Extracto
Objetivos
del receptor del factor de crecimiento epidérmico inhibidores de tirosina quinasa (EGFR) (ITC) han demostrado beneficios clínicos dramáticos en el cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM); sin embargo, la resistencia sigue siendo un grave problema en la práctica clínica. El presente estudio analiza las diferencias de señalización mTOR-asociado entre las líneas celulares NSCLC EGFR TKI sensibles y resistentes a e investigó la viabilidad de la orientación de mTOR con inhibidor de mTOR específica en las células NSCLC resistente al EGFR TKI.
Se seleccionaron cuatro tipos diferentes de células de NSCLC EGFR TKI sensibles y resistentes a: PC9, células PC9GR, H1650 y H1975 como modelos para detectar mTOR asociada a diferencias de señalización de la vía por western blot e inmunoprecipitación y evaluaron el efecto antiproliferativo y la detención del ciclo celular de ku-0063794 por el método MTT y citometría de flujo.
resultados
en el presente estudio, se observó que mTORC2 asociada Akt Ser473-FoxO1 vía de señalización en un estado basal fue altamente activado en las células resistentes.
In vitro
mTORC1 y mTORC2 actividades quinasa ensayos mostraron que las líneas celulares de NSCLC EGFR TKI resistentes tuvieron mayor actividad de la quinasa mTORC2, mientras que las células sensibles tenían mayor actividad de la quinasa mTORC1 en el estado basal. El inhibidor de mTOR ATP-ku-0063794 competitiva mostró efectos antiproliferativos dramáticos y la detención del ciclo celular G1-tanto en células sensibles y resistentes. Ku-0063794 en el IC
50 concentración inhibe eficazmente tanto los niveles de fosforilación de mTOR y p70s6k; el segundo es un sustrato mTORC1 y no regular por incremento la fosforilación de Akt Ser473 que se induce por la rapamicina y dio lugar a la inhibición parcial de la fosforilación FoxO1. También hemos observado que las muestras de tumor de NSCLC clínicas EGFR TKI-sensibles y resistentes tuvieron mayor total y los niveles de expresión p70S6K fosforilados.
Conclusión
Nuestros resultados indican la señalización de la vía mTORC2 asociada se hyperactivated en EGFR TKI células resistentes y la orientación de mTOR con inhibidores de mTOR específicas es probable que una buena estrategia para los pacientes con CPNM EGFR mutante que desarrollan resistencia a EGFR TKI; las posibles funciones específicas de mTORC2 en las células NSCLC TKI del EGFR-resistentes eran todavía desconocidos y debe investigarse más a
Visto:. Fei SJ, Zhang XC, Dong S, H Cheng, Zhang YF, Huang L, et al . (2013) Orientación de mTOR para Superar factor de crecimiento epidérmico receptor tirosina quinasa resistencia a los inhibidores de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (7): e69104. doi: 10.1371 /journal.pone.0069104
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Febrero, 2013; Aceptado: 5 Junio 2013; Publicado: July 16, 2013
Derechos de Autor © 2013 Fei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 30772531 y nº 81071699, www.nsfc.gov.cn), Guangdong desarrollo social de los proyectos del plan de ciencia y tecnología (n: 2011A030400010, www.gdstc.gov .cn /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores recibieron gefitinib de AstraZeneca para los experimentos in vitro en el laboratorio. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) vía de señalización desempeña un papel central en el desarrollo y la progresión de cáncer de pulmón [1]. EGFR inhibidores de tirosina quinasa (TKI) gefitinib y erlotinib son eficaces terapias clínicas para pacientes con CPNM avanzado con mutaciones de EGFR activado, en comparación con la quimioterapia de primera línea citotóxico estándar [2] - [4]. Sin embargo, a pesar de estos beneficios espectaculares de ITC del EGFR, todos estos pacientes inevitablemente desarrollan resistencia a gefitinib y erlotinib, normalmente de 6-12 meses después del inicio del tratamiento con ITC [5]. Varios mecanismos, incluyendo una mutación T790M en EGFR, amplificación MET, y la sobreexpresión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), inducen resistencia adquirida a reversible EGFR-TKI para NSCLC con mutaciones de EGFR-activación de [6] - [8]. Un medio de superar la resistencia de TKI sigue siendo un reto en la práctica clínica. En general, las estrategias para superar la resistencia debe tener en cuenta el mecanismo de resistencia en sí [7], [9], [10], mientras que una estrategia alternativa consiste en identificar nuevas moléculas o mecanismos que superen la resistencia, como mTOR.
