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PLOS ONE: Análisis de genoma completo en células de cáncer colorrectal humano revela mediada por la expresión de los genes de la isquemia de la motilidad a través de ADN Hypomethylation


Extracto

hipometilación del ADN es una importante modificación epigenética observado que se producen en muchos diferentes tipos de cáncer, lo que lleva a la regulación positiva de genes previamente silenciados y la pérdida de la estabilidad genómica. Hemos demostrado anteriormente que la hipoxia y la hipoglucemia (isquemia), dos cambios comunes micro-ambientales en los tumores sólidos, disminuyen la metilación del ADN a través de la regulación a la baja de DNMTs en células de cáncer colorrectal humano. En este caso, se utilizó un enfoque de plataforma cruzada de todo el genoma para identificar los genes regulados positivamente hypomethylated y por la isquemia. Después de la exposición a la hipoxia o hipoglucemia, ADN metilado a partir de células de cáncer colorrectal humano (HCT116) se inmunoprecipitó y analizada con una gran variedad promotor de Affymetrix. Además, el ARN se aisló y se analizó en paralelo con un array de expresión Affymetrix. software de análisis de vías, el ingenio reveló que una proporción significativa de los genes regulados positivamente hypomethylated y estuvieron involucrados en el movimiento celular, incluyendo
PLAUR
y
CYR61
. Un ensayo de invasión Matrigel reveló que de hecho las células HCT116 cultivadas en condiciones de hipoxia o hipoglucemia han aumentado la capacidad de movilidad. Confirmación de la expresión regulada por incremento de genes movimiento celular se realizó con qPCR. La correlación entre la isquemia y la metástasis está bien establecida en la progresión del cáncer, pero los mecanismos moleculares responsables de esta observación común no han sido claramente identificados. Este novedoso datos sugieren que la hipoxia y la hipoglucemia pueden estar conduciendo los cambios en la metilación del ADN a través de la regulación a la baja DNMTs. Este es el primer informe a nuestro conocimiento de que proporciona una explicación para el aumento de potencial metastásico observada en las células isquémicas;
es decir
que la isquemia podría ser la conducción hipometilación del ADN y el aumento de la expresión de genes celulares movimiento

Visto:. Skowronki K, J Andrews, Rodenhiser DI, Coomber BL (2014) Análisis de genoma completo en Humana células de cáncer colorrectal Revela mediada por la expresión de los genes de la isquemia de la motilidad a través de ADN hipometilación. PLoS ONE 9 (7): e103243. doi: 10.1371 /journal.pone.0103243

Editor: Hassan Brim, Howard University, Estados Unidos de América

Recibido: 14 Febrero, 2014; Aceptado: 30 de junio de 2014; Publicado: 31 de julio 2014

Derechos de Autor © 2014 Skowronski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue financiado por una Beca de Investigación#020094 en BLC y la RD del Instituto de Investigación Sociedad canadiense del cáncer (http://www.cancer.ca/research/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

los tumores sólidos son sometidos a un proceso fundamental conocido como angiogénesis (reclutamiento de neo-vascularización) con el fin de mantener niveles adecuados de oxígeno y nutrientes a la expansión de la masa [1]. los vasos sanguíneos del tumor son altamente anormal y debido a la tasa de crecimiento del tumor que excede la velocidad de la angiogénesis, las áreas de un tumor se desarrollan reducción del flujo sanguíneo, o isquemia [2]. Además de otros cambios, las regiones isquémicas tendrán áreas de la hipoxia y la hipoglucemia, y mientras que el impacto de la hipoglucemia en la tumorigénesis no está bien estudiado, el papel de la hipoxia en la progresión del cáncer está bien documentado e incluye el aumento de la inestabilidad genética, y estimulando la invasión de células y angiogénesis, lo que contribuye a la metástasis [3].

