de próstata [5], NSCLC [6], y SCLC [7]. El sistema CellSearch enriquece CTC utilizando perlas magnéticas recubiertas con un marcador de células epiteliales anticuerpo monoclonal de segmentación, como la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) [8], [9]. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la presencia de EpCAM en células tumorales varía con el tipo de tumor [10], [11]. La expresión de marcadores de células epiteliales, incluyendo EpCAM, es downregulated para aumentar la capacidad de invasión y el potencial metastásico de transición epitelio-mesenquimal (EMT) [12] - [16]. Se ha sugerido que la baja prevalencia de CTC detectado en pacientes con NSCLC avanzado utilizando el sistema CellSearch puede ser debido a la pérdida de expresión EpCAM [17], lo que indica que los métodos de aislamiento de CTC basado en EpCAM no pueden lograr la recuperación estable y reproducible CTC de todo tipos de tumores.
Otros métodos de aislamiento de CTC se basan principalmente en las diferencias en el tamaño y la capacidad de deformación entre CTC y las células hematológicas. Como las células tumorales (& gt; 8 M) son más grandes que los leucocitos [18] - [21], el aislamiento por el tamaño de las células tumorales epiteliales (ISET) se puede lograr utilizando filtración para separar las células individuales. ISET usando un filtro de policarbonato, un método barato y fácil de usar de enriquecer CTC, permite la recuperación y la detección de CTC epitelial-marcador negativo sobre la base de tamaño dependiente de aislamiento CTC. En pruebas clínicas, se ha encontrado el uso de un sistema basado en ISET para lograr una mayor sensibilidad de detección de CTC en pacientes con cáncer de pulmón metastásico en comparación con el uso del sistema CellSearch [22] - [24].
Recientemente, microfabricado dispositivos para la separación basada en el tamaño de las células tumorales han sido ampliamente desarrollado para permitir el enriquecimiento preciso y eficiente de los CTC de la sangre entera [25] - [28]. Estos dispositivos incluyen un sistema de matriz de microcavity miniaturizado (MCA) que hemos desarrollado para el atrapamiento altamente eficiente de células individuales mediante filtración en base a las diferencias en los tamaños de las células [29], [30]. En un estudio anterior, hemos examinado la aplicación de nuestro sistema de MCA a la detección de células tumorales de púas de la sangre entera humana no procesada sobre la base de diferencias en el tamaño y la capacidad de deformación entre las células tumorales y otras células de la sangre [31]. Usando nuestro dispositivo, hemos sido capaces de atrapar las células tumorales en arrays microcavidad reducción de tamaño y de geometría controlada compuestas de 10.000 aberturas mediante la aplicación de presión negativa, permitiendo que las células atrapadas a ser fácilmente enumeran y se analizaron mediante imágenes microscópicas de las áreas especificadas. Además, hemos encontrado que el uso del dispositivo miniaturizado permitido para la introducción de una serie de reactivos para la detección de células tumorales a través de la estructura de microfluidos. Nuestros resultados indican que nuestro sistema es un sistema simple y preciso para la detección de células tumorales dentro de la sangre entera. Para confirmar y construir sobre nuestros resultados anteriores, se comparó la capacidad y eficiencia de nuestro nuevo sistema de CRM y el sistema CellSearch actual estándar de oro en la realización de la detección y enumeración de CTC en muestras de sangre entera tomadas de una cohorte de pacientes con CPNM y CEP.
Materiales y Métodos
Diseño del estudio y Declaración de Ética
Este estudio prospectivo se realizó para evaluar CTC enumeración utilizando el sistema CellSearch y el sistema CRM en pacientes con cáncer de pulmón metastásico en un experimento ciego (UMIN registro de ensayos clínicos, el número UMIN000005189). La presencia de las CTC se evaluó individualmente de acuerdo con sus criterios antes de conocer ningún resultado de la otra. Los criterios de inclusión fueron diagnóstico de cáncer de pulmón patológicamente probada con lesiones radiológicamente evidentes metastásicos, es decir, histológicamente o citológicamente CPNM metastásico confirmado o SCLC, y la inscripción en el Centro de Cáncer de Shizuoka. Las juntas de revisión institucional del Centro de Cáncer de Shizuoka aprobaron el protocolo de estudio y todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito. De cada uno de los 43 pacientes que fueron incluidos, entre los cuales 22 habían sido diagnosticados con NSCLC y 21 con SCLC, 10-15 ml de sangre se recogió en tubos con EDTA para CTC enumeración por el sistema de MCA en nuestro laboratorio (Centro de Cáncer de Shizuoka, Shizuoka , Japón) y 20 ml se recogieron en tubos de recogida CellSave para CTC enumeración por el sistema CellSearch en el laboratorio de SRL Inc. (Tokio, Japón).
