Extracto
Antecedentes
El supresor de tumores homeodominio-interactuando proteína quinasa-2 (HIPK2) mediante la fosforilación de la serina 46 (Ser46) es un regulador crucial de la función de p53 de apoptosis. HIPK2 es también un co-represor transcripcional del factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α) la angiogénesis tumoral de restricción y quimiorresistencia. HIPK2 puede ser desregulado en los tumores mediante varios mecanismos que incluyen la hipoxia. Aquí, hemos tratado de orientar la hipoxia mediante la restauración de la función HIPK2 y la supresión de HIF-1α, con el fin de proporcionar pruebas de la participación de ambos HIPK2 y p53 en la lucha contra la quimio-resistencia inducida por hipoxia.
Metodología /Principales conclusiones
Tras la exposición de las células de cáncer de pulmón y de colon a la hipoxia, ya sea por bajos niveles de oxígeno o cobalto, la función HIPK2 se veía afectada teniendo en cuenta el aumento de expresión de HIF-1α y la inhibición de la respuesta apoptótica de p53 a las drogas. El cobalto suprimió el reclutamiento HIPK2 en promotor de HIF-1α. La hipoxia expresión del MDM2 p53 objetivo que regula a la baja HIPK2 inducida, por tanto, la inhibición de MDM2 de siRNA restauró la respuesta HIPK2 /p53Ser46 de drogas. Zinc suplementación a las células tratadas con la hipoxia aumenta la estabilidad de proteínas HIPK2 y la acumulación nuclear, lo que conduce a la restauración de HIPK2 unión a promotor de HIF-1α, la represión de MDR1, Bcl2, y los genes de VEGF, y la activación de la respuesta apoptótica de p53 a las drogas. Combinación de zinc y ADR fuertemente reprimido el crecimiento del tumor
in vivo
mediante la inhibición de HIF-1 vía y la regulación positiva de genes diana de p53 apoptóticas.
Conclusiones /Importancia
Se demuestra aquí por la primera vez que la desregulación HIPK2 hipoxia inducida fue contrarrestado por el zinc que restauró la supresión HIPK2 de HIF 1-vía y reactivó p53 respuesta apoptótica a la droga, lo que subraya el uso potencial de los suplementos de zinc en combinación con quimioterapia para hacer frente a la hipoxia y mejorar el tratamiento de tumores.
Visto: Nardinocchi L, R Puca, Sacchi a, G Rechavi, Givol D, D'Orazi G (2009) Orientación de la hipoxia en las células cancerosas mediante la restauración de Homeodominio interacción de proteínas quinasa-2 y la actividad de p53 y la supresión de HIF-1α. PLoS ONE 4 (8): e6819. doi: 10.1371 /journal.pone.0006819
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2009; Aceptado: 3 Agosto 2009; Publicado: 28 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Nardinocchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Grant de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (GDO) y los asistentes de vuelo Instituto de Investigación médica (FAMRI) (GR); RP ha sido apoyado por una beca de la Fundación Italiana para la Investigación del Cáncer (Fundación Italiana per la Ricerca sul Cancro -FIRC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los tumores sólidos pueden sobrevivir a condiciones de hipoxia (la alta densidad celular de un tumor limita la disponibilidad de oxígeno. a las células) mediante el uso de mecanismos de protección, incluyendo la activación del factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α) un factor de transcripción que induce, entre otros, Bcl2 antiapoptótico, resistencia a múltiples fármacos (MDR), la expresión del gen VEGF, y la reprogramación de metabolismo de la glucosa que cuenta para la proliferación celular, la angiogénesis y la quimiorresistencia [1]. por otra parte, la hipoxia atenúa la respuesta de oncosuppressor p53 al daño celular [2]. la proteína p53 juega un papel importante en la detención del crecimiento, la reparación celular y la muerte celular, que minimizan la propagación de las células malignas [3]. La función de p53 como un supresor de tumores está vinculado a su actividad como un factor de transcripción a través de modificaciones posteriores a la traducción que permiten que la proteína de escapar al control MDM2, se acumulan, y se activa [4]. El gen p53 está mutado en ~ 50% de los cánceres humanos, mientras que, en los cánceres que albergan de tipo silvestre (wtp53), su actividad puede verse comprometida por otros mecanismos que incluyen la desregulación de las proteínas reguladoras [5], [6].