movimiento celular /migración es un paso crítico en la metástasis, que es la causa de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer [4]. Una variedad de cambios moleculares puede causar una célula para ser móviles y viajar en el sistema linfático o vascular, llevando eventualmente a arrestar a un nuevo sitio en el cuerpo [5]. Las células dentro de un ambiente isquémico tienen un potencial metastásico superior a través de la regulación positiva de genes, como
VEGF
para estimular la angiogénesis, y
uroquinasa activador del plasminógeno gratis (
UPA
) que activa la plasmina para degradar la ECM [5]. A través de la estabilización de una subunidad del factor de transcripción sensible a la hipoxia, HIF1α, hipoxia conduce la expresión de estos dos genes, y muchos otros, la promoción de la metástasis. Las células también pueden volverse más móviles a través de la reprogramación epigenética. Varios genes relevantes, tales como
UPA
[6] y
S100A4
[7] han alterado los patrones epigenéticos en las células cancerosas, lo que permite la morfología celular para ser modificado a un estado más favorable metastásico. Lo que queda es desconocido si las modificaciones epigenéticas y la isquemia están vinculados en la promoción de la metástasis tumoral.

metilación del ADN es un mecanismo epigenético importante que regula la expresión de genes [8]. ADN metilado se asocia con el silenciamiento transcripcional, ya que los grupos metilo en los residuos de citosina cambiar la configuración del ADN y por lo tanto impiden que los factores de transcripción de unión a [9], así como la activación de la contratación de represores y cromatina enzimas modificadoras que silencian más expresión a través de condensación de la cromatina [10], [11]. Varios metiltransferasas de ADN (DNMT) catalizan la conversión de citosina a 5-metilcitosina [12], con las DNMTs más estudiados siendo DNMT1 (metiltransferasa mantenimiento) y DNMT3a y DNMT3b (

de novo methyltransferases) [13] .

En el cáncer, se observan dos interrupciones comunes a los patrones de metilación del ADN: la hipermetilación del promotor específico y hipometilación mundial [14]. La mayoría de los estudios se han centrado en la hipermetilación del ADN y el impacto que el silenciamiento de genes supresores de tumores tiene en la iniciación del tumor, progresión y pronóstico. hipometilación del ADN, por otra parte ha sido opacado por la amplia atención a la hipermetilación del ADN en la terapia del cáncer, a pesar de que la hipometilación fue la primera interrupción epigenética observado en el cáncer [15], [16]. A pesar de la falta inicial de entendimiento en relación con la importancia de la hipometilación del ADN en el cáncer, ahora se sabe que las secuencias repetitivas se convierten en desmetilado y conducen al caos genómica [17], [18]. Al igual que con la hipermetilación del ADN, la hipometilación puede ser específica del sitio, lo que contribuye a una mayor expresión [16]. Además de estos efectos específicos de gen, la inestabilidad genómica, pérdida de impresión [19] y la activación X-cromosoma anormal también contribuyen a la tumorigénesis [20].

Hoffmann y Schultz [16] la hipótesis de que la hipometilación del ADN acelera el la adaptación de las células cancerosas a la microambiente dinámica a través de la selección de determinadas funciones génicas, tales como la motilidad. La evidencia de esta teoría radica en el activador del plasminógeno uroquinasa
(UPA
) de genes. Una serina proteasa implicada en la degradación de la matriz extracelular,
UPA
se ha demostrado que tiene una región promotora hypomethylated, dando lugar a un exceso de expresión tanto en el cáncer de mama y de próstata y está directamente asociado con el aumento de invasiva y potencial metastásico [ ,,,0],6].
El melanoma antígeno asociado gratis (
MAGE
) es otro de los grupo de genes que se encuentran desmetilado y aumentada en muchos tipos de cáncer como el melanoma, colorrectal, gástrico y cáncer de pulmón de células no pequeñas [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25]. En general, múltiples mecanismos pueden ser responsables de la desregulación de la metilación del ADN en el cáncer. La sobreexpresión de DNMTs ha sido reportado en muchos tipos de cáncer diferentes [26] y explica la hipermetilación aberrante, pero menos atención se ha ido a la comprensión de la hipometilación del ADN, a pesar de que la hipometilación del ADN desempeña un papel igualmente importante en la modificación del epigenoma del cáncer
.
Nuestro trabajo anterior descrito una nueva relación entre la isquemia y la metilación del ADN, con la reducción de metil citosina observada en las células de las regiones isquémicas de los tumores [27]. También se encontró que en las células HCT116 humanos con cáncer colorrectal, DNMT1, DNMT3a, y la expresión DNMT3b y las actividades se redujo en un
in vitro
la hipoxia y la hipoglucemia [28]. Estos cambios en la expresión y la actividad fueron concurrentes con la hipometilación del
p16
INK4a
promotor de la región en condiciones de hipoglucemia [28]. En el presente estudio, hemos explorado la expresión y los cambios de metilación en las células HCT116 a nivel de todo el genoma, utilizando un enfoque de plataforma cruzada para identificar genes regulados por condiciones isquémicas. Teniendo en cuenta nuestros resultados anteriores, combinada con la observación frecuente de aumento potencial metastásico en los tumores isquémicos, la hipótesis de que el aumento de la motilidad celular de células de cáncer colorrectal humano en condiciones de isquemia se debe a la regulación positiva de genes de la motilidad asociadas, y que estos cambios en la expresión son impulsados ​​por la hipometilación del ADN mediada por isquemia.