mTOR es una serina /treonina quinasa conservado que se produce en mTORC1 y complejos mTORC2 [11]. Se integra señales de factores de crecimiento, el suministro de nutrientes, y el estado de energía para activar el crecimiento celular, y es upregulated en varios tipos de cáncer [12]. Por lo tanto, los estudios dirigidos mTOR para la terapia del cáncer han recibido atención en los últimos años. Sin embargo, la respuesta clínica a la rapamicina y sus análogos ha sido débil [13]. Muchos estudios han demostrado los mecanismos de su pobre respuesta tanto
in vitro
y
in vivo
[14] - [16]. Nuestro informe anterior también mostró que todas las líneas celulares de NSCLC en nuestro laboratorio son resistentes a RAD001 (un análogo de rapamicina) [17]. De hecho, la rapamicina inhibe sólo parcialmente las funciones mTORC1 y en su lugar induce Akt Ser473 fosforilación [16] y no inhibe mTORC2 en absoluto [18]. Estudios más recientes han indicado que mTORC2 regula la supervivencia celular y la organización del citoesqueleto mediante la regulación de la fosforilación de sus sustratos, Akt hidrofóbicas motivo (HM) sitio (Ser473) y el sitio PKCa HM (ser657) [19], [20]. mTORC2 quinasa actividad aumenta en algunos tumores; Por lo tanto, la orientación mTORC2 podría inhibir el crecimiento y la proliferación [21] de células de cáncer - [23]. Por lo tanto, la hipótesis de que mTORC2 juega un papel importante en el crecimiento y la proliferación celular y que la orientación de mTOR con inhibidores de mTOR específicos producirían mejores efectos anti-tumorales después de la resistencia adquirida TKI.
Se analizaron las diferencias en la primera mTOR- vías de señalización asociadas entre las células con CPNM EGFR TKI-sensibles y resistentes en estado basal
in vitro
. A continuación, se ensayó mTORC1 y mTORC2 actividades quinasa
in vitro
. Por último, se evaluó la detención efectos antiproliferativos y del ciclo celular de ku-0.063.794 y analizamos la expresión de p70S6K total y fosforilada en muestras tumorales.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y los Regentes
Ku-0063794 (TOCRIS, Minneapolis, MN, EE.UU.) y gefitinib pura, proporcionado amablemente por AstraZeneca, se prepararon en DMSO y se diluye con medio de cultivo antes de su uso. mTOR (# 2983), p-mTOR (# 2971), Rictor (# 2114 y#5379), Raptor (# 2280 y#5382), Akt (# 9272), p-Akt Ser473 (# 4060), p-p70S6K (# 9208), p-4EBP1 (# 9459), FoxO1 (# 2880) y p-FoxO1 (# 9461) anticuerpos para transferencia de Western e inmunoprecipitación fueron todos adquiridos de CST (Beverly, MA, EE.UU.). p70S6K (# ab47504) y p-p70S6K (# ab60947) anticuerpos para transferencia de Western e inmunohistoquímica fueron adquiridos de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Inactivo Akt1 /PKB1 (# 14-279) y 4E-BP1 (# 10022-H07E) se adquirieron de Millipore (Bedford, MA, EE.UU.) y Sino Biológica (Pekín, China), respectivamente.
Líneas Celulares
El adenocarcinoma de pulmón humano líneas de células PC9, H1650, H1975 y (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Tony Mok, Universidad china de Hong Kong. células PC9 abrigan un EGFR exón 19-frame deleción y son muy sensibles a EGFR TKI. células H1650 albergan una EGFR exón 19-frame eliminación y son resistentes a EGFR TKI. células H1975 llevan la mutación EGFR L858R-T790M y son resistentes a EGFR TKI. PC9GR resistencia adquirida a gefitinib por la exposición crónica de células PC9 al medio con concentraciones crecientes de gefitinib. Brevemente, las células fueron expuestas a PC9 10 gefitinib nM en medio que contiene 10% de FBS, y la concentración se aumentó de una manera escalonada. Las células que fueron capaces de crecer en 1 M gefitinib se obtuvieron 6 meses después de la exposición inicial.