proteína homeodominio de interacción quinasa-2 (HIPK2) es un regulador importante de la función de p53 de apoptosis, por lo tanto hemos demostrado previamente que HIPK2 fosforila p53 en la serina 46 (Ser46) después de daño en el ADN grave, la inducción de p53 de apoptosis específica actividad transcripcional [7] - [9]. Fosforilación en este sitio es un evento tardío después de daño en el ADN grave y específicamente regula la apoptosis inducida por p53 a través, por ejemplo, la regulación positiva de genes en lugar de p53AIP1 del ciclo celular arrestado gen relacionado y MDM2 expresión de genes [10], [11]. Una de las principales, bucle de realimentación negativa de auto-regulación de p53 implica la inducción de MDM2 p53-dependiente que a su vez se une e inactiva p53 conduciéndolo a la degradación proteasomal [12] - [14]. En este sentido, hemos demostrado que HIPK2 neutraliza la inhibición MDM2 rescatar la actividad transcripcional de p53 y la función de apoptosis [15]. Por lo tanto, los agentes tales como HIPK2 que puede aumentar p53 activa en las células tumorales por obstaculizar la interacción MDM2-p53 podría tener utilidad terapéutica en la sensibilización de las células tumorales a la quimioterapia o la radioterapia.
HIPK2 es también un co-transcripcional represor menudo en complejo multiproteico con otros co-represores, tales como Groucho y hystone deacetilasa 1 (HDAC1) [16]. Recientemente, hemos encontrado que HIPK2 co-reprime el factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α) factor de transcripción restringir la angiogénesis tumoral HIF-1 inducida y quimiorresistencia [17]. Así, la inhibición de la actividad de HIF-1α por HIPK2 reduce VEGF, MDR1, y la expresión de Bcl2 y estimula la apoptosis inducida por el fármaco de una manera dependiente de p53 y-independiente [18]. Habida cuenta de su papel central en la orientación de las células hacia la apoptosis frente a un estrés genotóxico, la regulación de HIPK2 ha sido objeto de intensa investigación en los últimos años. cánceres se encontró HIPK2 downmodulated en tiroides, de mama [19] y de colon [20] en comparación con los respectivos tejidos normales; mutado dentro de la señal de retención de moteado en las leucemias mieloblástica aguda humanos, y en el síndrome mielodisplásico [21]; y deslocalizada en el citoplasma por la alta movilidad de grupo A1 (HMGA1) sobreexpresión [22]. HIPK2 es una proteína inestable que se degrada a través de la vía del proteasoma en estudios recientes particulares mostró que HIPK2 puede downmodulated por p53 inducida por MDM2 [23] y por las proteínas Siah2 hipoxia inducida por [24]. Recientemente hemos demostrado que desmontables HIPK2 induce mal plegamiento de p53 que puede ser revertido por la administración de suplementos de zinc [25], [26]. Por lo tanto, todas las condiciones que conducen a la desregulación HIPK2 terminarían en una respuesta multifactorial que conduce a la quimiorresistencia tumor al afectar fuertemente la actividad transcripcional de p53 y la apoptosis por un lado y la actividad de HIF-1 por otro lado. Por lo tanto, una comprensión de cómo HIPK2 downregulated podría ser reactivado podría conducir a nuevas estrategias para frenar tanto HIF-1 vía y restablecer la actividad de p53 para superar la resistencia a fármacos. Esto también está en consonancia con los trabajos recientes que han demostrado que el tratamiento del cáncer por agentes anti-angiogénicos puede dar lugar a la hipoxia que selecciona para la radio y la resistencia a los medicamentos, lo que subraya la necesidad de abordar la hipoxia tumoral en el cáncer [27].
el zinc es un cofactor importante para la actividad de unión al ADN de p53, ya que algunas mutaciones de p53 que perturban el sitio de unión de zinc-in resultado p53 en la pérdida de la unión al ADN [28]. El zinc es un elemento traza que es esencial para la función normal de las células y es un cofactor para la estructura y función de una amplia gama de proteínas celulares incluyendo enzimas, factores de transcripción y proteínas estructurales [29]. Por lo tanto el zinc es un requisito previo esencial para el progreso de muchos procesos de señalización en eucariotas y la desregulación de su metabolismo puede inducir daño en el ADN y el riesgo de cáncer [30]. El tratamiento con zinc ha demostrado tener potencial verdadera clínica, lo que reduce el crecimiento del tumor y la agresividad con biotoxicidad limitada, por ejemplo en el cáncer de próstata [31].