resultados

copia Mínimo número de variación

el número de copias de genes en las células HCT116 se evaluó con la Affymetrix SNP 6.0 para determinar si, y en qué medida, las células que utilizamos habían desplazado /mutado en cultivo en comparación con el cariotipo original de esta línea celular. Cuando se compara con un cariotipo humano normal mezclado de la base de datos de proyecto internacional HapMap [29], las células carecían de anomalías cromosómicas extensivas (Figura 1). Nosotros observamos regiones en 8q, 10q, 16q, 17q y que muestra las ganancias cromosómicas regionales (indicado en rojo), como se informó anteriormente por otros [30]. Muy pocos pérdida completa de copias fueron vistos (azul), excepto para el cromosoma Y, que ha sido informado de que se ausente en 50 a 100% de las células HCT116 [31]. Por lo tanto, en comparación con otras líneas celulares de cáncer, HCT116 tiene un cariotipo normal y relativamente estable con inestabilidad cromosómica mínima [30].

Números (y X /Y) corresponden a los cromosomas, y MT representa ADN mitocondrial. Los resultados se compararon con un conjunto de datos de Affymetrix que contiene 270 muestras de poblaciones mixtas del Proyecto Internacional HapMap [29]. Regiones en gris indican que no hay cambio en el número de copias, el rojo indica un aumento de número de copias, y azul una pérdida de número de copias. Esta matriz se realizó por duplicado.

Hipoglucemia impactos más genes que la hipoxia

Se realizó un análisis de expresiones para evaluar cuantitativamente cambios de expresión génica en las células HCT116 en condiciones isquémicas. Los arrays de expresión indicado que después de la exposición a la hipoxia durante 48 horas, las células HCT116 tenían 310 y 1081 genes arriba y hacia abajo reguladas, respectivamente. Cuando las células fueron expuestas a la hipoglucemia, 1052 y 2433 genes fueron arriba y hacia abajo-regulados, respectivamente (Tabla 1). El análisis de la metilación del promotor utilizando Affymetrix suelo de baldosas serie 1.0R reveló que la hipoxia resultó en 1386 genes hypomethylated y 1655 genes hypermethylated. El crecimiento en condiciones de hipoglucemia resultó en 1940 genes hypomethylated y 1980 genes hypermethylated (Tabla 1). Por lo tanto, ambos patrones de metilación del promotor de expresión y se afecta en mayor medida la hipoglucemia, según lo medido por el número total de genes cambiado de manera significativa.

Cruz-plataforma de análisis

A continuación, se evaluó la funcional significado de la expresión génica estos complejos y perfiles (metilación del ADN) epigenéticos. Utilizando el Partek Software Suite, genes únicos que fueron regulados al alza y hypomethylated (así como hypermethylated y regulados a la baja) se recubrieron con el fin de identificar los cambios en la expresión de genes asociados con cambios en la metilación del promotor. Hubo 58 genes únicos hypermethylated y regulados negativamente por las condiciones de hipoxia, y 161 genes por hipoglucemia (datos no mostrados). Nos centramos en los genes que se hypomethylated y el aumento en la expresión, ya que nuestro trabajo anterior mostró DNMTs fueron reprimidos en la isquemia. Hemos observado que los 18 y los 96 genes únicos se hypomethylated y upregulated por hipoxia e hipoglucemia, respectivamente (Figura 2). listas parciales de estos genes pueden verse en las tablas 2 y 3, con la lista completa se presenta en la Tabla I en la información S1.