Cultivo de células y Etiquetado
HCC827, NCI-H358, NCI-H441, DMS79, NCI-H69, y NCI-H82 líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection sin más pruebas o autenticación. A549 (Riken bio-Center, Tsukuba, Japón) y PC-14 [32] fueron amablemente proporcionados por el doctor Fumiaki Koizumi (Centro Nacional del Cáncer, Tokio, Japón). El A549, las líneas celulares HCC827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14, DMS79, NCI-H69, y NCI-H82 NSCLC y SCLC se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, Irvine, Reino Unido), 10% (v) de suero v /bovino fetal (FBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU.), y 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (Invitrogen Corp.) durante 3-4 días a 37 ° C con 5% de CO
2 suplementación. Inmediatamente antes de cada experimento, se tripsinizaron las células cultivadas hasta la confluencia y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Como la medición del tamaño de las células tumorales, la distribución de tamaño de las células se determinó utilizando el contador CASY® celular + Sistema Analizador Modelo TTC (Schärfe System GmbH, Reutlingen, Alemania). Para evaluar el rendimiento del dispositivo, las líneas de células tumorales se marcaron con rojo CellTracker CMTPX (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.), con un etiquetado logrado mediante la incubación de las células con un tinte de seguimiento (5 M) durante 30 minutos. Después de que las células habían sido sedimentaron por centrifugación (200 g durante 5 min), se decantó el sobrenadante. Después, las células se lavaron dos veces con PBS para eliminar el exceso de tinte, antes de ser resuspendido en PBS que contenía EDTA 2 mM y 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA).
La fabricación del sistema MCA
La sistema de MCA se fabricó de la misma manera como se informó anteriormente [29], [31]. Para la enumeración CTC con la observación microscopio de fluorescencia, se utilizó un MCA que había sido fabricado por electroformación de níquel. Para CTC análisis morfológico por tinción de Giemsa, se utilizó un MCA transparente que había sido fabricado por la irradiación con láser de poli (tereftalato de etileno) (PET). Cada uno de los 10.000 cavidades dispuestas en cada matriz de 100 × 100 fue fabricado para tener un diámetro de 8-9 micras, con la superficie superior y para ser 60 micras distante de la microcavidad adyacente. Poli (dimetilsiloxano) estructuras (PDMS) se fabricaron y luego integrado con el MCA tal que el sustrato superior consistía en una microcámara, una entrada de la muestra, y una salida, mientras que el sustrato inferior por debajo de la MCA contenía una línea de vacío para producir presión negativa, permitiendo atrapamiento celular. El dispositivo de aislamiento de CTC fue construido por el montaje de la MCA, mientras que las capas superior e inferior de PDMS se construyeron utilizando espaciadores cintas (Figura 1a). La entrada de muestra se conecta a un depósito, mientras que el microcanal de vacío se conecta a una bomba peristáltica.
(a) Diagrama esquemático de la estructura del sistema de MCA. (B) Imagen de microscopia electrónica de barrido de una línea de células tumorales cultivadas atrapado en el sistema CRM. (C-f) Las células aisladas de pacientes SCLC sangre teñidas con Hoechst 33342 (c) y anticuerpos marcados con fluorescencia que se dirigen a la citoqueratina (d) y CD45 (e). La fusión de las imágenes (f) permitió la identificación de CTC y células hematológicas. Barra de escala = 60 micras.