El objetivo de nuestra investigación fue evaluar si la hipoxia podría desregular el HIPK2- p53 inducida por la actividad transcripcional de apoptosis dependiente en respuesta a las drogas y por lo tanto contribuyen a la quimio-resistencia y si el zinc podría contrarrestar esta inhibición HIPK2 /p53Ser46. Se encontró que la exposición de las células tumorales a la hipoxia, por cualquiera de bajo oxígeno o cobalto, inhibidos p53Ser46 fosforilación y apoptótica p53 actividad transcripcional en respuesta a las drogas. Esta inhibición fue la consecuencia de HIPK2 regulación a la baja debido, al menos en parte, a la regulación positiva MDM2 inducida por hipoxia. Por otra parte, el cobalto inhibió el reclutamiento HIPK2 en promotor de HIF-1α. En particular, la administración de suplementos de zinc a las células tratadas hipoxia contrarresta la inhibición de HIPK2 permitiendo su acumulación nuclear que se correlaciona con la modulación negativa de HIF-1α y la represión de la vía de HIF-1 y con la restauración de la actividad transcripcional p53Ser46 apoptosis en respuesta a las drogas. En conjunto, estos resultados muestran que la hipoxia condición puede afectar a la vía HIPK2 /p53Ser46, en particular, se muestra aquí por primera vez que el zinc puede neutralizar la inhibición HIPK2 inducida por hipoxia. Dado que los tumores contienen regiones con condiciones de hipoxia, donde wtp53 está inactivo, estos resultados apoyan el uso potencial de los suplementos de zinc a la quimioterapia en el tratamiento de los tumores con wtp53 no funcionamiento o HIPK2.
Resultados
exposición de la célula a cobalto abroga la transcripción p53-apoptóticos gen y reduce el reclutamiento HIPK2 en promotor de HIF-1α
Nos preguntó si el cloruro de cobalto (CoCl
2), que estabiliza HIF-1α y HIF-1 induce genes de respuesta con cinéticas similar a la de la hipoxia [32], podría afectar a la transcripción de genes de apoptosis p53 inducida por fármacos. Como se muestra en la Figura 1A, cobalto abolió firmemente la escisión de PARP inducida por ADR y la fosforilación de Ser46. Cobalt solo indujo p53 niveles, aunque sí ni inducir la fosforilación de Ser46 ni la escisión de PARP (Figura 1A). La actividad transcripcional de p53 de apoptosis se evaluó mediante el ensayo de luciferasa. Como se muestra en la Figura 1B, la actividad p53AIP1-luc inducida por ADR fue significativamente afectada por cobalto, mientras que el cobalto sí solo no afecta, y
in vivo
análisis de los niveles de mRNA mostró que la regulación positiva inducida por el fármaco de apoptótica p53 genes diana
Bax
y
Puma
estaba fuertemente deteriorada por cobalto (Figura 1C), como se muestra también por la relación de la expresión de GAPDH. Por el contrario, habíamos demostrado previamente que el cobalto puede inducir
MDR1
, y
Bcl2
la expresión de genes [18].
células RKO (A) fueron tratados con CoCl
2 y ADR para 16 h, solos o en combinación. La misma cantidad de extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos específicos de detección de la fosforilación de Ser46 y la escisión de PARP (flechas: formas no escindidos y escindidos); También se muestra p53 total. Anti-tubulina se utilizó como control de carga de proteínas. (B) las células RKO, transfectadas de forma estable con el reportero p53AIP1-luc, fueron tratados con CoCl
2 y ADR durante 16 h antes de analizar la actividad de luciferasa. RLU: unidades de luciferasa relativa.