Análisis Western Blot
Las células fueron cultivadas en 25 cm
2 frascos de cultivo sin ningún tipo de drogas y recolectadas en la fase de crecimiento de registro para la extracción de proteínas. Las células se lisaron en tampón de lisis RIPA que contiene 1 × PMSF y 1 × fosfatasa cóctel inhibidor. La concentración de proteínas de cada lisado se determinó usando el ensayo del ácido bicinconínico. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas se detectaron utilizando el kit de quimioluminiscencia (Thermo, Rockford, IL, EE.UU.).
Para la cuantificación de los niveles de proteína, las películas fueron digitalizadas y analizadas con el software de trabajo de laboratorio. Los niveles de proteína relativos se contaron usando una comparación con células PC9.
inmunoprecipitación y Ensayos de quinasa
Las células en la fase de crecimiento log se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis enfriado con hielo (40 mM Hepes pH 7,5, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, 1 x cóctel de inhibidores de fosfatasa, 1 ×-EDTA libre de cóctel inhibidor de proteasa que contiene 0,3% [w /v] CHAPS) [24]. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Se añadió una alícuota de 10 l de conjugado de perlas inmovilizadas con el anticuerpo indicado y se incubó con rotación durante 90 min a temperatura ambiente. Los inmunoprecipitados se lavaron cuatro veces con tampón de lisis CHAPS y una vez con el tampón de quinasa Rictor-mTOR (mM Hepes pH acetato de potasio 25 7,5, 100 mM, MgCl 1 mM
2). Los inmunoprecipitados se incubaron en un volumen final de 15 l durante 20 min a 37 ° C en tampón de quinasa Rictor-mTOR que contiene 500 ng de inactivo Akt1 /PKB1 o 4E-BP1 en presencia de ATP para la reacción de quinasa. La reacción se detuvo mediante la adición de 200 l de tampón enfriado con hielo de dilución de enzima (MOPS 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, 0,01% [w /v] Brij 35, 5% de glicerol, 0,1% de 2-mercaptoetanol, y 1 mg /ml BSA). Después de una breve centrifugación, el sobrenadante se eliminó del conjugado de perlas Sepharose y se analizó mediante inmunotransferencia. Los inmunoprecipitados fueron desnaturalizados y se resolvieron por SDS-PAGE, y los geles se tiñeron con un kit de tinción de plata.
se determinó evaluación de los efectos antiproliferativos
La viabilidad celular mediante el ensayo MTT, de acuerdo con el método de Mosmann y Carmichael [25], [26], y se estableció la linealidad entre el número de células y los valores de densidad óptica. La actividad antiproliferativa de tratamiento de agente único se evaluó en monocapas individuales, con las células cultivadas en placas de 96 pocillos. El número de células por pocillo fue 2,000 PC9, 2000 PC9GR, 1200 H1650, H1975 y 3.000 células. La
valor IC 50 fue la concentración que resulta en una inhibición del 50% del crecimiento celular después de una exposición de 72 h al fármaco en comparación con la de las células control no tratadas.
análisis de citometría de flujo de la célula ciclo de distribución
Las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
5 por pocillo y se dejan reposar toda la noche. A continuación, las células fueron tratadas durante 72 horas con ku-0063794 en IC
50 concentración. las células se tripsinizaron, se contaron, se lavaron, y se resuspendieron. Las células se sedimentaron después y se fijaron mediante la adición gota a gota de 70% de etanol enfriado en hielo, almacenada en PBS, y luego se resuspendieron en solución de yoduro de propidio (180 ug /ml) y se analizaron usando citometría de flujo.
Los pacientes con NSCLC
Los especímenes tumorales de gefitinib o pacientes tratados con erlotinib se obtuvieron a partir de Guangdong hospital general (Guangzhou, china). El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital General de la provincia de Guangdong. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. La presencia de la mutación de EGFR en cada muestra se confirmó mediante amplificación del exón específico (exones 18-21), seguido por la secuenciación directa o la amplificación sistema de mutación refractario Scorpion [27]. amplificación MET se analizó por reacción cuantitativa relativa en tiempo real cadena de la polimerasa [28].