CTC enumeración que utilizan los MCA Sistema
muestras de sangre humana se recogieron en un tubo de recogida con EDTA para prevenir la coagulación y utilizados dentro de 2 h. El volumen medio de sangre analizada fue de 4,0 ml por muestra (rango, 3,0-7,5 ml). Todo enumeración CTC usando el sistema de MCA se realizó sin conocimiento del estado clínico del paciente en el laboratorio del Centro de Cáncer del Instituto de Investigación Shizuoka. Después de la introducción de muestras de sangre en el depósito, la presión negativa se aplicó a una suspensión de células usando una bomba peristáltica conectada a una línea de vacío, permitiendo que la muestra se pasó a través de las microcavidades en un caudal de 200 l /min. Para eliminar cualquier resto de células de la sangre en la matriz, PBS que contenía EDTA 2 mM y 0,5% de BSA (1 ml) se introdujo en el depósito y pasado a través de las microcavidades en un caudal de 200 l /min durante 5 min.
para teñir los CTC con anticuerpo anti-pancytokeratin, las células se fijaron atrapados por el flujo de 400 l de 1% de paraformaldehído (PFA) en PBS a través de la MCA a un caudal de 20 l /min durante 20 min. Después de lavar con 100 l de PBS, las células fueron tratadas con 300 l de 0,2% de Triton X-100 en PBS a un caudal de 20 l /min durante 15 min. Después de la permeabilización, las células se trataron con 3% de BSA en PBS a un caudal de 20 l /min durante 30 min. Para identificar CTC y leucocitos, 600 l de solución de células de tinción que contiene 1 mg /ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes); un cóctel de anticuerpos anti-pancytokeratin (Alexa488-AE1 /AE3 (1:100 dilución; eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) y FITC-CK3-6H5 (1:60 dilución; Miltenyi Biotec, Auburn, California CA, EE.UU.); y marcado con PE anticuerpo anti-CD45 (1:120 dilución; BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) se hizo fluir a través de las microcavidades a un caudal de 20 l /min durante 30 min Finalmente, la matriz se lavó con 400. . l de PBS que contiene 2 mM de EDTA y 0,5% de BSA para eliminar el exceso de tinte Después de la recuperación de las células tumorales, se obtuvo una imagen de toda la zona de conjunto de células usando un microscopio de fluorescencia (BX61; Olympus Corporation, Tokio, Japón) integrado con una lente de 10 × objetivo y una etapa motorizada operado por ordenador; WU, NIBA, y conjuntos de filtros WIG; una cámara digital enfriada (DP-70; Olympus Corporation);. y software de adquisición de Lumina Vision (Mitani Corporation, Tokio, Japón)
En los ensayos clínicos, una imagen completa de la zona de conjunto de células se había obtenido utilizando un microscopio de fluorescencia (Axio Imager Z1; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) integrado con una lente de objetivo 10 × o 20 × y en ordenador operado platina motorizada; WU, FITC y Texas Red conjuntos de filtros; una cámara digital (AxioCam HRc; Carl Zeiss); y software de adquisición de AxioVision (Carl Zeiss). Posteriormente, el análisis de imágenes se había realizado y objetos que cumplieran con los criterios predeterminados se habían contado. Las intensidades de fluorescencia y las características morfométricas, tales como tamaño de la celda, forma, y tamaño nuclear, se consideraron cuando se realiza la identificación CTC y la exclusión de células no tumorales, con células caracterizadas por una ronda a la morfología ovalada y un núcleo visible (es decir, como Hoechst-33342 positivo), que fueron positivas para citoqueratina y negativas para CD45 identificado como CTC. CTC aislado en el MCA transparente también se tiñeron utilizando un método de tinción de May-Grünwald-Giemsa (MGG) que consiste en la fijación con PFA al 4%, sin diluir la mancha de May-Grünwald durante 2 min, colorante May-Grünwald diluido al 50% en PBS durante 1 min y tinción de Giemsa durante 18 minutos, seguido de lavado con PBS durante 1 min.
CTC enumeración que utilizan el sistema CellSearch
enteros muestras de sangre se mantuvieron a temperatura ambiente, durante la noche enviado al laboratorio de SRL Inc., y se procesa dentro de las 96 h de la colección. Todas las evaluaciones de CTC se realizaron sin conocimiento del estado clínico del paciente en el laboratorio y los resultados se informaron cuantitativamente como el número de CTC /7,5 ml de sangre. CTC se definieron como células intactas EpCAM aislados que muestran una tinción positiva para citoqueratina y tinción negativa para CD45. De acuerdo con las evaluaciones anteriores del sistema CellSearch [8], un paciente se consideró positivo si CTC ≥2 CTC /7,5 ml de sangre fueron detectados en la muestra del paciente.