Columnas
ha, con una media de tres experimentos independientes realizados por duplicado;
bares, S. D. *
P Hotel & lt; 0,01. (C) Total de ARNm fueron transcritas inversa a partir de células RKO tratadas con CoCl
2 y ADR solo o en combinación, durante 16 h para los análisis de PCR de los genes diana de p53
Bax
y
Puma
. GAPDH se utilizó como control interno. relación de expresión para GAPDH se evaluó mediante análisis densitométrico de la expresión génica. *
P
. & Lt; 0,01
Como condición de hipoxia promueve al menos en parte la degradación de proteínas HIPK2 [24] nos preguntó si cobalto fue capaz de afectar de manera similar la expresión y actividad HIPK2. Con este fin, los niveles de proteína HIPK2 se examinaron en RKO y las células A549 tratadas con CoCl
2 en presencia o ausencia de inhibidor del proteasoma MG132. Como se muestra en la Figura 2A, cobalto downregulated niveles de proteína HIPK2 que podrían ser rescatados por el tratamiento MG132. Análisis de la expresión del ARNm mostró que la transcripción de genes HIPK2 no fue afectada por cobalto (Figura 2B). Pensamos que al mantener bajos los niveles de proteína HIPK2, cobalto podría afectar el reclutamiento en HIPK2 objetivo de los promotores, lo que afecta la actividad HIPK2 co-represor. En apoyo de esta hipótesis, se realizó un chip de ensayo, mientras que los inmunocomplejos cromatina se inmunoprecipitaron con deacetilasa 1 anticuerpos anti-histonas (HDAC1) y anti-HIPK2 y análisis de PCR realizados usando cebadores específicos que flanquean el promotor de HIF-1α [17]. Como se muestra en la Figura 2C (panel izquierdo), el HIPK2 y HDAC1 contratación en
HIF-1α
promotor fue fuertemente deteriorada por cobalto. Como control de la especificidad HIPK2 a la
HIF-1α
promotor de unión, se utilizó cebadores específicos que abarcan el ser humano
GAPDH
región promotora. Como era de esperar (Figura 2 C, panel derecho), no
se observó GAPDH
amplificación después de la cromatina inmunoprecipitación con anticuerpos anti-anti-HDAC1 HIPK2 y mientras una banda PCR clara se detectó utilizando el ADN genómico como plantilla. En conjunto, estos resultados muestran que el cobalto podría afectar tanto a la actividad de p53 y HIPK2.
células (A) RKO y A549 se trataron con cobalto durante 16 h en presencia o ausencia de inhibidor del proteasoma MG132 (40 mmol /L para 6 h) y el vehículo DMSO. Una cantidad igual de extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia Western con un anticuerpo específico de detección de los niveles de proteína HIPK2 endógenas; anti-Hsp70 se utilizó como control de carga de proteínas. (B) Total de los ARNm se transcribe de forma inversa a partir de la RKO y celular A549 tratada con cobalto durante 16 h para los análisis de PCR de la expresión génica HIPK2. GAPDH se utilizó como control interno. análisis (C) Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) realizó con anticuerpos anti-anti-HDAC1 HIPK2 y en células RKO tratadas con cobalto para 8 y 16 h. Se realizaron análisis de PCR en las muestras de ADN inmunoprecipitadas usando cebadores específicos para el ser humano
HIF-1α
promotor. La amplificación de
GAPDH
promotor (panel derecho) se utilizó como control de especificidad HIPK2 a la
HIF-1α
promotor de unión. Una muestra que representa la amplificación lineal de la cromatina total de entrada (Input) se incluyó como control. Controles adicionales incluyen inmunoprecipitación realiza con inmunoglobulinas no específicas (n Ab).
inhibición inducida por hipoxia de la actividad de transcripción p53 puede ser revertida por el agotamiento de MDM2
fosforilación mediada p53Ser46 HIPK2 es inducida por daño en el ADN grave [7] - [9] que, en un bucle de regulación de retroalimentación, fortalece la actividad HIPK2 a través de un mecanismo de caspasa inducida por p53 mediada [33] e induce selectivamente genes de apoptosis e inhibe la relacionada con la detención del ciclo celular y genes MDM2 [10], [11]. Por otro lado, un estrés no grave puede regular a la baja HIPK2 a través de p53 inducida por MDM2 upregulation [23]. Por lo tanto, nos preguntamos si la hipoxia podría actuar como no grave estrés capaz de activar p53-MDM2 de destino y, en consecuencia inhibir HIPK2 y predisponer a la resistencia a los medicamentos. Los análisis de RT-PCR semicuantitativa mostró que el cobalto, así como bajo la regulación positiva inducida por el oxígeno MDM2 (Figura 3A). A continuación, se investigó si MDM2 fue responsable de la inhibición de la actividad de p53 apoptótica. Análisis de la actividad transcripcional de p53 tratamiento después de cobalto se realizó en 293 células co-transfectadas con el reportero p53AIP1-luc y, o bien HIPK2-Flag o el mutante punto HIPK2-K1182R-Flag que no puede ser degradado por MDM2 [23]. Como se muestra en la Figura 3B, la actividad AIP1-luc HIPK2 inducida se redujo significativamente por el cobalto mientras que la actividad AIP1-luc inducido por K1182R no cambió. inmunotransferencia Western demostró que la expresión se redujo en HIPK2 cobalto mientras que la expresión del mutante K1182 resistente a la degradación no se vio afectada (Figura 3C). De acuerdo, también la fosforilación de Ser46 HIPK2 inducido se redujo en cobalto, mientras que no cambió tras la sobreexpresión K1182 (Figura 3C). Ambos resultados sugieren una implicación de MDM2 en la regulación HIPK2 que a su vez afectó la actividad p53Ser46. Para probar esta hipótesis, las células RKO se agotaron de la función de MDM2 por siRNA (Figura 3D) y este agotamiento MDM2 fue suficiente para rescatar la fosforilación inducida por ADR Ser46 y la escisión de PARP inhibida por cobalto (Figura 3E y comparar con 1A). Por otra parte, el agotamiento de MDM2 contrarresta la inhibición inducida por el cobalto de la actividad p53AIP1-luc en respuesta a ADR (Figura 3F y comparar con 1B). En conjunto, estos datos sugieren que la resistencia a los fármacos inducida por hipoxia era dependiente, al menos en parte, de la regulación positiva de la expresión de MDM2 que a su vez inhibe /p53Ser46 actividad apoptótica HIPK2 en respuesta a las drogas.