El número de genes que eran ambos hypomethylated significativamente y regulada positivamente por la hipoxia (A) y la hipoglucemia ( B) se indican en las regiones solapadas.

Ingenuity Pathway Analysis de los genes regulados positivamente hypomethylated y

ingenio Pathway Analysis (IPA) se utilizó para analizar y clasificar los genes regulados positivamente hypomethylated y en vías funcionales, con el fin de entender mejor la importancia biológica de los genes de nuestro conjunto de datos. El software determina si una función biológica se enriquece en un conjunto de datos mediante el examen de toda la lista de genes para las anotaciones funcionales que se encuentran en la base de conocimientos ingenio, y la realización de una prueba exacta de Fisher comparando la relación de los genes con una anotación dada en el conjunto de datos contra la proporción de genes que tiene la misma anotación en el conjunto de la población (
es decir
todos los genes en la matriz 2.0 HG U133 Plus). Si la primera relación es significativamente mayor que el segundo, entonces se dice que la lista para ser enriquecido para los genes que tienen que
anotación
Con la exposición a la hipoxia, las tres principales funciones celulares de nuestra lista de genes regulados positivamente fueron hypomethylated /.: célula a célula desarrollo de tejido conjuntivo (Figura 3) de señalización, movimiento celular, y. La hipoglucemia enriquecido para los cambios en la muerte celular, el ciclo celular, y la regulación de la expresión génica (Figura 4). Aunque no está dentro de la parte superior unos categorías funcionales, movimiento celular fue también una función enriquecido en el grupo hipoglucemiante. También se realizó análisis de redes para proporcionar una representación gráfica de las relaciones biológicas conocidas de los genes hypomethylated y upregulated. Las redes se generan mediante la determinación de una molécula de enfoque y, a continuación, el examen de las listas de genes para la mayoría de las conexiones a la molécula objetivo, en base a la literatura base de datos de Ingenuity. Las redes principales (los que tienen la mayoría de las conexiones) tanto para la hipoxia y la hipoglucemia implicados genes que tienen un papel en el movimiento celular. En condiciones de hipoxia,
PLAUR, LDLR
, y
LAMB3 gratis (Figura 5 A) estaban todos en una red y todos se han demostrado estar involucrados en el movimiento celular. La red superior en condiciones de hipoglucemia incluye genes movimiento celular
ETS1, KLF4, IL6ST, NEDD4L
, y
ANR gratis (Figura 5B). Es importante señalar que algunos genes en nuestra lista pueden tener funciones /anotaciones que la base de datos de ingenio no reconoce biológicos. A modo de ejemplo,
AFAP1L1
no estaba en la lista de Ingenio de genes implicados en el movimiento celular, sin embargo, hay pruebas para el papel de esta molécula en la migración y la invasión [32]. Con base en el análisis de las vías de IPA y redes funcionales, la categoría de "movimiento celular" parecía interesante y relevante y seguir desarrollándose los genes asociados con estas funciones para la validación de matriz.

base de datos de Ingenuity Pathways Analysis se utiliza para asignar los genes a las funciones biológicas y determinar las funciones que se enriquecieron, basada en la significación estadística.

base de datos de Ingenuity Pathways Analysis se utiliza para asignar genes a las funciones biológicas y determinar las funciones que se enriquecieron, en base a la significación estadística.