p70S6K Inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica para p70S6K total y fosforilada se realizó en portaobjetos de vidrio cargados positivamente que contienen secciones de 5 micras de fijado en formalina, tejido incluido en parafina. Los portaobjetos se desparafinaron, seguido de rehidratación con concentraciones decrecientes de etanol en serie, y luego inmerso en 3% H
2O
2 para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Tras la recuperación de antígenos en tampón 1 mM de EDTA, pH 8,0, las secciones de tejido se incubaron con tampón de bloqueo (TBST /5% de suero normal de cabra) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpo 1:100. El sistema de detección de Envision se utilizó para la visualización, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina de Harris, deshidratados, y montadas de forma permanente.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
Todas las diapositivas fueron evaluados de forma independiente por dos patólogos que desconocían los casos. Los casos con tinción de & gt; 10% de las células fueron considerados positivos. reactividad inmunohistoquímica se clasifica en una escala de 0 a 3 de acuerdo con la intensidad de la tinción y el porcentaje de células inmunopositivas como sigue: 0, sin tinción; & Lt; 10% de células positivas; 1, tinción débil en & gt; 10% de las células tumorales o tinción moderada en el 10-40% de las células tumorales; 2, tinción moderada en & gt; 40% de las células tumorales o fuerte tinción en el 10-40% de las células tumorales; 3, una fuerte tinción en & gt; 40% de las células tumorales [29]
Estadísticas
Los resultados se presentan como media ± error estándar de al menos tres experimentos
Resultados..
Akt Ser473-FoxO1 vía de señalización del EGFR en células de NSCLC TKI-resistentes fue altamente activado en el Estado basal
la comprensión de las diferencias de señalización mTOR-asociado entre las células con CPNM EGFR TKI sensibles y resistentes a es fundamental para la orientación de mTOR para superar la resistencia del paciente después del tratamiento con ITC. Sin embargo, el conocimiento de las diferencias en las rutas de señalización entre las células de NSCLC EGFR TKI-sensibles y resistentes es insuficiente. Aquí, se seleccionaron primero cuatro líneas celulares de NSCLC diferentes que albergan diferentes mutantes de EGFR, y que difieren en la sensibilidad a la TKIs, como modelos celulares para el análisis de las diferencias de señalización de la vía en un estado basal por Western blot. Como se muestra en la Fig. 1, el mTOR total y fosforilados, proteínas Raptor, y Rictor tenía mayores niveles de expresión basales en las cuatro líneas celulares de NSCLC. Entonces, detectamos diferencias en la vía de señalización asociada mTORC2 determinando el estado de fosforilación de Akt Ser473 y FoxO1. Curiosamente, hemos encontrado que las líneas celulares EGFR TKI resistentes especialmente células H1650 (que albergan la deleción de EGFR en 19 exón y resistente a TKI) tenían mayores p-Akt niveles Ser473 que hizo células TKI sensibles (células PC9) y la expresión Ser473 p-Akt nivel en las células PC9GR (línea celular resistente adquirida a gefitinib) también era bastante alta. Este resultado es coherente con un informe que las células PC9GR han reducido la fosfatasa y tensina expresión homólogo, lo que llevó a la regulación positiva de los niveles de P-Akt Ser473 [30]. FoxO1 estado de fosforilación, que está regulado positivamente por el sitio Akt HM (Ser473) estado de fosforilación e inhibe la apoptosis de las células [31], fue casi en consonancia con los niveles de P-Akt Ser473 en las cuatro líneas celulares. También se detectó la expresión de p70S6K fosforilada y total, que es el sustrato de mTORC1 y se encontró que las cuatro líneas celulares tenían niveles más altos de fosforilación p70S6K. Tomados en conjunto, nuestros datos indican que las células EGFR NSCLC mutante tuvieron mayores niveles de expresión basales de mTOR, Rictor y Raptor y vía de señalización Akt Ser473-FoxO1 mTORC2 asociada fue hiperactivado en las células resistentes.
Las células fueron cultivadas en medio completo sin tratamiento farmacológico. Las proteínas se extrajeron a partir de células en la fase de crecimiento log, y los lisados celulares se inmunotransfirieron para detectar las proteínas indicadas. El experimento, repetido tres veces, se obtuvo resultados similares.