(A) ARNm totales se transcribe de forma inversa a partir de la RKO y celular A549 tratada con cobalto o 2% de o
2 durante 16 h para los análisis de PCR de la expresión de genes MDM2. GAPDH se utilizó como control interno. (B) 293 células fueron co-transfectadas con el reportero p53AIP1-luc y HIPK2-Flag o K1182R-Flag (MDM2 mutante resistente a la degradación) vectores de expresión y las 24 h tratadas posteriormente con CoCl
2 durante 16 horas, antes de la actividad luciferasa fue el ensayo. RLU: unidades de luciferasa relativa.
Columnas
ha, con una media de tres experimentos independientes realizados por duplicado;
bares, S. D. *
P Hotel & lt; 0,01. (C) Las células se trataron como en (B) y después del tratamiento cantidades iguales de extractos celulares totales se sometieron a inmunotransferencia de Western usando los anticuerpos indicados: anti-Flag (para detectar la expresión HIPK2-Flag ectópico), anti-Ser46 y anti-p53 anticuerpos. (D) células RKO se transfectaron con siMDM2 y 36 h más tarde la misma cantidad de los extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia Western con un anticuerpo específico anti-MDM2. las células (E) RKO se transfectaron con siMDM2 y 24 h más tarde fueron tratados con CoCl
2 y ADR para 16 h. La misma cantidad de extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos específicos de detección de la fosforilación p53Ser46 y la escisión de PARP (flechas muestran formas escindidas y no escindidas); También se muestra p53 total. Anti-tubulina se utilizó como control de carga de proteínas. células (F), RKO transfectadas de forma estable con el reportero p53AIP1-luc, se transfectaron con siMDM2 y 24 h más tarde trataron con CoCl
2 y ADR durante 16 horas antes de analizar la actividad de luciferasa. RLU: unidades de luciferasa relativa.
Columnas
ha, con una media de tres experimentos independientes realizados por duplicado;
bares, SD
zinc restaura inducida por ADR de transcripción p53-apoptóticos de genes en las células tratadas con cobalto
Recientemente hemos demostrado que el agotamiento HIPK2 es responsable de p53 mal plegamiento de proteínas que puede ser revertido por la administración de suplementos de zinc [25], [26]. Por lo tanto, la hipótesis de aquí que la hipoxia inducida por la desregulación HIPK2 podría reflejar la condición HIPK2 desmontables y por lo tanto afectar a p53 de unión a ADN y las actividades transcripcionales. Hemos encontrado que el cobalto aumenta la reactividad de p53 con el anticuerpo PAb240 (mutante, se desarrolló forma p53) y reduce la reactividad de p53 al anticuerpo PAb1620 (de tipo salvaje, forma plegada) (Figura 4A) que indica el mal plegamiento de la proteína p53, y por lo tanto a prueba si zinc la suplementación fue capaz de restaurar la actividad wtp53 en respuesta a las drogas. Para este objetivo, primero evaluamos la
in vivo
wtp53 la actividad de unión al ADN mediante el uso de análisis de chip. células RKO fueron tratadas con cobalto y ADR en presencia o ausencia de zinc y p53 endógeno immunorecipitated con el anticuerpo anti-p53 policlonal (FL393). La cantidad de elementos de unión de p53-co-precipitado en objetivo de los promotores se determinó mediante PCR. Los resultados mostraron que el cobalto marcadamente reducida de p53 de unión a los promotores de genes de apoptosis como
Puma
y
DR5
en respuesta a ADR y que esta inhibición fue fuertemente revertida por la suplementación de zinc (Figura 4B). La unión a
Puma
y específico de p53
DR5
promotores fue confirmada por
GAPDH
