pruebas
Extracto
Antecedentes
La acumulación sugirió que epitelial -mesenchymal transición (EMT) y el cáncer de células madre (CSC) las características, las cuales contribuyen a la invasión tumoral y la metástasis, están interrelacionados con el miR-21. MiR-21 es uno de los microRNAs importantes asociados con la progresión tumoral y la metástasis, pero los mecanismos moleculares EMT y fenotipo CSC subyacentes durante el miR-21 contribuye a la migración y la invasión de células de cáncer de mama aún no se han dilucidado.
Metodología /Principales conclusiones
en este estudio, MDA-MB-231 /anti-miR-21 células transfectadas fueron establecidos por hsa-miR-21 antagomir en células de cáncer de mama MDA-MB-231. EMT se evaluó por los cambios de los marcadores de células mesenquimales (N-cadherina, vimentina, y alfa-SMA), marcador de células epiteliales (E-cadherina), así como las capacidades de la migración celular y la invasión; CSC fenotipo se midió utilizando los cambios de los marcadores de superficie CSC (ALDH1 y CD44), y la capacidad de sphereforming (mammospheres). Se encontró que el antagonismo de miR-21 invertido fenotipo EMT y CSC, acompañado de PTEN regulación y AKT /ERK1 /2 inactivación. Curiosamente, la baja regulación de PTEN por siPTEN suprime los efectos de miR-21 antagomir en EMT y fenotipo CSC, confirmando que PTEN es un objetivo de miR-21 en la reversión de la EMT y CSC fenotipo. Los inhibidores de PI3K-AKT y ERK1 /2 vías, LY294002 y U0126, tanto suprimió de forma significativa la EMT y CSC fenotipo, lo que indica que se requieren Akt y ERK1 /2 vías de miR-21 y la mediación de la EMT fenotipo CSC.
conclusiones /Importancia
En conclusión, nuestros resultados demuestran que el antagonismo de miR-21 invierte la EMT y CSC fenotipo través de la orientación PTEN, a través de la inactivación de Akt y ERK1 /2 vías, y mostraron un novedoso mecanismo de los cuales podría aliviar la comportamientos biológicos malignas de cáncer de mama
Visto:. Han M, Liu M, Wang Y, X Chen, Xu J, Sun Y, et al. (2012) El antagonismo de miR-21 revierte la transición epitelio-mesenquimal y Cáncer del tallo fenotipo de las células a través de AKT /ERK1 /2 La inactivación por orientación PTEN. PLoS ONE 7 (6): e39520. doi: 10.1371 /journal.pone.0039520
Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital de & amp; Centro de Informes, Arabia Saudita
Recibido: 26 Septiembre, 2011; Aceptado: 26-may de 2012; Publicado: 25 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Han et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF 81072147, 31171336 SNCF), la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing Ciencia & amp; Comisión de Tecnología, China. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
epitelio-mesenquimal transición (EMT) se asocia con aumento de la agresividad y la metástasis en carcinomas, incluyendo el cáncer de mama, ya que permite a las células para migrar e invadir las cuestiones que rodean y se escapan en el torrente sanguíneo, en ruta hacia el establecimiento de metástasis. Una vez que estas células metastásicas llegan a su destino, pueden someterse a mesenchymal- transición epitelial (MET) para establecer tumores secundarios, dando lugar a la propagación del cáncer y el fracaso del tratamiento [1] - [3]. En el nivel molecular, las células sometidas a EMT hacia un fenotipo más mesenquimal implica la pérdida o bajar la expresión de marcadores epiteliales, tales como E-cadherina, y el aumento de la expresión de marcadores mesenquimales tales como N-cadherina, vimentina, y alfa-SMA [2] , [4], [5]. Hay estudios sugiere que la EMT en el cáncer de mama está estrechamente vinculada a las células de cáncer de mama subgrupo fenotipo y madre de cáncer de tipo basal (CSC) [6] - [8].
Los CCC se prevé que sean críticos de los conductores la progresión del tumor debido a las características de CSC, incluyendo la capacidad de auto-renovación, ilimitado potencial potencial proliferativo y la metástasis, lo que sugiere que la orientación características CSC probablemente eliminar células madre cancerosas que son las "semillas" de la recurrencia del tumor y la metástasis. Aunque la hipótesis CSC sugiere que los tumores pueden surgir a partir de células madre /progenitoras, los estudios de muchos laboratorios demostraron que la EMT puede dotar células que poseen características de CSC, así como un fenotipo invasivo más móviles [7] - [10]. Anteriormente los estudios han confirmado que el cáncer de mama contiene un compartimento de CSC-[11] - [13], que puede ser enriquecido mediante la purificación de la aldehído deshidrogenasa (1) ALDH1 células positivas [13] o CD44
+ /CD24
- /baja células [11], de la clasificación, y también la purificación de las células sphereforming (mammospheres) a partir de células de los padres [12]. Hay estudios demostraron que la EMT fenotipo es más alta en el CD44
+ /CD24
- /células madre cancerosas bajas de cáncer de mama (7), y células madre cancerosas enriquecidas de los tumores de mama y los derrames pleurales de mama metastásico marcadores expresas similares a células que han sufrido un EMT [7], [14]. Del mismo modo, los marcadores de EMT y CSC también se asocian con frecuencia con tumores de mama tienen una propensión a la metástasis, como subgrupo de tipo basal cáncer de mama fenotipo [15] y [16] cánceres de mama de metaplasia.
