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PLOS ONE: Análisis de Sistemas de ATF3 en respuesta al estrés y el cáncer revela efectos opuestos sobre pro-apoptóticos genes en la vía de p53


Extracto

inducible por estrés factores de transcripción juegan un papel fundamental en la adaptación celular al medio ambiente para mantener la homeostasis y la integridad del genoma. La activación de factor de transcripción 3 (ATF3) es inducida por una variedad de condiciones de estrés e inflamatorias y se sobreexpresa en muchos tipos de células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes pleiotrópicos funciones de ATF3 han seguido siendo difícil de alcanzar. Aquí empleamos el análisis de sistemas para identificar objetivos en todo el genoma de ATF3 que es inducida ya sea por un agente de alquilación metanosulfonato de metilo (MMS) o sobre-expresado en una línea de células tumorales de próstata LNCaP. Se demuestra que el estrés inducido y ATF3 asociada al cáncer es reclutado a 5.984 y 1.423 blancos, respectivamente, en el genoma humano, el 89% de los cuales son comunes. En particular, los objetivos ATF3 son altamente enriquecido para no sólo los motivos ATF /CRE sino también los sitios de unión de varios otros factores de transcripción inducibles por estrés que indican una amplia red de factores de respuesta al estrés en la regulación transcripcional de los genes diana. Un análisis más detallado de los efectos de ATF3 caída en estos objetivos reveló que ATF3 inducida por el estrés regula los genes en las vías metabólicas, el ciclo celular, la apoptosis, la adhesión celular y la señalización de la insulina incluyendo, p53, Wnt, y las vías de VEGF. ATF3 asociada a cáncer participa en la regulación de distintos conjuntos de genes en procesos tales como la señalización de calcio, Wnt, p53 y las vías de la diabetes. Notablemente, ATF3 inducida por el estrés se une a 40% de los objetivos de p53 y activa los genes pro-apoptóticos tales como TNFRSF10B /DR5 y BBC3 /PUMA. ATF3 asociada al cáncer, por el contrario, reprime estos genes pro-apoptóticos, además de CDKN1A /p21. Tomados en conjunto, nuestros datos revelan una amplia red de factores de transcripción inducibles por estrés y demuestran que ha ATF3 opuestos, efectos de células dependientes del contexto sobre los genes diana de p53 en respuesta al daño del ADN y el desarrollo del cáncer

Visto:. Tanaka Y, Nakamura A, Morioka MS, Inoue S, Tamamori-Adachi M, Yamada K, et al. (2011) Análisis de Sistemas de ATF3 en respuesta al estrés y el cáncer Revela efectos opuestos sobre pro-apoptóticos genes en la vía de p53. PLoS ONE 6 (10): e26848. doi: 10.1371 /journal.pone.0026848

Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América

Recibido: 15 de agosto de 2011; Aceptado: 4 de octubre de 2011; Publicado: 26 Octubre 2011

Derechos de Autor © 2011 Tanaka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones a SK (18012015, 18055008 y 21590302) y una beca para Y. T. (20510183) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Los factores de transcripción juegan un papel importante en la regulación temporal de la expresión génica en la estimulación con suero de células humanas [1], [2]. adaptación celular a diversas condiciones de estrés ambiental también está regulada por factores de transcripción que coordinadamente modular la expresión de genes implicados en el mantenimiento de la homeostasis celular y la integridad genética. Tal sistema juega un papel importante no sólo para la supervivencia de las células normales, sino también la resistencia de las células cancerosas a metabólica y tensiones genotóxicos. Un paso crucial hacia la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a las respuestas al estrés es la identificación de los genes diana de cada factor de transcripción. Los estudios en levaduras que emplean perfiles de expresión génica [3], [4], más recientemente, el análisis y sistemas mediante inmunoprecipitación de la cromatina de factores de transcripción [5] han puesto de manifiesto unas redes de todo el genoma de los factores de transcripción que regulan la expresión de los genes que orquestan ciclo celular, la transcripción de genes, la síntesis de proteínas, y la reparación del ADN en respuesta a MMS. En los mamíferos, el supresor de tumores p53 desempeña un papel fundamental en la respuesta al daño del ADN a través de control de la transcripción de varios cientos de genes [6], [7]. Es importante destacar que sólo un pequeño subconjunto de los objetivos de p53 se activa bajo condiciones específicas [8], lo que indica que, o bien la unión de p53 a los objetivos [9] - [11] o trans-activación del potencial de las proteínas p53 [12], [13] Puede haber afectada por moléculas accesorias.