promotor de amplificación después de la inmunoprecipitación de la cromatina con anticuerpo anti-p53 (Figura 4B). Por lo tanto, la actividad transcripcional de p53 inducida por apoptosis específicamente por ADR (Noxa-luc contra p21-luc), fue inhibido por el cobalto y restaurado por los suplementos de zinc (Figura 4C). Notablemente, zinc solo no indujo p53 actividad transcripcional. Además, se evaluó si la actividad transcripcional de p53 inducida por HIPK2 inhibida por cobalto (Figura 3B) podría ser restaurada por zinc. Para este objetivo, las células 293 fueron co-transfectadas con el reportero p53AIP1-luc y HIPK2 vector de expresión. Como se muestra en la Figura 4D, los suplementos de cinc restauró completamente la actividad p53AIP1-luc HIPK2 inducida reducida por cobalto, mientras que los tratamientos con cobalto o zinc solo no indujo la actividad de luciferasa p53AIP1. De acuerdo, la p53 transcripción de genes de apoptosis inducida por ADR fue inhibida por cobalto (Figura 4E, comparar los carriles 2 con carril 3) y restaurado por la administración de suplementos de zinc (Figura 4E, comparar el carril 3 con 4) a los mismos niveles de tratamiento ADR (Figura 4E comparar el carril 4 con el carril 2). En particular, la administración de suplementos de zinc para el cobalto no indujo apoptosis transcripción de genes (Figura 4E, carril 5). Por último, la muerte celular por apoptosis se evaluó por inmunotransferencia Western que muestra que la inhibición de la escisión de PARP y la fosforilación de Ser46 por la exposición de cobalto de las células tratadas con ADR (Figura 4F, comparar carriles 2 con carril 4) fue fuertemente restaurado por zinc (Figura 4F, comparar carril 4 con carril 5). Estos datos sugieren que el zinc fue capaz de reactivar las de unión a ADN y apoptóticos actividades transcripcionales endógenas wtp53 hipoxia inhibida en respuesta a drogas, contrarrestando, al menos en parte, la desregulación HIPK2.
células RKO (A) fueron tratados con cobalto durante 16 h y la misma cantidad de los extractos de células totales se inmunoprecipitaron con PAb1620-conformación específica (de tipo silvestre, la forma p53 doblado) y PAb240 (por mutante, desplegado de forma p53) anticuerpos y se analizaron por inmunotransferencia Western con anti anticuerpo policlonal p53 (FL393). Se presentan las bandas representativas de al menos dos experimentos independientes, mostrando aumento de PAb240 reactividad y la reducción de la reactividad PAb1620 después del tratamiento de cobalto. Una señal no específica (N. S.) se muestra como el control de la carga de proteínas. (B) Análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) realizó con anticuerpo anti-p53 en células RKO expuestos a ZnCl
2 y CoCl
2 para 24 h y adriamicina de 16 h. Se realizaron análisis de PCR en las muestras de ADN inmunoprecipitadas usando cebadores específicos para diana de p53
Puma Opiniones y
DR5
promotores. La amplificación de
GAPDH
promotor (panel derecho) se utilizó como control de especificidad de unión a
Puma
y p53
DR5
promotores. Una muestra que representa la amplificación lineal de la cromatina total de entrada (Input) se incluyó como control. Controles adicionales incluyen inmunoprecipitación realizado con inmunoglobulinas no específicas (n Ab). células RKO (C) fueron transfectadas con p21-luc y reporteros Noxa-luc y 24 h más tarde se trató con ZnCl
2 y CoCl
2 para 24 h y adriamicina durante 16 h, respectivamente, antes de que se ensayó la actividad de luciferasa. Resultados, la actividad normalizada a ß-galactosidasa se muestran como veces de inducción sobre las células no tratadas;
bares, S. D. (D) 293 células fueron co-transfectadas con el reportero p53AIP1-luc y vector de expresión HIPK2-Flag y 24 h más tarde tratada con ZnCl
2 y CoCl2 durante 16 h, antes de que se ensayó
actividad luciferasa. RLU: unidades de luciferasa relativa.