Las redes principales (la mayoría de las conexiones a molécula central) de los genes regulados positivamente hypomethylated y se muestran tanto la hipoxia (a) y la hipoglucemia (B). La intensidad de la coloración roja de las moléculas refleja el nivel de expresión como se encuentra en array de expresión (significa más oscuros mayor incremento en la expresión en comparación con las condiciones de control).

genes de migración asociada se enriquecen en la hipoxia y hipoglucemia

El análisis multi-plataforma de los genes regulados positivamente hypomethylated y por la hipoxia y la hipoglucemia reveló una serie de genes que están involucrados en el movimiento celular:
LDLR, LAMB3, ALDOA, PLAUR, SCAI, España y
NEDD4L
en el grupo de hipoxia (Figura 3), y
ITGB1, ETS1, IL6ST, las ANR, TJP1, SMAD3, TMOD3, LATS2, KLF4, ADI1, NCOA3, PTEN, CSNK2A2, TRIO, CSNK2A1, BRD4, RTN4, SEMA3C, NEDD4L
,
CYR61, TFPI, España y HEY1 en el grupo hipoglucémico (Figura 4). Además de estos genes, se observó que otros dos que fueron hypomethylated y upregulated probable que también participan en el movimiento celular.
ANKRD37
y
AFAP1L1
en el "grupo hipóxico 'han demostrado estar involucrados en la migración y la invasión de las células cancerosas (Tabla 2). Muchos de los genes "movimiento celular" en nuestro análisis están involucrados en la mediación de la unión celular, ya sea a otras células o la ECM, o en la degradación de ECM, todos los procesos necesarios para que una célula se mueven dentro de los tejidos y para entrar en los vasos sanguíneos.

Confirmación del aumento de la expresión de genes celulares movimiento

Se utilizó QRT-PCR para cuantificar la expresión de los genes seleccionados de ambos grupos de hipoxia e hipoglucemia. Elegimos a centrarse en los genes que participan en el movimiento celular identificado en el análisis multiplataforma como upregulated y hypomethylated. Para el grupo de hipoxia, examinamos
PLAUR
,
AFAP1L1
, y
LAMB3
. Tanto PLAUR y LAMB3 se upregulated significativamente en la hipoxia, en comparación con las condiciones de control (Figura 6A). Los factores de cambio en la expresión de estos dos genes como determinados por qRT-PCR eran comparables a la tapa de cambio visto en la matriz de expresión (Tabla 2). Los genes evaluados por los cambios de expresión por QRT-PCR en condiciones de hipoglucemia incluyen
EPHA2
,
ANR
,
NEDD4L
, y
CYR61
. Los cuatro de estos genes se upregulated en la matriz de análisis de expresión y hypomethylated en el suelo de baldosas gama promotor, excepto EPHA2 no se hypomethylated de acuerdo a la matriz de promotor. regulación al alza significativa de EPHA2, NEDD4L y CYR61 en caso de hipoglucemia fue confirmada por QRT-PCR (Figura 6B).

niveles de ADNc a partir de células HCT116 cultivadas en hipoxia (A) y la hipoglucemia (B) se realizaron mediciones de los genes de interés y normalizado a ß-actina, y de controlar. N = 5 para no oxígeno y N = 3 para no glucosa. * Indica diferencia significativa con respecto al control;
p
≤0.05.

isquémicos condiciones mejoran la motilidad HCT116

Se llevaron a cabo ensayos de invasión para determinar los efectos de la isquemia sobre la motilidad celular. Después de 48 horas en condiciones de isquemia, era evidente que las células expuestas a la hipoxia y la hipoglucemia habían aumentado significativamente las capacidades de movilidad e invasivos como se determina por la capacidad de las células para degradar y migrar a través de Matrigel (Figura 7). Este ensayo funcional apoya nuestra conclusión de que la expresión elevada de los genes de movilidad asociada a través de la hipometilación promotor en condiciones isquémicas se traduce en cambios fenotípicos en las células HCT116.

imágenes de células tomadas a 10 aumentos, de la parte inferior de los cultivos polarizados cubiertos de-Matrigel (UN). Las células de refracción de luz (negro) indican que estas células migran a través de la membrana Transwell. Promedio del número de células HCT116 que invadió transwells Matrigel recubiertos después de 48 horas de exposición a oxígeno (NO) y no a la glucosa (NG), seguido de 24 horas en los cultivos polarizados (B). * Indica una diferencia significativa del control;
p
. & Lt; 0,01

Discusión

En este estudio, hemos utilizado un enfoque multi-plataforma de identificación de los cambios en todo el genoma en la metilación del promotor y la expresión génica para descubrir cómo aguda expresión del gen metilación mediada por los efectos de la isquemia en las células del cáncer colorrectal humano. Se identificaron y verificamos que los genes implicados en la mejora de movimiento celular están regulados bajo condiciones de isquemia, representados por la hipoxia y la hipoglucemia
in vitro
.