ATF3 es un miembro de la familia ATF /CREB de la cremallera de base de leucina (b-Zip) tipo de factores de transcripción [14] y es un sensor de estrés altamente versátil para una amplia gama de condiciones incluyendo la hipoxia, la desnutrición, estrés oxidativo, estrés ER, y varios tipos de estrés genotóxico [15], [16], así como las reacciones inflamatorias [17], [18]. ATF3 también es activado por la estimulación con suero y aguas abajo de c-Myc [19], y es frecuentemente sobreexpresado en varios tumores, incluyendo los de la próstata [20], de mama [21], y los linfomas de Hodgkin [22]. Es importante destacar que varias líneas de evidencia ha indicado un vínculo estrecho entre ATF3 y señalización de p53 vías. Por lo tanto, ATF3 se induce aguas abajo de p53 sobre el daño del ADN y funciona como un efector de muerte celular mediada por p53 [6], [23] - [25]. Además, ATF3 potencia p53 mediante la unión y la inhibición de su ubiquitilation directamente, lo que implica que ATF3 puede modular la actividad de p53 [26], [27]. Por otra parte, ATF3 parece conferir un voto negativo a la vía de p53 por abajo de la regulación
TP53
la expresión de genes [28], la recapitulación de una regulación por retroalimentación similar de genes de citoquinas inflamatorias por ATF3 [17]. Corroborando un modelo de retroalimentación negativa, un estudio reciente ha demostrado que ATF3 es inducida por ciclosporina, un inmunosupresor, y promueve el cáncer de piel por abajo de la regulación
TP53
[29]. Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que ATF3 interactúa con la vía de p53 tanto como un efector aguas abajo de la muerte celular mediada por p53 y como un regulador positivo y negativo de la señalización de p53.

Alteración en la interacción entre ATF3 y factores de transcripción tales como p53 en diferentes tipos de células y /o condiciones ambientales pueden explicar en parte los efectos de distintas ATF3 sobre el destino celular (es decir, pro-apoptóticos o promotora del crecimiento de las células no transformadas o células malignamente transformadas, respectivamente) [21]. El trabajo previo de nuestro laboratorio también ha descrito las funciones pleiotrópicos de ATF3 bajo diversas condiciones de estrés [18], [19], [25], [28], [30]. A continuación se llevó a cabo el análisis de sistemas de objetivos ATF3 y se identificaron miles de sitios de unión ATF3 en el genoma. Se demuestra que ATF3 constituye una red de regulación de genes ampliamente superposición con otros factores de transcripción inducibles por estrés y regula el ciclo celular, la muerte celular, la adhesión, y varias vías de señalización, incluyendo p53. Notablemente, ATF3 se une a 40% de los objetivos conocidos de p53 y regula la muerte celular por apoptosis a través de co-activación de un subconjunto de genes pro-apoptóticos respuesta de estrés, mientras que la represión de los mismos objetivos en las células cancerosas que expresan constitutivamente ATF3. Se discutirán posibles mecanismos de conmutación entre las funciones ATF3 pro-apoptóticos y pro-supervivencia.
análisis
Resultados

Sistemas identifica miles de objetivos ATF3 en el genoma humano

Para identificar genómico objetivos de ATF3, análisis de inmunoprecipitación de la cromatina se llevó a cabo usando la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 estimulada por MMS y línea celular de cáncer de próstata LNCaP que expresa constitutivamente ATF3. Como se informó anteriormente [24], MMS tratamiento de las células HCT116 inducidas expresión transitoria de ATF3 alcanzando un pico a las 6 horas después de la estimulación (Fig. 1A), mientras que no se detecten niveles más elevados de proteínas ATF3 después de 3 horas y alcanzó un nivel máximo a las 12 horas de la estimulación (Fig. 1B). Se preparó ADN genómico a partir de células o bien HCT116 tratados con MMS durante 6 horas o células LNCaP no tratadas, se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-ATF3, y se hibridó a RefSeq HG18 arrays promotor de mosaico humanos de NimbleGen. Posteriormente, la detección de picos se llevó a cabo mediante análisis basado en modelos de matrices de 2 colores (MA2C) paquete [31], que reveló una inesperada gran número de objetivos ATF3 en un punto de corte de 0,2% FDR (Fig. S1A y S1B) . Se identificaron 5.984 y 1.423 blancos de ATF3 en las células HCT116 tratados con MMS y células LNCaP, respectivamente, 1.269 (es decir, 89%) de los cuales eran esquiladas entre los dos modelos. (Fig. 1C). No se detectaron objetivos en el cromosoma Y de HCT116 consistente con su origen femenino. También se identificaron con éxito trece objetivos ATF3 que había sido previamente demostrado ser regulada por ATF3 en varios tipos de células.