Los microARN (miARN) son una familia de pequeñas moléculas no codificantes de ARN que regulan la expresión génica por el apareamiento de bases a la 3'-UTR del ARNm diana. Recientemente, una serie de miRNAs se ha demostrado que desempeñan papeles críticos en la progresión y la metástasis de tumores malignos humanos [17], [18], incluyendo el cáncer de mama. MiR-21 es uno de los primeros miRNAs detectado en el genoma humano, que también es uno de los miRNAs se sabe que son reguladas en todos los tipos de tumores malignos humanos [19]. Estudios recientes indican que varios supresores de tumores, incluyendo la fosfatasa y homólogo de tensina eliminan en el cromosoma diez (PTEN) [20], tumor gen supresor tropomiosina 1 (TPM1) [21], la muerte celular programada 4 (PDCD4) [22], maspin [23] y los inhibidores de metaloproteinasas de la matriz y RECK TIMP3 [24] fueron objeto de miR-21, lo que sugiere que el miR-21 es un importante miARN oncogénicos que está estrechamente relacionada con el crecimiento tumoral y la metástasis.
Hay estudios demostró que el miR -21 es un componente importante de los circuitos de señalización celular que regula el programa EMT [25] - [27], así como los asociados con firmas CSC [26], [28], lo que sugiere que el miR-21 juega un papel clave en el proceso de EMT y adquisición de características CSC, que en consonancia con nuestra previamente estudio [29], pero los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros.
los estudios recientes han demostrado que la proliferación de células de miR-21 aumenta tumoral, la migración y la invasión a través la orientación PTEN [20], un gen supresor de tumores que es un antagonista de phosphatidylinotidol 3-quinasa (PI3K) mediante la eliminación del fosfato 3'-UTR de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3). Pero el papel de PTEN en el miR-21 de inducción de EMT y CSC fenotipo queda por esclarecer. Es bien sabido que PTEN regula negativamente la PI3K-proteína quinasa B (AKT) vía [30] y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) /señal extracelular regulada kinase1 /2 (ERK1 /2) vía [31], así como tanto AKT y ERK1 /2 vías se consideraron relevantes para el mantenimiento de la EMT y CSC características [32] - [36]
Estos resultados sugieren fuertemente que el miR-21 fuerza a través de Akt y ERK1 /2 vías. por la orientación PTEN regular EMT y CSC fenotipo. En el presente estudio, hemos puesto de manifiesto que el antagonismo de la EMT 21reversed-MIR consistente con CSC fenotipo a través de Akt y ERK1 /2 vías por la orientación PTEN, indica una vía molecular que podría aliviar los comportamientos biológicos malignos de los cánceres de mama.
Resultados
transfectadas hsa-miR-21 antagomir disminuyó la expresión de miR-21 en MDA-MB-231 células
Para explorar si hsa-miR-21 antagomir puede disminuir la expresión de MIR -21, hsa-miR-21 antagomir o su control negativo se transfectó en células MDA-MB-231 durante 48 h, entonces la expresión relativa de miR-21 se mide por el tiempo real de RT-PCR. La expresión relativa de miR-21 fue 0,10711 ± 0,01272 in-231 MDA-MB /anti-miR-21 células, lo cual fue significativamente las reguladas, como comparar a 1,07862 ± 0,09722 en los grupos de control negativo (p = 0,0015; Fig. 1A ). Los resultados sugieren que hsa-miR-21 antagomir podría disminuir la expresión de miR-21 en las células MDA-MB-231.