La isquemia aguda se presenta con frecuencia en los tumores sólidos, debido a la dinámica de la vasculatura del tumor y la rápida expansión de los tumores superior a la angiogénesis [2]. Hemos establecido anteriormente que la isquemia aguda conduce a la baja regulación de contenidos tanto metilcitosina celular y la expresión DNMT y la actividad [27], [28]. Para perseguir este hallazgo e identificar qué genes se hypomethylated y regulada positivamente por la isquemia en una escala mundial, utilizamos plataformas que comparten la base común de la tecnología Affymetrix para facilitar las referencias cruzadas de conjuntos de datos. de este modo se utilizó un solo paquete de software de bioinformática (Partek Genómica Suite) para importar, analizar y correlacionar los datos en bruto de las distintas plataformas de microarrays [33]. De nuestro estudio multi-plataforma de todo el genoma, encontramos condiciones isquémicas genes implicados en la motilidad celular y la invasión upregulated significativamente, y estos genes habíamos demethylated regiones promotoras identificadas por las matrices. Por lo tanto, nuestra multiplataforma analiza punto a un conjunto de genes que aparecen en respuesta a la hipoxia ambiental y la hipoglucemia alterada a través de la metilación de CpG.

Los estudios anteriores han demostrado que algunos genes mediada HIF1 (
por ejemplo, CA9, EPO
) exigir al CpG dentro del elemento de respuesta a la hipoxia (HRE) a ser desmetilado con el fin de HIF1 de unirse, y la expresión que se produzca [34] - [36]. S100A4, un miembro de la familia S100 de Ca
2 + unión a proteínas, se sabe están involucrados en la motilidad de células de cáncer por su capacidad para activar la miosina no muscular, y se ha demostrado estar relacionado con la progresión del cáncer gástrico [ ,,,0],34]. S100A4 se upregulated por la hipoxia en el cáncer de ovario, con la metilación reducida de la EDH en
S100A4
's regiones promotoras y el aumento de la unión de HIF1 [7]. Estos estudios proporcionan evidencia de apoyo hacia el concepto de que se requiere hipometilación en condiciones de hipoxia para la expresión de genes que se produzca.

Un gen relevante significativamente upregulated y hypomethylated por la hipoxia de nuestro análisis multi-plataforma es el activador del plasminógeno uroquinasa receptor, o PLAUR , el receptor de activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA). de uPA es una serina proteasa que cataliza la conversión del plasminógeno en plasmina, que a su vez degrada la ECM [35]. PLAUR está implicado en el movimiento celular y la metástasis [36] y expresión aumenta durante la transición crítica de adenoma displásico severa a carcinoma invasivo en el cáncer colorrectal [35]. Además, PLAUR está regulada positivamente en la hipoxia [37] a través de la actividad de HIF1 [38], y es responsable de la invasión de hipoxia mediada por células HCT116 en [39]. A su vez, la UPA ligando está regulada por el factor de transcripción ETS1, y los sitios de unión para ETS1 en el
UPA
promotor también debe desmetila para la transcripción que se produzca [40].

La laminina beta 3 (LAMB3), una subunidad de la laminina-5 (laminina-332), es una proteína de membrana basal pensado para mediar la unión celular, la migración y organización de las células durante el desarrollo embrionario. expresión LAMB3 es mayor en carcinoma de células escamosas de esófago maligno que en el tejido normal, y la expresión se correlaciona con la profundidad de la invasión y la supervivencia [41]. LAMB3 También se ha informado de que se hypomethylated y upregulated en el cáncer gástrico [42]. Se confirmó que LAMB3 fue aumentada en condiciones de hipoxia en el CCR. Curiosamente, un estudio examinó las biopsias de adenocarcinoma de colon, y vio laminina-5 tinción positiva se asoció con ciernes células cancerosas localizadas en la punta de invadir el epitelio maligno, y que la laminina-5 colocalized con PLAUR [43].