(A) RT-PCR análisis de ATF3 en las células HCT116 tratadas con 50 ng /ml MMS. (B) Análisis de transferencia Western de proteínas ATF3 en las células HCT116 tratadas con MMS. (C) los objetivos comunes y únicas de ATF3 en células HCT116 y células LNCaP.

Motivos de factores de transcripción asociados con el estrés están sobrerrepresentados en los objetivos ATF3

ATF3 podrían ser reclutados para sus objetivos o bien uniéndose directamente a una secuencia de reconocimiento consenso TGACGTCA o alternativamente mediante la interacción con otros factores de transcripción, incluyendo un gran número de proteínas b-Zip [14], [32]. Para evaluar si el ATF /motivo CRE o cualquier otro motivos factor de transcripción se enriquecen entre los objetivos potenciales ATF3, el número de promotores en los objetivos ATF3 contiene al menos un golpe de un motivo determinado en la base de datos TRANSFAC fue analizado por el P-Match algoritmo (Fig. S2). La Tabla 1 resume el enriquecimiento de un motivo dado como se representa por el número de promotores en objetivos ATF3 que contienen el motivo restado por el número de promotores en un conjunto de genes de fondo que contiene el mismo motivo. Como era de esperar, la ATF /CRE sitios de unión fueron los motivos más enriquecidos en objetivos ATF3 (
p-valor para los objetivos
-HCT116 específica: 3,76 × 10
-40 a 4,34 × 10
-22,
p-valor
para los objetivos comunes de HCT116 y células LNCaP: 0 a 4.20 × 10
-6). Por otra parte, la distancia física entre las secuencias de ATF /CRE predichos de la exploración motivo y ATF3 picos del análisis ChIP estaba dentro de un rango de unos pocos cientos de pares de bases (es decir, cerca de la resolución del análisis de chips) para la mayoría de los objetivos ATF3 (Fig . 2). Por el contrario, no hubo tal asociación entre BRCA1 y motivos no relacionados GATA1 y picos ATF3 (Fig. 2). En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la mayoría de los picos ATF3 del análisis de chip puede ser explicada por la unión directa de ATF3 a motivos ATF /CRE.

Distribución de la distancia física entre ATF /CRE, BRCA1, y GATA1 motivos contra objetivos ATF3 de picos ATF3 identificados por el análisis de chip. ATF3 picos coinciden en gran medida con la ATF /CRE motivos, pero no muestran ninguna asociación con los genes BRCA1 y GATA1 motivos no relacionados.

Curiosamente, la exploración motivo también reveló que los sitios de unión de otros factores de transcripción inducibles por estrés eran altamente sobrerrepresentadas en los objetivos ATF3 en respuesta al daño del ADN (Tabla 1). Estos reguladores importantes incluidos de estrés ER (DDIT3, NF-E1), hipoxia (HIF-1a), el estrés UV (USF2, RFX1), el estrés oxidativo (c-ETS), y el daño del ADN (NF-Y, E2F, EGR- 1, FOXJ2, Sp1). Es de destacar que los miembros de la familia B-Zip (AP-1, DDIT3, y USF2) tienen un potencial de heterodimerize con ATF3 [33] y SP1 se ha informado de interactuar físicamente con ATF3 [34]. Por tanto, es posible que ATF3 es reclutado para un subconjunto de sus objetivos de forma indirecta a través de la asociación con otros factores de transcripción inducibles por estrés.

ATF3 regula los procesos biológicos distintos en respuesta al estrés y en el cáncer

Después de haber establecido objetivos potenciales de ATF3 en el genoma, el próximo objetivo fue identificar aquellos genes cuya expresión está regulada por ATF3. Con este fin, se evaluó el impacto de ATF3 desmontables de siRNA (Fig. 3A) sobre los patrones de expresión génica a las 0, 6, 12, y 24 horas después de la estimulación por MMS utilizando Agilent Plenario del Genoma Humano Microarray. Después de la normalización de matrices usando un grupo de mantenimiento de la casa genes (Fig. S3 A), (es decir, 28.872 sondas de cada 43.925) se encontraron dos terceras partes de los genes que se expresen por encima de los niveles de fondo en las células HCT116 (Fig. S3B). Por el contrario, 90% de los objetivos ATF3 se expresaron por encima de niveles de fondo, lo que sugiere que ATF3 asocia preferentemente con genes transcritos activamente. A nivel global, la comparación de las señales (log relación
2) entre el control y desmontables células reveló un impacto limitado de ATF3 baja regulación de transcriptoma (Fig. S3 B y S3C).