Resultados
CTC Aislamiento y análisis de imágenes usando el Sistema de MCA
el aislamiento y la tinción de las células tumorales de la sangre entera se completó dentro de 120 a 180 min, y exploración de la imagen de la MCA se realizó en 3 longitudes de onda de fluorescencia utilizando un 10 × 20 × o lente objetivo y una etapa motorizada. La figura 1b-f muestra la microscopía de barrido electroscopio (SEM) y las imágenes de fluorescencia de las células teñidas que fueron recuperados en el MCA. Como se puede observar, las células solitarias y grupos de células fueron atrapados de forma individual y retenida en los microcavidades que podrían enumerarse fácilmente. células recuperadas que tenían una ronda a la morfología ovalada y un núcleo visible (es decir, eran Hoechst 33342 positiva) y fueron positivos para pancytokeratin y negativas para CD45 fueron identificadas como células tumorales, mientras que las células CD45-positivas fueron identificadas como contaminación de las células hematológicas normales. Las imágenes revelan la existencia de un inmunofenotipo distinta de las células tumorales positivas al marcador de células epiteliales. Aunque un número de leucocitos fueron retenidas en la matriz, la enumeración de las células del tumor fue relativamente fácil porque las células individuales habían quedado atrapados en las microcavidades precisamente alineados.
sensibilidad del sistema de detección de CTC en MCA de líneas celulares de cáncer de pulmón
En nuestro estudio anterior, el número de células de la línea celular de cáncer de pulmón NCI-H358 variable se clavó en la sangre, y el aislamiento de las células tumorales se evaluó usando nuestro sistema de MCA [31]. La eficiencia de detección calculado fue constante y más de 90% cuando 10-100 células tumorales estaban presentes por mililitro de sangre. En este estudio, con el fin de evaluar la eficacia de la recuperación de varias líneas celulares de cáncer de pulmón utilizando el sistema de MCA, 100 células de cada una de las líneas celulares de cáncer de 8 de pulmón (A549, HCC-827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14 , DMS-72, NCI-H69, H82 y NCI-) fueron añadidos en las muestras de sangre de donantes sanos y luego procesados por el ensayo de MCA. La Tabla 1 muestra la eficiencia de recuperación promedio y el diámetro típico de las líneas celulares. Como se puede observar, se obtuvo una alta tasa de recuperación, independientemente del tipo de tumor, que van desde 68% a 100% en los experimentos de pico-a línea celular. La mayoría de las células recuperadas eran viables y capaces de proliferar incluso después de someterse al proceso de aislamiento, lo que sugiere la posibilidad de un mayor análisis biológica y molecular de los CTC.
A continuación, con el fin de evaluar la especificidad y la sensibilidad de detección de CTC, las pruebas de sensibilidad se realizaron en muestras artificiales preparados mediante la adición de 1 y 3 las células NCI-H358 cultivadas a las muestras de sangre de donantes sanos, como se informó anteriormente por Vona et al. [20]. Uno y 3 células NCI-H358 cultivadas fueron añadidos en alícuotas de 7,5 ml de sangre separadas. Estas muestras de sangre de 7,5 ml fueron procesados con el sistema de MCA en 3 ensayos independientes (Tabla S1). Los resultados demostraron un umbral de sensibilidad para el sistema de MCA cerca de 1 célula tumoral por 7,5 ml de sangre. Además, CTC no eran detectables a partir de 6 sangres de donantes sanos, utilizando el sistema de MCA (Figura 2). Por lo tanto, un paciente se consideró positivo si CTC ≥1 CTC por 7,5 ml de sangre fue detectado por el sistema de CRM.
CTC recuento /7,5 ml de sangre se muestra durante 6 donantes sanos, 22 pacientes con CPNM y 20 pacientes de SCLC .