Columnas
ha, con una media de tres experimentos independientes realizados por duplicado;
bares, S. D. *
P Hotel & lt; 0,01. (E) Total de ARNm fueron transcritas inversa a partir de células RKO tratadas como en (C) para los análisis de PCR de los genes diana de p53
Noxa
y
Puma
. GAPDH se utilizó como control interno. (F) células RKO se trataron con ZnCl
2 y CoCl 2 para 24 h y ADR durante 16 h y la misma cantidad de los extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia Western con anti-PARP
(flechas muestran la PARP escindida y se escindió ), anti-Ser46 y los anticuerpos anti-p53. Anti-Hsp70 se utilizó como control de carga de proteínas.
Zinc vuelve HIPK2 disfuncional en células tratadas con hipoxia
A continuación trató de evaluar si el zinc podría contrarrestar la hipoxia inducida por la regulación a la baja HIPK2 y afectar HIPK2 la unión a la cromatina. Como se muestra en la Figura 5A (panel izquierdo) la regulación a la baja de proteína HIPK2 cobalto inducida fue rescatado por la administración de suplementos de zinc, mientras que el zinc solo no cambió los niveles HIPK2. Por el contrario, el tratamiento de cobalto aumentó la expresión de HIF-1α y este efecto se revirtió con firmeza por la suplementación de zinc (Figura 5A, panel derecho). Fraccionamiento subcelular mostró que el tratamiento de cobalto reduce tanto los niveles nucleares HIPK2 citoplásmicos y nucleares, aunque los niveles nucleares HIPK2 fueron más fuertemente afectados por el cobalto y que este efecto fue revertido por la administración de suplementos de zinc (Figura 5B). Zinc solo no afectó los niveles de HIPK2 (Figura 5B). Resultados similares se obtuvieron con bajo tratamiento con oxígeno (Figura 5C). A continuación analizaron la actividad catalítica HIPK2 después del tratamiento de cobalto. Para este objetivo, se transfectaron células 293 con la bandera vector vacío o vector de expresión HIPK2-Flag en presencia o ausencia de cobalto o zinc, seguido de la inmunoprecipitación de HIPK2 ectópico con anti-Flag anticuerpo y
vitro
ensayo de quinasa in con la proteína básica conocida fosforilación HIPK2 sustrato de mielina (MBP) [7]. Como se muestra en la Figura 5D, HIPK2 ectópico todavía era capaz de fosforilar MBP después de los tratamientos, lo que sugiere que la hipoxia probable que no afecta a la actividad catalítica HIPK2, al menos en nuestra condición experimental.
(panel izquierdo, A) células subconfluentes RKO fueron expuestos a CoCl
2 y ZnCl
2 solo o en combinación durante 16 h, y la misma cantidad de los extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia Western con un anticuerpo específico que muestra el nivel HIPK2 endógeno. Anti-tubulina se utilizó como control de carga de proteína (panel derecho). La misma cantidad de extractos nucleares de células RKO tratadas como anteriormente, se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos específicos que detectan los niveles de HIF-1a. Anti-Hsp70 se utilizó como control de carga de proteínas. células (B) RKO tratadas como en (A) se lisaron para el fraccionamiento nuclear y citoplasmática y se analizaron por inmunotransferencia de Western usando anticuerpo anti-HIPK2. Los anticuerpos anti-tubulina y anti-nfyb fueron utilizados para el control de la carga de proteínas de las fracciones citoplasmáticas y nucleares, respectivamente. las células (C) RKO y A549 se trataron con 2% O
2 en presencia o ausencia de zinc durante 16 h, y la misma cantidad de los extractos de células nucleares analizados por inmunotransferencia Western con anticuerpos específicos de detección de HIF-1α y los niveles nucleares HIPK2 . Anti-Hsp70 se utilizó como control de carga de proteínas. (D) ensayo de quinasa de HIPK2 ectópica en células 293 transfectadas con la bandera vector de expresión vacío o HIPK2-Flag deja sin tratar o tratadas con cobalto o zinc durante 16 h. La misma cantidad de los extractos de células totales se inmunoprecipitaron usando el anticuerpo anti-Flag y se ensayó para la actividad de quinasa utilizando MBP como sustrato. Igualdad de expresión de la proteína MBP fue confirmada por tinción de Comassie-ensayo de quinasa. análisis (E) de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) realizado con el anticuerpo anti-HIPK2 en células RKO tratadas como en (A). Se realizaron análisis de PCR en las muestras de ADN inmunoprecipitadas usando cebadores específicos para el ser humano