(A) HCT116 las células fueron transfectadas con cualquiera de siRNA para ATF3 (siATF3) o siRNA revueltos (siCONTROL) y se trataron con MMS para 0, 3, y 6 horas. Cantidad de proteínas ATF3 se analizó por transferencia Western con β-actina como control de carga. MMS induce ATF3 a los 3 y 6 horas después de la estimulación, que está bloqueado de manera significativa por siATF3. Mapa de representación (B) El calor de los niveles de expresión de genes a las 0, 6, 12, y 24 horas después de la estimulación MMS para objetivos conocidos de ATF3 (panel superior) o factores de transcripción que motivos de unión están sobre-representados en los objetivos ATF3 (panel inferior). Las señales se normalizan contra aquellos en el tiempo 0 de siCONTROL y los niveles relativos o proporción entre siATF3 /siCONTROL están codificados por color de 2
-2.5 a la 2
2,5.

Un análisis más detallado del chip objetivos -identificado de ATF3 indicaron que la expresión de 6-30% de genes se vieron afectados por ATF3 desmontables por debajo de 0,8 veces o por encima de 1,2 veces a diferentes puntos de tiempo después de la estimulación MMS. Para identificar los procesos biológicos regulados por ATF3, la cartografía vía se llevó a cabo utilizando DAVID [35] para un subconjunto de objetivos ATF3 ya sea hacia abajo o hasta reguladas por ATF3 desmontables (prueba exacta de Fisher modificada
p-valor
& lt; 0.1). Como se resume en la Tabla 2, ATF3 inducida por el estrés se asocia con diversos procesos celulares, tales como las vías metabólicas (azúcares, aminoácidos, lípidos), los procesos anabólicos y catabólicos (esteroide y la biosíntesis de ácido fólico, ubiquitilation, ciclo de la urea), la generación de energía (ciclo TCA , la fosforilación oxidativa), el ciclo celular, la apoptosis, la adhesión, citoesqueleto, y las vías de señalización (ErbB, p53, insulina, Wnt, VEGF).

a continuación, para identificar objetivos potenciales de ATF3 en asociada a cáncer ATF3, que lleva a cabo la precipitación ATF3 y de perfiles de expresión utilizando células LNCaP (Fig. S4). análisis de mapeo Pathway de subconjuntos de genes, ya sea hacia abajo-regulada (& lt; 0,8 veces) o hasta reguladas (& gt; 1,2 veces) por desmontables de ATF3 se resume en la Tabla 3. constitutivamente expresado ATF3 en las células LNCaP parecía estar involucrado en biológico procesos bastante diferentes de las de las respuestas al estrés, incluyendo la adhesión celular, la diabetes mellitus, y la señalización (ErbB, p53, Wnt, calcio) con poca asociación con los procesos metabólicos. Tomados en conjunto, estos datos indican que las vías metabólicas, el ciclo celular, la apoptosis y la señalización de insulina y VEGF son objetivos únicas de ATF3 inducida por el estrés, mientras que la diabetes mellitus y la señalización del calcio, pero no del ciclo celular y la apoptosis, son objetivos únicas de ATF3 expresan en Células cancerígenas. La posible relación entre la diabetes y la vía ATF3 como se encuentra en nuestro estudio es consistente con un estudio reciente que muestra que ATF3 activada en las células adiposas obesos contribuir a la resistencia a la insulina a través de la baja regulación de la adiponectina y un transportador de glucosa GLUT4 [36].


dañan el ADN inducido por ATF3 activa un subconjunto de genes pro-apoptóticos de la vía de p53

identificación de vía de p53 como nosotros un objetivo potencial de ATF3 llevó a analizar una mayor regulación de los genes diana de p53 por ATF3 . En primer lugar analizamos cuántos de p53 objetivos previamente conocidas [6] también son objetivos de ATF3 en nuestro chip de ensayo. Se encontró que ATF3 inducida por el estrés fue reclutado a tantos como 40% (es decir, 97/244) de p53 objetivos, dando a entender por primera vez que una gran fracción de p53 objetivos puede ser transcripcionalmente co-regulados por ATF3. A continuación, se evaluó el impacto de la caída ATF3 sobre la expresión de los objetivos comunes de ATF3 y p53 en diversos puntos temporales después de la estimulación de las células HCT116 por MMS. Como se ilustra en mapa de calor en la Fig. 4A (relación de las señales en siCONTROL y siATF3), la mayoría de ellos son ligeramente las reguladas por caída ATF3 incluyendo genes pro-apoptóticos como BBC3 /PUMA, TNFRSF10A /DR4 y TNFRSF10B /DR5.