Además de
PLAUR
y
LAMB3
,
S100A10
fue otro gen regulados positivamente tanto por la hipoxia y la hipoglucemia en base a nuestro análisis de matriz, y se ha demostrado ser importante en la célula de cáncer la invasión y la metástasis a través de colocalización con sistema uPA /PLAUR [44]. S100A10 se sobreexpresa en el cáncer gástrico [45] y es esencial para la migración de macrófagos asociada a tumores en sitios de tumor [46]. Somos los primeros en informar de que
PLAUR
y
LAMB3
parecen ser objetivos de genes clave en la hipometilación isquemia-mediada, similar a
S100A4
. PLAUR, LAMB3 y S100A10 podrían estar trabajando en conjunto entre sí para aumentar la movilidad celular en tumores hipóxicos. Se necesitan más estudios para determinar si estas proteínas se colocalized en el tejido hipóxico.

rica en cisteína 61 (CYR61) es un miembro de la familia CCN de factores de crecimiento. CYR61 es conocida para ligarse superficie celular y la ECM, y está implicado en la adhesión celular, la proliferación y la migración [47]. Hemos identificado
CYR61
como un gen que responde a la hipoglucemia. expresión CYR61 se incrementa en una variedad de tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, melanoma, glioma, gástrico, colon, vejiga, próstata y páncreas [47]. El silenciamiento de CYR61 en el osteosarcoma y las células de los carcinomas del esófago condujo a la migración reducida y la invasión de células [48], [49]. expresión CYR61 se ha demostrado que se correlaciona con la agresividad de las células de cáncer de páncreas, lo que demuestra aún más el papel de este factor de crecimiento en la metástasis [47]. Hasta la fecha, no existen estudios que muestran que
CYR61
expresión está regulada por la metilación del promotor. Sin embargo, la expresión CYR61 está regulado por el factor de transcripción STAT3 [50], y otros han demostrado que el CpG en el sitio de unión de STAT3 requiere desmetilación para STAT3 de atar y expresar sus genes diana [51].

Otros dos genes que se upregulated en nuestro análisis de hipoglucemia fueron
EPHA2
y
NEDD4L
. EPHA2 es un receptor tirosina quinasa transmembrana, que se sobreexpresa en muchos carcinomas, incluyendo el cáncer colorrectal etapa temprana [52], y su expresión está altamente correlacionada con la invasión tumoral y la metástasis [53]. NEDD4L es una ubiquitina ligasa E3 demostrado tener una mayor expresión con la progresión del cáncer de vesícula biliar. El uso de siRNA, el silenciamiento de NEDD4L condujo a la disminución de la invasión de Matrigel y el colágeno de las células de cáncer de vesícula biliar, y su papel en la invasión es posiblemente debido a su asociación con MMPs [54]. En la actualidad, no existen estudios que demuestran que el promotor desmetilación podrían ser responsables de la regulación positiva de cualquiera de estos dos genes.

antígenos asociados al melanoma (magos) son un grupo de genes cuya expresión es silenciada en la mayoría de los tejidos somáticos normales, excepto en el testículo, pero aumentada en muchos tipos de cáncer [22]. Un estudio mostró que la región promotora de
MAGE-A1
contiene dos sitios de unión ETS que debe ser demethylated para el factor de transcripción para unirse y expresión a ocurrir [55]. La desmetilación y la expresión se observaron en varias líneas celulares de cáncer diferentes, y el tratamiento con 5-aza-dC aumento de la expresión de MAGE-A1 en fibroblastos normales debido a la desmetilación en la región promotora. La expresión de MAGE-A1 y -A4 se ha demostrado que se correlaciona con el estadio de la enfermedad en pacientes con melanoma [23]. Tanto desmetilación y la expresión de MAGE-A3-A1 y se ha visto en el cáncer colorrectal [22] y en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde la expresión correlaciona con mal pronóstico [24]. Nuestra gama de datos indicaron que dos genes MAGE se desmetilados por la hipoxia (
MAGEA11
) e hipoglucemia (
MAGEB1
), aunque no se observó la inducción de la expresión. Sin embargo, los magos son un grupo de genes que apoyan la importancia de los residuos de CpG desmetilados en el factor de transcripción sitios de unión, y que la desmetilación en el cáncer puede ser específico del gen.