Además, la eficiencia de recuperación de las células tumorales del sistema de MCA se comparó con la de sistema ISET (Figura S1). En esta comparación, 100 células de la línea celular de NSCLC NCI-H358 se añadieron a las muestras de sangre de donantes sanos y luego procesados por el sistema de CRM y un policarbonato pista grabada de 8 micras de poro de la membrana (Nucleopore; Whatman Ltd., Kent, Reino Unido). Los resultados revelaron la tasa de recuperación mediante el sistema de MCA (100% ± 5%) es significativamente más alto que el uso del sistema ISET (91% ± 2%) (p & lt; 0.05, t-test), lo que indica que el uso de la MCA sistema permite el aislamiento CTC con una eficacia equivalente o superior a la del sistema de ISET.
CTC Enumeración utilizando el sistema de CellSearch y el sistema de MCA
para llevar a cabo la comparación ciega de la sensibilidad de detección de la sistemas CellSearch y MCA, se recogieron muestras de sangre de 22 CPNM metastásico y 21 pacientes con CPCP entre abril de 2011 y febrero de 2012 y se analizaron para determinar el número de pacientes identificados como CTC positivas por cada sistema (Tabla 2). De estas muestras, 1 muestra recogida de 1 paciente SCLC no se evaluó por el sistema de MCA porque un volumen insuficiente de sangre se había recogido para su procesamiento por ambos sistemas. Como resultado, 17 de los 22 (77%) pacientes con CPNM fueron identificados como CTC positiva usando el sistema de MCA pero sólo 7 de los 22 pacientes (32%) de NSCLC usando el sistema de CellSearch (Tabla 3). De estos pacientes, 8 fueron identificados como CTC positiva tanto por el sistema de CellSearch y el sistema de MCA, 1 fue identificado como positivo CTC por sólo el sistema CellSearch, y 9 fueron identificados como CTC positivo por sólo el sistema de MCA. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos por los dos sistemas de juntas, 18 (82%) de los pacientes con CPNM fueron identificados como CTC positivo. El análisis de estos resultados reveló que un número significativamente mayor de pacientes con CPNM fueron identificados como CTC positiva por parte del sistema de MCA (mediana del recuento de células 13, rango de 0-291 células /7,5 ml; Figura 2) que por el sistema CellSearch (recuento medio de células 0 , rango 0-37 células /7,5 ml), lo que demuestra la superioridad estadística del sistema de CRM en la enumeración de CTC (p = 0,0015, prueba de Wilcoxon;. Tabla 3)
en contraste, 20 de los 20 (100%) pacientes de SCLC fueron identificados como CTC positiva usando el sistema de MCA frente a 12 de los pacientes 21 (57%) utilizando el sistema de CellSearch. Se encontró que la mediana del recuento de CTC a ser de 2 células /7,5 ml (rango 0-325) utilizando el sistema de CellSearch y 23 células /7,5 ml (rango 2-2329) utilizando el sistema de MCA (Figura 2). Aunque no alcanzando un nivel de significación estadística, la sensibilidad de detección del sistema de MCA en CTC enumeración mostró una tendencia a ser mayor que la del sistema de CellSearch (p = 0,2888, prueba de Wilcoxon; Tabla 3). Para cada resultado, la concordancia entre los resultados de las pruebas de los sistemas se evaluó mediante parcelas de Bland y Altman [33]. En el análisis de acuerdo con respecto a la enumeración de CTC en pacientes con CPNM, la diferencia media fue de 50,1 (IC del 95%, 11,1-89,1 gama), con los límites de concordancia que van -125,8 a 226,0. El sistema de MCA produjo desproporcionadamente alto CTC cuenta con valores medios más altos en comparación con el sistema CellSearch (Figura S2a). Por el contrario, en el análisis de acuerdo con respecto a CTC enumeración en pacientes con CPCP, la diferencia de medias (IC del 95%, rango de -116,7 a 521,9) 202,6, con los límites de concordancia que van -1.162,0-1.567,2. A diferencia con el análisis de muestras de sangre de NSCLC, se observó ningún sesgo entre los sistemas en el análisis de muestras de SCLC excepto para los sujetos con extremadamente alto título CTC (Figura S2b). El análisis estadístico reveló ninguna asociación entre el sitio de la metástasis y el recuento de CTC de pacientes con cáncer de pulmón utilizando cualquiera de los sistemas (datos no mostrados).