(A) mapa de calor representación de los niveles de expresión de genes a las 0, 6, 12, y 24 horas después de la estimulación MMS para objetivos comunes de ATF3 y p53. Las señales se normalizan contra aquellos en el tiempo 0 de siCONTROL y niveles relativos o la relación entre siATF3 /siCONTROL están codificados por color de 2
-2.5 a la 2
2,5. Los genes se agrupan de acuerdo a los patrones de expresión después de la estimulación MMS: una, fuertemente activados; b, fuertemente reprimida, c, débilmente activa; d, mezclado; e, débilmente reprimido. La mayoría de los genes son débilmente las reguladas por caída ATF3, mientras DNMT1 es una excepción que está regulado por la caída ATF3. (B) El análisis cuantitativo de RT-PCR de ATF3 y objetivos pro-apoptóticos de p53. Los niveles de expresión en las células transfectadas con siATF3 hash (bares) se indican en relación con quienes tienen el control (barras blancas). contraste micrografía (C) Fase de las células HCT116 después del tratamiento con 50 MMS ng /ml para 12 horas en presencia de siCONTROL o siATF3. (D) Número de células HCT116 en vivo después del tratamiento con 50 ng /ml de MMS durante 0, 8, 12, y 24 horas en presencia de siCONTROL (círculos abiertos) o siATF3 (círculos cerrados). (E) activación de la caspasa 3, medida por sus productos escindidos. células HCT116 se transfectaron con siCONTROL o siATF3 y se trataron con 50 ng /ml de MMS para 0, 3, 6, y 12 horas. Los extractos celulares se sometieron a análisis de Western blot utilizando anticuerpos contra ATF3, β-actina, la caspasa 3 y caspasa 3. escinden la punta de flecha indica la caspasa 3 escindida del peso molecular predicho.

A fin de evaluar la la función de ATF3 en la expresión del gen diana de p53, se realizó un análisis cuantitativo de RT-PCR de genes pro-apoptóticos en las células estimuladas con MMS pre-transfectadas con cualquiera de control de siRNA o siATF3. Como se muestra en la Fig. 4B, ATF3 caída causó reduce significativamente la inducción de la TNFRSF10A /DR4, TNFRSF10B /DR5, y BBC3 /PUMA por tratamiento MMS. A continuación analizamos los efectos de ATF3 expresó ectópica de p53 genes diana utilizando luciferase reporteros que albergan promotores proximales con un motivo ATF /CRE como se muestra en la figura. 5A. La co-transfección de las células HCT116 con la prensa de luciferasa y vectores de expresión ATF3 resultó en la activación significativa de TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, y DDIT4 (Fig. 5B), consistente con los datos de microarrays que muestra que desmontables ATF3 causado expresión atenuada de estos genes (Fig. 4A). Por el contrario, el gen de la vimentina, que fue reprimida por tratamiento MMS (Fig. 4A), no se ha activado de manera significativa por la expresión ectópica de ATF3 (Fig. 5B).

(A) El constructo indicador de luciferasa que contiene DR5- un fragmento del promotor de DR5 -1226 (sitio PstI) a 1 (codón AUG) que fue subclonado en PicaGene PGV-B2. motivos ATF /CRE (ATF) y motivo de p53 (p53) se indican. (B) los ensayos de reportero de luciferasa duales para TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, DDIT4, y VIM. células HCT116 se transfectaron con cada reportero y se estimularon con 50 ng /ml de MMS para 12 horas. Firefly luciferase actividad se normalizó la actividad de luciferasa CMV-Renilla. (C) de ensayo de luciferasa dual usando tipo salvaje o ATF3
- /-. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) guía empresas
Para dilucidar la función de ATF3
in vivo
, nos aprovechamos de los ratones deficientes en ATF3 recientemente establecida en nuestro laboratorio ([37]). Fibroblastos embrionarios de ratón fueron transfectadas con DR5-reporteros de luciferasa y se estimularon con MMS. Curiosamente, la pérdida de ATF3 causó redujo significativamente los niveles de la actividad del promotor basal DR5 como se muestra en la Fig. 5C, lo que sugiere que la expresión de DR5 basal era dependiente de ATF3. Además, la activación inducida por el MMS de promotor DR5 se redujo aproximadamente a la mitad en ATF3
- /- células en comparación con las células de tipo salvaje, lo que implica que la activación inducida por daño en el ADN de DR5 era parcialmente dependiente de ATF3. Tomados en conjunto, estos deficitaria y la ganancia de la función de los estudios demuestran que ATF3 activa seleccione los objetos de p53.