Dos otros genes implicados en el movimiento celular,
AFAP1L1
y
ANR
, que se determinó que eran significativamente upregulated en la hipoxia y la hipoglucemia por los microarrays, respectivamente, fueron también cuantificados mediante qRT-PCR. Ambos de estos genes no demostró incremento en la expresión que fue controlado por QRT-PCR, posiblemente debido a la hibridación cruzada de secuencias no específicas o variantes de corte y empalme, dos razones más comunes para las discrepancias entre los resultados de microarrays y QRT-PCR [56].

Hay suficiente evidencia en la literatura que apoya el concepto de que los CpG dentro diferente factor de transcripción sitios de unión (como HRE, STAT3 y ETS) deben ser desmetilados a fin de que la transcripción que se produzca, y lo más importante, algunos de estos genes están involucrados en el aumento de la motilidad celular. En este estudio, hemos contribuido a este importante concepto, proporcionando evidencia a través del análisis conjunto de plataforma cruzada para otros genes de movimientos celulares que son a la vez hypomethylated y upregulated por la isquemia. Hemos validado cambios en la expresión de los genes movimiento celular PLAUR, LAMB3, EphA2, NEDD4L, y Cyr61 en condiciones de isquemia. Es bien conocido que los niveles de HIF1α son más altos en mama y metástasis de cáncer de colon [3]. Esta observación complementa nuestro hallazgo de que la hipoxia disminuye la metilación, y que una disminución en la metilación en el CpG de HREs entonces podría facilitar la unión HIF y la expresión del gen promotor. Tal disminución inducida por hipoxia de los niveles de DNMT es un evento temprano en tumores primarios. Las células con la disminución de la metilación del ADN están de este modo después imprimadas para factor de transcripción de unión a los promotores de genes que mejorarán movimiento celular, como
PLAUR
. La importancia de la hipoxia en la progresión del cáncer está bien demostrado en pacientes con cáncer cervical cuyos tumores son hipóxicos y han aumentado la incidencia de metástasis en comparación con los pacientes con tumores mejor oxigenados [57]. Está claro que la progresión del cáncer influencias hipoxia, y los cambios globales en la metilación del ADN son una ocurrencia común que influyen en la progresión del cáncer [58].

IPA análisis de los datos de plataforma cruzada para genes que ambos fueron hypermethylated y downregulated genes identificados participan en las funciones celulares tales como el movimiento celular y la señalización de célula a célula y la interacción (Tablas II y III en Información S1). Regulación a la baja de los genes implicados en la adhesión celular podría conceptualmente contribuir al aumento de la motilidad celular y la metástasis. Con una mayor revisión de la literatura, muy pocos de estos genes regulados negativamente hypermethylated y están asociados con la adhesión célula-célula. Aunque una idea interesante, nuestros datos no es compatible con la supresión de la adhesión célula a célula de expresión de la molécula como un mecanismo probable responsable de la aumento de la motilidad visto en la isquemia.

inhibidores de DNMT tales como la decitabina se han utilizado clínicamente con algunos éxito en el tratamiento de neoplasias hematológicas, tales como leucemia mieloide aguda [59]. Sin embargo, la eficacia de estos inhibidores no se ha replicado en tumores sólidos [60]. genomas del cáncer se someten a la hipometilación simultáneamente con la hipermetilación [61], por lo tanto más de hipometilación con inhibidores de DNMT sólo resuelve la mitad del desorden metilación. Además, los tumores sólidos tienen una característica única carente de cánceres hematológicos: un microambiente con regiones isquémicas. Como hemos demostrado anteriormente, la expresión y la actividad DNMT se reducen en condiciones de isquemia [28]. Por lo tanto, el uso de inhibidores de DNMT en los tumores con regiones isquémicas, puede ser ineficaz en el tratamiento del cáncer si estas regiones ya están sufriendo la hipometilación como resultado de la represión DNMT isquemia mediada.

Conclusiones

Es bien sabido que las condiciones de isquemia conducen a la metástasis del cáncer, y aquí nos sugieren un posible mecanismo para esta ocurrencia común: a través de la hipometilación del ADN facilitado por isquemia-mediada baja regulación de DNMTs. II. III.

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