Características morfológicas de las CTC aislado utilizando el sistema de MCA
CTC eran contado, identificado como citoqueratina positivas y CD45 negativas, y como que tiene un núcleo visible sobre la base de análisis de imágenes fluorescentes. Como se puede observar en la Figura 3, que muestra una galería representante de CTC identificados por análisis de imagen, CTC son más grandes que los leucocitos de los alrededores y, a menudo aparecen en racimos, definido aquí como grupos contiguos de células que contienen 3 o más núcleos. La Figura 4 muestra una CTC solitario y un grupo CTC detectado en un paciente utilizando el sistema de SCLC MCA. Utilizando el sistema de MCA, se observaron agrupaciones de CTC en 2 de los 22 pacientes con CPNM (Paciente No. 13 y 21) y 4 de los 21 pacientes de SCLC (Paciente No. 31, 33, 34 y 43). May-Grünwald-Giemsa tinción de las CTC aislado utilizando el sistema de MCA reveló que se caracterizan por una alta relación N /C, piezas de fundición nuclear, y la similitud morfológica de células tumorales primarias.
Las células se tiñeron con Hoechst 33342 , marcado con FITC anticuerpo anti-citoqueratina, y el anticuerpo anti-CD45 marcado con PE.
células
Puede-Giemsa-manchados-Grünwald mostraron una alta relación núcleo-citoplasma y moldeo nuclear (× 40). flecha negro indica microcavity 9-m. Barra de escala = 60 micras.
Discusión
Se han encontrado sistemas ISET a tener una mayor sensibilidad de detección de CTC que el sistema CellSearch en varios tipos de cáncer, incluyendo NSCLC [17], [22] Sin embargo, los poros de filtros ISET, que están hechos de policarbonato por pista de ataque químico, se colocan al azar dentro de los sistemas a una densidad no uniforme. A diferencia de este tipo de filtros de policarbonato de pista grabada, el tamaño, la geometría, y la densidad de las microcavidades en el sistema de MCA evaluado en el presente estudio son controlados con precisión para lograr la separación de células específica de acuerdo con diferencias en el tamaño celular y deformabilidad. La alineación de las celdas de la MCA no sólo facilita la formación de imágenes de células al permitir la exploración de las áreas especificadas con un microscopio de fluorescencia automatizado sino que también permite la reducción de la mano de obra requerida para CTC contando [29], [31]. Como tal, el sistema de MCA proporciona una plataforma para el uso de tecnologías de formación de imágenes de alto rendimiento que proporcionan una recogida más rápida y menos costosa de datos así como enumeración CTC y análisis avanzado de fenómenos moleculares, incluyendo hibridación in situ fluorescente para la detección de tumor-específica cambios genómicos. Además, el MCA está integrado con un dispositivo miniaturizado de modo que el enriquecimiento de CTC de la sangre, así como la tinción y el lavado en el ensayo microfluídico, se puede realizar dentro de un dispositivo integrado.
En el presente estudio, CTC aislado en la MCA se tiñeron con éxito con anticuerpos marcados con fluorescencia que se dirigen a los marcadores de células tumorales, y se encontró la tinción y el lavado para tener poco o ningún efecto sobre la retención de las células tumorales en las microcavidades. Debido a su tamaño muy pequeño, el sistema MCA es portátil, lo que, al permitir que el conteo de puntos de atención de la CTC, elimina la necesidad de enviar sangre para la prueba en condiciones desfavorables de envío y agiliza la toma de decisiones clínicas. Estas características, además de nuestro procedimiento recientemente desarrollado para el aislamiento de células individuales de la CRM utilizando Microcapilares, permiten que las células tumorales que deben recuperarse de la MCA para posterior análisis molecular de los CTC [29].