dañan el ADN inducido por ATF3 sensibiliza a las células a la muerte celular

Para evaluar la significación biológica de la cruz -Habla entre ATF3 y p53, a continuación analizaron el efecto de la caída ATF3 sobre la viabilidad celular después de la estimulación por MMS. Como se muestra en la Fig. 4C y 4D, hubo un mayor número de células HCT116 transfectadas con siATF3 que las transfectadas con siRNA de control después del tratamiento MMS. Tal diferencia en el número de células podría reflejar ya sea un aumento del crecimiento celular o disminución de muerte celular. Para abordar esta cuestión, se analizó la activación de la caspasa 3, una característica de la muerte celular por apoptosis, por Western blot. Como se muestra en la Fig. 4E, desmontables de ATF3 causó reducción de la activación de la caspasa 3 como se juzga por la producción de caspasa escindido 3. Estos datos son consistentes con la activación mediada por ATF3 de genes pro-apoptóticas (Fig. 4B, la Fig. 5) y sugieren fuertemente que el ADN el daño inducido por ATF3 contribuye a la muerte celular inducida por el estrés mediante la co-activación de un subconjunto de los genes diana de p53.

ATF3 asociada con el cáncer promueve la proliferación celular y la apoptosis
inhibe
Curiosamente, desmontables de ATF3 en células LNCaP causaron aumento de p21 proteínas (Fig. 6A) concomitante con la reducción del crecimiento celular (Fig. 6B). Estos resultados son consistentes con los informes anteriores que sugiere un papel de ATF3 en la proliferación celular en el cáncer [20], [22], [38] y el crecimiento celular inducida por c-Myc [19]. Además, el análisis actual de las vías ATF3 reguladas en las células LNCaP (Tabla 3B) ha indicado que hasta 13 genes en la vía de p53 podrían ser activados por ATF3. Para evaluar el efecto de ATF3 sobre la muerte celular mediada por p53, se realizó un análisis cuantitativo de RT-PCR de genes pro-apoptóticos en la vía de p53. Como se ilustra en la Fig. 6C, ATF3 caída causada regulación de FAS, TNFRSF10B /DR5, BBC3 /PUMA, y CASP10 así como CDKN1A /p21, lo que sugiere que ATF3 regula negativamente la muerte celular inducida por p53 y aumenta la proliferación celular a través de la inhibición de la expresión de p21.

(a) análisis de transferencia de Western de ATF3 y p21 en las células LNCaP transfectadas con siCONTROL o siATF3 con β-actina como control de carga. (B) Número de células viables a las 0, 3 y 5 días después de la transfección con siCONTROL (círculos abiertos) o siATF3 (círculos cerrados). (C) RT-PCR cuantitativa análisis de genes pro-apoptóticos en vía de p53 y p21 después de la transfección. Los niveles de expresión en siATF3 (bares hash) con relación a los de siCONTROL (barras blancas) se indican.