EGFR TKI resistentes a las líneas celulares de cáncer tenían Superior mTORC2 quinasa actividad, mientras que las células sensibles tuvieron mayor mTORC1 quinasa La actividad en el estado basal
sobre la base de los resultados anteriores, la hipótesis de que las células EGFR TKI-sensibles y resistentes tienen diferente actividad mTORC2 quinasa. A continuación, ensayamos la actividad de quinasa mTORC2 en las cuatro líneas celulares de NSCLC por inmunoprecipitación. En primer lugar, se utilizó el anticuerpo específico Rictor para tirar hacia abajo mTORC2 en el inmunoprecipitado. SDS-PAGE teñido con plata (Fig. 2A) mostró que las inmunoprecipitaciones fueron exitosos que también fueron verificados por Western blot de los inmunoprecipitados (Fig. S1). Akt Ser473 fue uno de los sustratos identificados de mTORC2 y varios documentos de la usó como un sustituto para representar la actividad mTORC2 [21], [24]. Por lo tanto, hemos utilizado la proteína recombinante inactiva, Akt1 /PKB, como un sustrato para reaccionar con el inmunoprecipitado
in vitro
, y luego detectado la Ser473 p-Akt. Como se muestra en la Fig. 2B, aunque la concentración de proteína de lisado celular en el inmunoprecipitado de células H1650 era menor que la de las otras tres líneas celulares, la actividad quinasa mTORC2 fue la más alta. De la Fig. 2B, también pudo ver que la actividad quinasa en las células PC9 mTORC2 fue el más bajo, y que en PC9GR y H1975 células tenido actividad quinasa intermedia. Estos resultados fueron casi consistente con los niveles Ser473 p-Akt mencionados anteriormente. También se detectó la actividad quinasa mTORC1
in vitro
para comparar las diferencias entre mTORC2 y mTORC1 actividades quinasa en las células NSCLC EGFR TKI-sensibles y resistentes. Higo. 2C mostró que también se retiró con éxito abajo mTORC1. Como se muestra en la Fig. 2D, aunque la concentración de proteína en inmunoprecipitado de células PC9 fue menor que en las otras tres células, la actividad quinasa mTORC1 fue la más alta. mTORC1 actividad quinasa fue menor en las células H1650 y H1975. A partir de la Fig. 2B y 2D, también pudieron ver que en las mismas células cuando se reguló la actividad quinasa mTORC2 la actividad quinasa mTORC1 se downregulated lo que indica que si mTORC1 y mTORC2 existen en equilibrio dinámico. Tomados en conjunto, nuestros resultados mostraron que aunque ambas células de NSCLC EGFR TKI-sensibles y resistentes tuvieron una mayor expresión mTORC1 y mTORC2 en el estado basal, las células EGFR TKI-resistentes tuvieron mayor actividad de la quinasa mTORC2, mientras que las células EGFR TKI sensibles tuvieron mayor mTORC1 quinasa actividad.
(A, C) SDS-PAGE teñido con plata de proteínas de los inmunoprecipitados mTORC2 y mTORC1 preparados a partir de lisados de células PC9 con Rictor (D16H9) mAb de conejo (Sepharose Bead conjugado) (# 5379) y Raptor (24C12 ) conejo mAB (Sepharose grano de Conjugado) (# 5382) adquiridas en CST, respectivamente. (B, D) La primera columna representa las concentraciones de proteína y Rictor Raptor, respectivamente, en los lisados celulares. Los niveles de proteína relativos se contaron usando una comparación con células PC9 que define como 1,00. Los inmunoprecipitados fueron utilizados en ensayos de quinasa con larga duración, de tipo salvaje Akt1 /PKB1 humana recombinante y 4E-BP1 como sustratos. La inmunotransferencia se usó para detectar la fosforilación de Akt /PKB en la Ser 473 y 4E-BP1 en thr 37/46, respectivamente. Los valores de la relación de p-Akt Ser473 /t-Rictor y p-4EBP1 /t-Raptor representan la actividad quinasa de mTORC2 y mTORC1 respectivamente. El experimento, repetido tres veces, se obtuvo resultados similares.