MDA-MB-231 células fueron transfectadas con hsa-miR-21 antagomir o HSA miR-21 de control antagomir a una concentración final de 50 nmol durante 48 h. células (A) MDA-MB-231 fueron tratados con hsa-miR-21 antagomir disminuyeron la expresión de miR-21, en comparación con grupos de control (n1 = n2 = 3; p = 0,0015), en tiempo real por RT-PCR análisis. (BE) Los niveles de ARNm de los biomarcadores mesenquimales (N-cadherina, vimentina y alfa-SMA) y el biomarcador epitelial (E-cadherina) en MDA-MB-231 /anti-miR-21 células y MDA-MB-231 células /control de , medido por análisis en tiempo real RT-PCR. El tiempo real de las reacciones de RT-PCR se realizaron en un volumen de reacción 20 l por triplicado, de forma simultánea. (F, G) Los niveles de proteína relativas de los marcadores de EMT en las células indicadas se demostró mediante análisis de transferencia Western, y las bandas eran semi-cuantificado utilizando el software ImageJ. Beta-actina se utilizó como control de carga. Las propiedades migratorias e invasivas de las células indicadas (H, I) se pusieron a prueba en la migración y la invasión de ensayo en inserciones Transwell. células penetraron fueron contadas y se analizaron en histograma. Los datos representan al menos tres experimentos realizados por triplicado. (* Indica p & lt; 0,05;
★ indica p & lt; 0,001).
El antagonismo de miR-21 Invertida EMT, así como la disminución de la migración y la invasión de MDA-MB-231 células
Para investigar los efectos de antagonismo forzada de miR-21 en el proceso de EMT de células MDA-MB-231, el ARNm y la proteína de expresión relativa de los biomarcadores de células mesenquimales fenotipo (N-cadherina, vimentina, y alfa-SMA) y biomarcador celular fenotipo epitelial (e-cadherina) en MDA-MB-231 anti-miR-21 se midieron /células y las células de control correspondientes. El antagonismo de miR-21 redujo los niveles de ARNm relativos de N-cadherina, vimentina, y alfa-SMA (p = 0,0038, p = 0,0018 y p = 0,0023, respectivamente; la Fig. 1B, C, D), mientras que aumentó la relación nivel de ARNm de E-cadherina (p = 0,0017; Fig. 1E) en las células-miR-21 contra MDA-MB-231 /, en comparación con células de control, correspondiente por el tiempo real de análisis RT-PCR. Los resultados sugieren que el antagonismo de miR-21 podría disminuir la expresión de ARNm de los biomarcadores de células mesenquimales fenotipo, mientras que aumenta la expresión de ARNm de biomarcador de células fenotipo epitelial. Los resultados de análisis de transferencia de Western demostraron que los niveles de proteína relativos de N-cadherina, vimentina, y alfa-SMA se redujeron reguladas de manera significativa (p = 0,0003, p = 0,0026 y p = 0,04, respectivamente; la Fig. 1F, G) , mientras que la de E-cadherina fue regulada up-significativamente (p = 0,0053; Fig. 1F, G) en las células de miR-21 anti-MDA-MB-231 /, en comparación con las células control. Los resultados sugieren que el antagonismo de miR-21 podría disminuir la expresión de la proteína de biomarcadores mesenquimales fenotipo de células, mientras que aumentar la de biomarcador de células fenotipo epitelial. Estos resultados demostraron claramente que el antagonismo de miR-21 podría revertir la EMT, basándose en la inhibición de la EMT biomarcadores fenotípicas. Funcionalmente, el migrado relativa y invadieron el número de células de /anti-miR-21 células MDA-MB-231 fueron significativamente inferiores a los del control negativo (p & lt; 0,0001, p & lt; 0,0001, respectivamente; Fig. 1 H, I), se sugiere que el antagonismo de miR-21 podría reducir la migración celular y la invasión de las células MDA-MB-231, que destacó además la función de miR-21 en la invasión y la metástasis de las células del cáncer de mama.
el antagonismo de miR-21 Invertida CSC Fenotipo en MDA-MB-231 células
Para examinar los efectos del antagonismo de miR-21 en CSC fenotipo de células MDA-MB-231, la proporción de células con ALDH1
+ (ALDH
brillante ) y CD44
+ /CD24
- /baja en MDA-MB-231 /anti-miR-21 células y células de control negativo se midieron. El porcentaje de células con ALDH1
+ en-miR-21 células anti MDA-MB-231 /0,85
±
0,092, significativamente inferior a 2.323 ± 0.315 en grupos de control negativo (p = 0,0051; Fig . 2A, B), por ensayo de ALDEFLUOR; el porcentaje de células con CD44
+ /CD24
- /baja en MDA-MB-231 /anti-miR-21cells fue 0,543 ± 0,129, también significativamente menor que 4.807 ± 1.062 en los grupos de control (p = 0,0094; la Fig. 2C, D), mediante análisis de FACS. Estos resultados sugieren que el antagonismo de miR-21 podría disminuir la proporción de cáncer de mama CSC, que expresa CSC biomarcadores superficie ALDH1
+ y CD44
+ /CD24
- /baja. Por otra parte, la expresión de mRNA y proteína en relación de ALDH1 y CD44 en células MDA-MB-231 /anti-miR-21 células y células de control se midió también. Los niveles de ARNm relativos de ALDH1 y CD44 en 231 MDA-MB-/anti-miR-21 células se redujo significativamente en comparación con los grupos de control (p = 0,0039, p = 0,0034, respectivamente; Fig. 2E, F), según la evaluación de análisis en tiempo real de RT-PCR, lo que sugiere que el antagonismo de miR-21 podría disminuir la expresión de ARNm de ALDH1 y CD44. La expresión de la proteína de ALDH1 y CD44 también se redujeron en consecuencia (p = 0,0002, p = 0,0005, respectivamente; la Fig. 2G, H), por análisis de transferencia Western, sugiere que el antagonismo de miR-21 podría disminuir la expresión de la proteína de ALDH1 y CD44 . Estos resultados indicaron que el antagonismo de miR-21 podría revertir el fenotipo CSC en las células MDA-MB-231, que sugiere además que el miR-21 podría incluir en la regulación de las características de CSC. Más interesante aún, el número mammosphere en MDA-MB-231 /anti-miR-21 células fue significativamente inferior a los grupos de control (p = 0,0017; Fig. 2I, J), indicó que el antagonismo de miR-21 podría disminuir la formación de mammospheres, lo que sugiere, además, que el miR-21 podría regular las características de CSC, incluyendo la capacidad de auto-renovación y clonogenicidad.