Discusión

Hemos demostrado que dañan el ADN inducido por ATF3 une a casi un tercio de los promotores humanos RefSeq. La identificación de un gran número de objetivos tales no es excepcional, ya que E2F1 y MYC son conocidos por ser reclutados a & gt; 20.000 y & gt; 17.000 objetivos, respectivamente, en el genoma humano [39], y INO4 levadura se ha informado de obligar a 1.078 objetivos tras la estimulación MMS [5]. El número de objetivos de ATF3 asociada a cáncer era más pequeña que la del ADN ATF3 daño inducido, reflejando tal vez los dos niveles más altos y mayor plegable inducción de ATF3 en respuesta MMS que los conseguidos por desmontables de ATF3 en las células LNCaP (datos no mostrados) . Sin embargo, el ensayo fue notablemente consistente ya que también se encontraron 89% de los objetivos en las células LNCaP en las células HCT116 tratadas con MMS, y once de 41 objetivos ATF3 previamente conocidos, incluyendo EGR1 [40] y HIF-2A [30] podría ser identificado. Un compendio de los datos ATF3 chip-ss de la base de datos ENCODE (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaibTfbs/) también indica que una proporción significativa de los objetivos ATF3, es decir, el 37,6% (768/2041 ) en K562 (leucemia), 71,9% (742/1032) en HepG2 (hígado), y el 76,2% (809/1062) en H1 de células madre (células madre embrionarias), se comparte con los objetivos de 2711 en GM12878 (linfoblastoide), que que podría considerarse conservadoras cifras dadas las variaciones de calidad de los datos chip-ss (que afecta la sensibilidad de detección de pico) y la diferencia en los tipos de tejidos.

en particular, los enlaces de los sitios de varios otros factores de transcripción inducida por daño en el ADN (NF y, E2F, YY1 /NF-E1, FOXJ2, SP1), la irradiación UV (USF2, RFX1), y el estrés oxidativo (c-Ets) fueron significativamente más representadas en los objetivos ATF3 (Tabla 1) que indica una extensa red de éstos factores de respuesta al estrés (Fig. S6). Una posible explicación para tal coincidencia de factores de transcripción relacionados con el estrés es que ATF3 podría sinergizar con estos factores de transcripción para modular la expresión del gen diana. Alternativamente, los objetivos ATF3 identificados por el análisis ChIP pueden incluir unión indirecta de ATF3 través de la interacción con otros factores de transcripción inducidos por el estrés. De hecho, ATF3 es un miembro de una gran familia de factores de transcripción de tipo bZip, incluidas las identificadas en el estudio actual (es decir, AP-1, DDIT3, y USF2), que forman heterodímeros homo y con diferentes afinidades de las variantes de la consenso ATF /CRE motivo [32]. Además, Sp1 encontró en el análisis actual se sabe que interacciona físicamente con ATF3 [33], [34]. Se requieren estudios adicionales para determinar el papel de los factores de transcripción inducibles por estrés, especialmente los que no se sabe que interactúan con ATF3 antes, en unión de ATF3 a sus genes diana
.
El presente estudio indica que el impacto de ATF3 en cada expresión del gen diana no es todo o nada efectos. Más bien, los efectos de ATF3 en muchas pero seleccione genes, tales como los implicados en el ciclo celular y la muerte celular, ascendieron colectivamente resultado biológicamente significativo como la muerte celular para ATF3 en respuesta al estrés (Fig. 4C-E) o el crecimiento de células de cáncer asociados ATF3 (Fig. 6B). Por otra parte, nuestro estudio muestra que sólo el derribo 6-30% de los posibles objetivos de ATF3 se regula directamente por ATF3 de acuerdo con informes anteriores que muestran que sólo el 25% de los objetivos de p53 [6], el 26% de los objetivos de STAT1 [41], y 11% de los objetivos del factor de transcripción de levadura se ven afectados por caída de genes [5]. Se han propuesto varios mecanismos para p53 para explicar por qué sólo un subconjunto de los posibles objetivos responder a manipulaciones de p53, incluyendo estados epigenéticos de los genes diana, la ocupación promotor con polimerasas de ARN, y el reclutamiento de co-factores esenciales [42]. Mecanismos similares pueden ser responsables de los efectos de genes selectivos de ATF3. Alternativamente, las múltiples formas de complejos ATF3, como hetero-dímeros con diferentes proteínas bZip, podrían subyacer a efectos diferenciales de ATF3 sobre genes diana.

En los últimos años, un número creciente de estudios han indicado que tiene ATF3 pleiotrópicos funciones dependiendo del contexto celular. Es importante destacar que, nuestro estudio reveló que ATF3 inducida por el estrés y ATF3 asociada a cáncer tienen efectos opuestos sobre p53 y Wnt vías: vía de p53 se activa en respuesta al estrés (Fig. S5) consistentes con la función de ATF3 en la muerte celular mediada por p53 [6 ], [23] - [25], mientras que la vía Wnt se activa en el cáncer como se informó anteriormente en un estudio en ratones transgénicos ATF3 desarrollo tumores de mama [43]. Se podría argumentar que la diferencia en las bases genéticas y /o tipos de tejidos entre las células HCT116 y células LNCaP podría haber influido en la función de ATF3. De hecho, ATF3 parece desempeñar papeles distintos en diferentes tejidos: ATF3 actúa como un supresor de tumores en el cáncer colorrectal [24], [44] mientras que es oncogénica en cáncer de próstata [20], cáncer de mama [21], cáncer de piel [29] , y el linfoma de Hodgkin [22]. Nuestros resultados en las células HCT116 (colon) y las células LNCaP (próstata) son consistentes con esta hipótesis.