Ku-0063794 inhibe la proliferación celular en G1 y dio como resultado la detención del ciclo celular en células de NSCLC de EGFR TKI sensibles y resistentes a
selectivo inhibidores de mTOR, tales como ku-0063794, inhiben tanto mTORC1 y mTORC2 en diferentes líneas de células [32]. En este estudio, se evaluó los efectos antiproliferativos de ku-0063794 en células de NSCLC EGFR TKI-sensibles y resistentes en comparación con los de gefitinib que se informó previamente en nuestro laboratorio [17], [33]. Los datos indicaron efectos de dosis-respuesta de inhibición del crecimiento de células PC9, PC9GR, H1650, H1975 y. Tabla 1 y Fig. 3A mostró que Ku-0063794 inhibe la proliferación celular en las células NSCLC EGFR TKI-sensibles y resistentes a nanomolar (nM) concentraciones, mientras que gefitinib inhibe sólo las células PC9 a concentraciones nM. Se necesitan concentraciones mayores gefitinib (m) para llegar a la IC
50 valor en las células resistentes a TKI del EGFR, que supera en gran medida las concentraciones plasmáticas máximas en pacientes [34]. También se evaluó el ciclo celular después del tratamiento con ku-0063794 en IC
50 nivel por citometría de flujo y se encontró que las cuatro líneas celulares fueron bloqueadas en la fase G1 después de 72 horas de tratamiento ku-0.063.794, en particular células PC9 y PC9GR , en comparación con la de las células de control sin ningún tratamiento con fármacos (Fig. 3B).
(a) la inhibición de la eficiencia ku-0.063.794 en las cuatro líneas celulares de NSCLC. (B) Ku-0063794 inducida por la detención del ciclo celular tanto en células EGFR TKI-sensibles y resistentes. El panel superior representa las distribuciones del ciclo celular basales de la PC9, PC9GR, H1650 y H1975 líneas celulares, respectivamente, y el panel inferior representa las distribuciones del ciclo celular de PC9, PC9GR, H1650 y H1975 células después del tratamiento con el IC
50 concentraciones de Ku-0063794 de 72 horas.
Debido a ku-0063794 exhibió efectos antitumorales dramáticos, además se analizó su actividad antiproliferativa en el IC
50 concentración por Western blot. En primer lugar, hemos detectado estado de fosforilación mTOR después del tratamiento con ku-0063794 en el IC
50 concentraciones en las cuatro líneas celulares, respectivamente (Fig. 4A). Luego que además analiza el estado de fosforilación de mTOR señalización de proteínas de la ruta asociada (Fig. 4A). A través del software de trabajo de laboratorio cuantitativa de proteínas, se analizó la relación entre la proteína fosforilada más de proteína total en el estado basal y después del tratamiento con ku-0063794 en el IC concentraciones
50 en las cuatro líneas celulares (Fig. 4B). Como se muestra en la Fig. 4A y 4B, ku-0.063.794 estado de fosforilación de mTOR inhibe eficazmente y luego fosforilación inhibió de p70S6K que es un sustrato de mTORC1. De la Fig. 4B, también pudo ver que ku-0063794 en el IC
50 concentraciones no aumentó significativamente la expresión de Akt Ser473 p-especialmente en las células PC9 y PC9GR que podrían ser inducidas por rapamicina [16]. En realidad, las proporciones de p-Akt Ser473 /t-Akt en H1650 y H1975 células disminuyeron resultante en las proporciones reducidas de p-FoxO1 /t-FoxO1 en estas células en comparación con el que en el estado basal. Por lo tanto, ku-0063794, como un nuevo inhibidor de mTOR ATP-competitiva, mostraron un marcado efecto antiproliferativo y detención inducida G1 del ciclo celular tanto en células de NSCLC EGFR TKI sensibles y resistentes a
in vitro
.
las células (a) se trataron durante 72 horas con ku-0063794 en el IC
50 concentraciones, y lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia para detectar las proteínas indicadas. El experimento, repetido tres veces, produjo resultados similares. (B) Las relaciones de la vía de señalización mTOR asociados proteínas fosforiladas más de proteínas totales en el estado basal y después del tratamiento con ku-0063794 en el IC
50 concentraciones en las cuatro líneas celulares.