HIF-1α
promotor. La amplificación de
se utilizó GAPDH
promotor (panel de la derecha) como control de especificidad de unión a la HIPK2
HIF-1α
promotor Una muestra que representa la amplificación lineal de la cromatina total de entrada (Input) se incluyó como controlar. Controles adicionales incluyen inmunoprecipitación realizado con inmunoglobulinas no específicas (n Ab). (F, panel superior), los ARNm total fueron transcritas inversa a partir de células RKO tratadas con ZnCl
2 y CoCl
2 durante 24 horas y ADR durante 16 h, respectivamente, para los análisis de PCR de los genes HIF-1 destino
Bcl2
,
MDR1
, y
VEGF
. Ratio: Relación de expresión de GAPDH. (F, nivel inferior) análisis densitométrico de la expresión génica representa como la relación de la expresión de GAPDH, usado como control interno. Estudiante de
t
prueba se utilizó para el análisis estadístico de la comparación entre los valores de cobalto y cobalto y zinc, y de CoCl
2 /ADR y CoCl
2 /ADR /ZnCl
2 como mostrado. *
P Hotel & lt; 0,01. células (G) RKO empobrecido de la función HIPK2 por siHIPK2 fueron tratados con ZnCl
2 y CoCl
2 para 24 h y ADR durante 16 h, respectivamente y mRNAs totales a transcripción inversa para PCR análisis como en (F).
los efectos opuestos de la hipoxia sobre HIPK2 y los niveles de HIF-1α están interconectados por el efecto represor de HIPK2 en
HIF-1α
promotor. Por lo tanto, la abolición de cobalto-inducida de contratación HIPK2 en
HIF-1α
promotor fue fuertemente revertido por el zinc (Figura 5E). El HIPK2 unión específica a
HIF-1α
promotor fue confirmada por
GAPDH
promotor de amplificación después de la inmunoprecipitación de la cromatina con anticuerpo anti-p53. En consecuencia, el análisis de RT-PCR mostró que el cobalto inducida por
Bcl-2
,
MDR1
y
VEGF
la expresión génica se suprimió significativamente por el zinc (Figura 5FD, comparar CoCl
2 carriles con CoCl
2 /ZnCl
2 carriles), siguiendo la línea marcada por la relación de la expresión de GAPDH (Figura 5F, panel inferior). Además, el tratamiento ADR en combinación con cobalto no fue capaz de inhibir la vía de HIF-1 cobalto inducida (Figura 5E, comparar COCl
2 carriles con CoCl
2 carriles /ADR) a menos que en combinación con zinc (Figura 5F , comparar COCl
2 carriles /ADR con CoCl
2 /ADR /ZnCl
2 carriles). El papel de HIPK2 en objetivos de HIF-1 inducida por cobalto se evaluó tras el agotamiento HIPK2. Como se muestra en la Figura 5G, el nivel basal de
MDR1
y
Bcl2
la expresión de genes que ya era alta en las células siHIPK2, de acuerdo con nuestros resultados previos sobre la actividad represora HIPK2 de HIF-1α [17 ], [18], y no podía ser reprimida por tratamiento con zinc (Figura 5G y comparar con 5F). El efecto del zinc contrarrestar la hipoxia resultado fue específico como otro antioxidante, es decir, la vitamina C, ni hizo downmodulate HIF-1 genes diana ni respuesta a los fármacos afectados (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados muestran que el zinc contrarrestar la hipoxia inducida por HIPK2 modulación negativa, se recuperó el reclutamiento HIPK2 en la cromatina y la condujo a la represión de la vía de HIF-1.
El zinc mejora la respuesta a la quimioterapia en vivo
Para evaluar la eficacia terapéutica de la combinación de zinc y la quimioterapia
in vivo
generamos xenoinjertos de tumores en ratones desnudos atímicos. Los ratones fueron tratados previamente con ZnCl
2 de 8 h antes de la inyección de ADR y después se trata cada día con zinc. Los ratones tratados con ADR solo en el transcurso de 2 semanas reducción del volumen del tumor se muestran de una manera comparable con los tratados con zinc solo (Figura 6A). Curiosamente, la adición de zinc mejora de forma significativa el efecto de ADR que conduce a una marcada inhibición del crecimiento del tumor (Adriamycin + zinc
frente
adriamicina:
P
& lt; 0,01) (Figura 6A y 6B). Los tumores se recogieron por día 18 y la expresión génica se determinó por RT-PCR y los análisis densitométricos.