Las alteraciones de la función reguladora de ATF3 se destaca por nuestra conclusión de que ATF3 es necesaria tanto para la activación y represión de los pro -apoptotic genes tales como BBC3 /PUMA y TNFRSF10B /DR5 en respuesta al estrés y el cáncer. Es de destacar que los efectos opuestos de ATF3 sobre la expresión de ciclina D1 se han documentado anteriormente: ATF3 se une a AP-1 con motivos y activa la ciclina D1 en células de hepatoma de ratón estimulados por mitógenos [45], mientras que se une a la ATF sitio /CRE y reprime la ciclina D1 en fibroblastos de ratón estimuladas por suero [46]. En la literatura, hay amplios precedentes de factores de transcripción que tienen funciones opuestas dependientes del contexto en el desarrollo del cáncer ([47] y de referencia en el mismo). KLF4, por ejemplo, se activa p21 y p53 reprime ambos de los cuales son suprimidas por Ras activado resultante en la detención del crecimiento en ausencia de Ras o transformación de fenotipo en presencia de Ras. Alternativamente, un estudio reciente ha demostrado que se requiere el factor Kruppel-como 5 (KLF5) para la transcripción Myc en la proliferación de células epiteliales, pero es esencial para la represión mediada por TGFb de MYC [48]. Diferencial unión de KLF5 a elemento inhibidor TGF en presencia o ausencia de TGF fue propuesto como un mecanismo de los efectos opuestos. Se requieren estudios adicionales para determinar si las combinaciones de ATF3 y otros factores de transcripción pueden cambiar la función del ATF3 en objetivos específicos.

La resistencia de las células tumorales a diferentes condiciones de estrés sigue siendo un problema importante. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de la función de los mecanismos de respuesta al estrés celular en el cáncer de la resistencia a la hipoxia [49] o agentes quimioterapéuticos [50] es aún limitada. Nuestra conclusión de que ATF3 tiene efectos opuestos sobre los genes pro-apoptóticos sugiere que se debe tener cuidado para potenciar o bloquear la función de ATF3 en un nuevo enfoque para la terapia del cáncer. Comprensión adicional del mecanismo de conmutación de la función ATF3 como un activador transcripcional o represor podría ayudar a desarrollar estrategias para manipular selectivamente un subconjunto de ATF3 genes diana para ayudar al tratamiento de cánceres resistentes a la quimioterapia.

Materiales y Métodos

Ética declaración

Todo el trabajo con animales se aprobó y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de los Comités de experimentos con animales y los experimentos con ADN recombinante de Tokio la Universidad médica y Dental (Licencia Nº 2010-205).

Los plásmidos

reporteros de luciferasa para DR5 [51], GADD45A [52], PUMA [53], y vimentina [54] fueron regalos de tipo Dr. Toshiyuki Sakai (Kyoto Prefectural University, Japón), el Dr. Kazuhiro Daino (Instituto Nacional de Ciencias radiológicas, Japón), el Dr. Jian Yu (La Universidad Johns Hopkins Oncology Center, EE.UU.), y el Dr. Susan Rittling (El Instituto Forsyth, EE.UU.), respectivamente. El indicador de luciferasa DR5 se reconstruyó subclonando un fragmento del promotor del DR PstI (-1226) para el codón AUG en el vector PicaGene PGV-B2 (Toyo B-Net Co., Ltd., Japón). El vector de expresión pCI-ATF3 se describió anteriormente [55].

Cultivo de células

células de carcinoma colorrectal humano HCT116 y células de carcinoma de próstata LNCaP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (EE.UU.). Cuarenta y ocho horas antes de la estimulación por MMS, medio de cultivo de las células HCT116 se reemplaza con el medio que contiene 0,25% de FCS. Veinticuatro horas después, las células HCT116 se transfectaron con cualquiera de ARNsi de control o mediante el uso de siATF3 X-tremeGENE siRNA reactivo de transfección. EN-TARGETplus siRNA se utiliza la piscina de SMART de Dharmacon para desmontables de ATF3.

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