Los análisis clínica de EGFR TKI sensibles y resistentes a adenocarcinoma de pulmón tejidos mostraron mayor total y fosforilada p70S6K expresión en ambos tipos de cáncer sensibles y resistentes
Desde ku-0063794 en el IC
50 concentración inhibe eficazmente los niveles de fosforilación en tanto p70s6k células de NSCLC sensibles y resistentes, estos resultados indican que ku-0.063.794 puede ejercer mayores efectos antitumorales en tumores que expresan altos niveles de p70S6K, total o fosforilado. Se examinaron muestras de tumores de pacientes tratados con erlotinib o gefitinib--con-EGFR mutante NSCLC (Fig. 5). Todos los pacientes tuvieron una respuesta tumoral parcial clínica a gefitinib o erlotinib y posteriormente desarrollado resistencia a los medicamentos clínica. Se evaluó la expresión de p70S6K total y fosforilada en cinco pacientes mediante técnicas de inmunohistoquímica; uno con muestras pareadas obtenidas antes y después del tratamiento geftinib, dos con muestras sensibles a los medicamentos, y dos con muestras resistentes a los medicamentos. Detectamos el estado de la mutación T790M y amplificación de cumplirse en todos los especímenes resistentes a los fármacos. Ambas muestras de tumores sensibles a fármacos y resistentes a los fármacos tenían una mayor expresión total de p70S6K (Fig. 5B y 5C). También encontramos la expresión más alta p70S6K fosforilada en estos tumores. Estos hallazgos sugieren que los cánceres tanto sensibles a fármacos y resistentes tuvieron mayor expresión total y fosforilada p70S6K, y que p70S6K pueden ser un buen predictor de la respuesta a ku-0063794.
(A) Resumen de los tumores en gefitinib y los pacientes tratados con erlotinib, incluyendo tres casos sensibles a fármacos y resistentes, respectivamente. Caso 3 era una muestra emparejado antes y después del tratamiento con ITC. ADC representa adenocarcinoma. (B) Expresión de p70S6K total y fosforilada en los casos de TKI sensibles a EGFR. El panel superior representa p70S6K total y el panel inferior representa p70S6K fosforilada. (C) Expresión de p70S6K total y fosforilada en los casos de TKI del EGFR-resistentes. El panel superior representa p70S6K total y el panel inferior representa p70S6K fosforilada. ADC representa el adenocarcinoma; S y R representan entre mayúsculas y minúsculas y estuche resistente, respectivamente. Las barras de escala, 50 micras.
Discusión
vías de señalización del EGFR están implicadas en el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón. La unión de EGFR a su ligando EGF conduce a la dimerización e inicia una serie de cascadas de señalización corriente abajo a través de la PI3K-Akt-mTORC1, Erk, y las vías de STAT3 [35]. Estudios previos han demostrado que los patrones de señalización activadas por mutantes de EGFR difieren de las de tipo salvaje EGFR activado por ligandos, y que los mutantes de EGFR-sensibles resultantes de EGFR señalización constitutivamente activar y escapar de regulación negativa [36] - [39]. mutaciones de EGFR-sensibles se han convertido en los factores de predicción de efectos curativos para el ITC, y los beneficios clínicos dramáticos de los ITC se basan principalmente en un profundo conocimiento de las vías de señalización del EGFR mutantes sensibles. Por lo tanto, los cambios en la comprensión de las vías de señalización después que los pacientes desarrollan resistencia a los ITC del EGFR es muy importante para superar la resistencia. Varios mecanismos de resistencia TKI se han demostrado en los últimos años, incluyendo el mutante T790M [40], amplificación MET [7], y HGF sobreexpresión [8]. La mayoría de las estrategias actuales para superar la resistencia adquirida TKI-implican la orientación del mecanismo de resistencia en sí. Por ejemplo, la segunda generación de TKI irreversibles como BIBW 2992 para los pacientes con una mutación T790M y los inhibidores de la MET combinado con ITC del EGFR para la amplificación MET [7], [9] - [10]. A continuación, le ofrecemos una nueva perspectiva a buscar nuevas dianas moleculares para superar la resistencia mediante el análisis sistemático de señalización de la vía diferencias entre las células con CPNM EGFR TKI sensibles y resistentes a
in vitro
. Nuestros datos muestran que la vía de señalización Akt mTORC2 asociada Ser473-FoxO1 fue muy activa en las células NSCLC TKI del EGFR-resistentes en el estado basal y
in vitro
mTORC1 y mTORC2 actividades quinasa verificó estos resultados. (Fig. 1 y 2). Estos resultados indican que la orientación mTOR incluyendo mTORC2 podría lograr mejores efectos antitumorales
mTOR es un controlador central del crecimiento celular, la proliferación, el metabolismo, y la angiogénesis.; Sin embargo, los inhibidores de mTOR actuales, tales como RAD001, muestran actividad clínica modesta contra el CPNM tratados previamente [14]. De hecho, la rapamicina dirigida sólo un subconjunto de las actividades intracelulares de mTORC1. La rapamicina inhibe la actividad de la quinasa alostéricamente mTORC1 mediante la unión del distal proteína celular FKBP12 al sitio activo de quinasa [15]. En algunos casos, mTORC1 es sensible a la rapamicina y completamente inhibe la fosforilación S6K1 mTORC1 mediada. Como se informó anteriormente, la rapamicina induce la fosforilación de Akt Ser473 lo que reduce su efecto antitumoral a través de Akt Ser473-FoxO1 vía de señalización debido al relieve de votaciones de S6K-IRS-PI3K señalización [16], [41]. En realidad, la fosforilación de Thr308 Akt está regulada positivamente por PI3K-PDK1 y la fosforilación de Ser473 Akt es controlada positivamente por mTORC2 [20], lo que sugiere que si la inhibición de mTORC1 sería promover la actividad quinasa mTORC2. Nuestros datos indican un equilibrio dinámico entre mTORC1 y mTORC2 que debe ser confirmada en los próximos estudios (Fig. 2B y 2D) y explican por qué los efectos mediados RAD001 son débiles en todas las líneas celulares de cáncer
in vitro
. Los resultados sugieren que tanto mTORC1 y mTORC2 deben dirigirse.