En esta comparación ciega de uso del sistema de MCA a la del sistema convencional para CellSearch CTC enumeración en pacientes con cáncer de pulmón, se encontró que el sistema de MCA capaz de aislar varias líneas celulares de cáncer de pulmón de pinchos dentro de la sangre entera a altos niveles de eficiencia. Sin embargo, el sistema de MCA realizó el aislamiento de líneas celulares de SCLC ligeramente menos eficiente en comparación con la de las líneas celulares de cáncer, lo que indica que las pequeñas (& lt; 8 micras de diámetro) de las células de las líneas celulares de SCLC pueden pasar a través de las microcavidades durante la filtración de la sangre. En un estudio previo [31], encontramos que la mama (MCF-7 y Hs578T), gástrico (AGS y SNU-1), y de colon (SW620) células tumorales líneas que incluyen células tumorales EpCAM-negativas podrían ser recuperados con éxito utilizando la sistema de MCA con una eficiencia mayor que 80%. Sin embargo, también se encontró que la eficiencia de la recuperación de células pequeñas (diámetro medio de 11,6 m) de la línea de células tumorales SW620 sea ligeramente menor que la de otras líneas celulares, como lo hicimos de las líneas celulares de SCLC examinados en este estudio.
se encontró que el sistema de MCA evaluado en el presente estudio con una sensibilidad de detección más alto que el sistema de CellSearch en NSCLC CTC enumeración, lo que sugiere la superioridad de técnicas de aislamiento de reducción de tamaño y a base de deformabilidad en comparación con las técnicas basadas en inmunomagnéticas. La baja sensibilidad de CellSearch se ha atribuido a la expresión EpCAM baja en NSCLC avanzado. Sin embargo, uno de los pacientes con CPNM evaluados en el presente estudio se encontró que era CTC positivo utilizando el sistema CellSearch pero CTC negativa usando el sistema de CRM, lo que indica que los cambios en la expresión de EpCAM no pueden explicar únicamente por las diferencias encontradas entre los dos sistemas en NSCLC enumeración .
la tasa de detección CTC usando el sistema de CellSearch en pacientes de SCLC era 67%, considerablemente más alta que en pacientes con CPNM y consistente con la encontrada en estudios previos [7], [34] - [36]. Aunque el sistema de MCA no se basa en la expresión de EpCAM, que las células de SCLC circulante se han reportado para mostrar niveles altos de [37], en la realización de aislamiento CTC, su uso se ha encontrado para producir una alta tasa de detección, lo que indica que podría ser utilizado para CTC detección en pacientes con NSCLC no sólo, sino también de SCLC. Sin embargo, los recuentos de CTC de varios pacientes fueron mayores cuando se analizaron utilizando el sistema de CellSearch en comparación con el sistema de MCA, lo que indica que algunas pequeñas células tumorales en la sangre del paciente pueden fluir a través de las microcavidades, como se describe anteriormente. Investigaciones anteriores han sugerido que las técnicas de separación inmunomagnética carecen de la capacidad para aislar grandes grupos, mientras que el uso de técnicas de separación basadas en tamaño conduce a la pérdida de pequeñas CTC [17]. Para hacer frente a estos problemas, la forma de las microcavidades en el MCA fue modificado para mejorar su eficiencia en el aislamiento de células pequeñas de las células tumorales en sangre entera en nuestro estudio reciente [38].
Observación de las agrupaciones de CTC se ha informado en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón [23], [24], [39] - [42]. Se plantea la hipótesis de que la formación en racimos proporciona células CTC con ventajas sobre las restantes de aislamiento en términos de supervivencia, capacidad proliferativa, y la capacidad para formar micrometástasis. En este estudio, los grupos de CTC fueron aisladas de dos pacientes con CPNM y CEP utilizando el sistema de CRM. Curiosamente, los grupos CTC-positivos fueron identificados como que tiene un pequeño número de células de CTC por el sistema CellSearch pero un gran número por el sistema de MCA. Una de las razones por las que se encuentran varios pacientes de SCLC tener un gran recuento de CTC cuando evaluada por el sistema de MCA puede ser que este sistema permite el aislamiento de grupos más grandes de CTC que no pueden ser aislados por separación inmunomagnética. El examen de esta hipótesis requiere un análisis más detallado de las características de los grupos de CTC, como expresión de marcadores epiteliales y la presencia de células apoptóticas dentro de las agrupaciones de CTC, que podría ser realizado mediante el sistema de CRM.
En conclusión, nuestro