Los nuevos inhibidores de mTOR competitivos con ATP (
e
.
g
., Torin1, PP242, ku-0063794 y WAY-600), que inhiben tanto mTORC1 y mTORC2, ejercen efectos sobre la síntesis de proteínas, el crecimiento celular y la proliferación de células marcadas, y promover enérgicamente la autofagia en diversos tipos de células del cáncer de
in vitro
[32], [ ,,,0],42]. Estos inhibidores de mTOR se encuentran todavía en la primera etapa de evaluación; Por lo tanto, su potencial terapéutico para el cáncer sigue siendo incierto. De hecho, los inhibidores de mTOR novedosos, tales como Torin1 y PP242, tienen efectos antiproliferativos que están mediadas principalmente por la inhibición completa de mTORC1, pero no mTORC2 [43], [44]. Nuestro anterior documento y el documento de La Monica ambos han demostrado que las células con CPNM EGFR TKI-resistentes fueron insensibles a everolimus (RAD001), y everolimus podrían sinergizar con gefitinib que proporcionó otra estrategia alternativa para superar EGFR TKI la resistencia [17], [45] . En nuestro estudio, encontramos que la orientación de mTOR con ku-0063794 también produce mejores efectos antitumorales y redujimos G1 del ciclo celular en las células sensibles y resistentes a través de ensayo de MTT y citometría de flujo análisis que debería reforzarse aún más mediante ensayos de capacidad de formación de colonias (CFC) en el futuro; no hemos encontrado detención significativa con el ciclo celular G1 a pesar de la proliferación celular se inhibe en células H1975 por ku-0063794, que tal vez principalmente debido a otras formas de muerte celular como la apoptosis o la autofagia. Los indicadores de apoptosis y /o la autofagia podrían investigarse más a fondo en el futuro (figura 3B.); los siguientes efectos antiproliferativos de la orientación mTOR indicaron que ku-0063794 no sólo inhibe los niveles de fosforilación p70S6K, sino también los niveles de fosforilación inhibe parcialmente FoxO1 y no upregulate los niveles de fosforilación de Akt Ser473 (Fig. 4). En conjunto, nuestros datos y los de un informe anterior [46] sugieren que la falta de un aumento en los niveles de fosforilación de Akt Ser473 puede haber sido debido a la inhibición de mTORC2; promoviendo así efectos antitumorales. En realidad, las posibles funciones específicas de mTORC2 en las células NSCLC TKI del EGFR-resistentes eran todavía desconocidos y deben ser estudiados más a fondo en los próximos estudios. Además, hemos encontrado que las células resistentes a TKI del EGFR fosforilación Ser473 tuvieron mayor Akt. Como se informó anteriormente, Akt perifosine inhibidor han demostrado mejores efectos antiproliferativos en recaída /refractario de Waldenstrom Macroglobulinemia [47] y Jeong et al informaron también que inhibidor de Akt y el inhibidor mTORC1 aumentaron sinérgicamente la muerte celular en células de NSCLC [48]. Todo esto sugiere que los inhibidores de Akt puede ser otra buena alternativa de tratamiento para los tumores insensibles TKI.