(a, B) ALDH1 actividad enzimática (ALDH
brillante) en el cáncer de mama MDA-MB establecido -231 /anti-miR-21 y células MDA-MB-231 de control /(n1 = n2 = 3) se detectaron usando el ensayo de ALDEFLUOR. (C, D) El CD44
+ /CD24
- /baja fenotipo en las células indicadas (n1 = n2 = 3) fueron detectados por análisis FACS. (E, F) Los niveles de ARNm relativos de ALDH1 y CD44 fueron detectados por el tiempo real el ensayo de RT-PCR. (G, H) Los niveles de proteína relativos de ALDH1 y CD44 se detectó por análisis de transferencia Western. Beta-actina se utilizó como control de carga. (I, J) El número de mammospheres desde 1000 MDA-MB-231/21-miR-anti-células o células /control de MDA-MB-231 se contó con un microscopio. Todos los datos representan al menos tres experimentos realizados por triplicado. (* Indica p & lt; 0,05;
★ indica p & lt; 0,001).
El antagonismo de miR-21 inducen sobre-expresión de PTEN
Los estudios recientes han demostrado que el miR 21 aumento de la proliferación celular, la migración y la invasión a través de la modulación de genes supresores de tumores PTEN [20], pero quedan por esclarecer el papel de PTEN en el miR-21 que regula la EMT fenotipo tumoral y CSC. Para explorar si el antagonismo de miR-21 regular la expresión de PTEN, la niveles de proteína de PTEN mRNA y se midieron, por el tiempo real de análisis RT-PCR y ensayo de transferencia Western, respectivamente. Como era de esperar, tanto el ARNm y la expresión de proteínas de PTEN en MDA-MB-231 /-miR-21 células anti fueron fuertemente hasta reguladas, en comparación con grupos de control (p = 0,003, p = 0,0437, respectivamente; la Fig. 3A, B, D). Estos resultados demostraron que el antagonismo de miR-21-hasta podría regular la expresión de PTEN.
(A) La expresión ectópica de PTEN ARNm en MDA-MB-231 /anti-miR-21 células MDA-MB-y 231 células /de control fueron verificados por el tiempo real el ensayo de RT-PCR (p = 0,003). (B, C, D) Los niveles de proteína de PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK1 /2, y ERK1 /2 en las células indicadas se detectaron por análisis de transferencia Western, y las bandas se semi-cuantificado utilizando el software ImageJ. GAPDH se utilizó como control de carga. (* Indica p & lt; 0,05) guía empresas
El antagonismo de miR-21 inactivado Akt y ERK1 /2
Akt y ERK1 /2 son dos importantes vías de señalización en la regulación de la proliferación celular, la migración. y la supervivencia, y ambos también fueron regulados por PTEN, pero los papeles de Akt y ERK1 /2 vías en el miR-21 que regulan EMT fenotipo tumoral y CSC queda por esclarecer. Para determinar las moléculas de señalización que se impliquen, en antagonismo de miR-21 de marcha atrás EMT y fenotipo CSC, los niveles de proteína de AKT fosforilada (p-AKT) y AKT, ERK1 fosforilados /2 (p-ERK1 /2) y ERK1 /2 eran medido por análisis de transferencia Western. -MiR-21 células anti Los niveles de proteína de p-AKT y p-ERK1 /2 en MDA-MB-231 /se redujeron fuertemente en comparación con los grupos de control (p = 0,0173, p = 0.0126, respectivamente; la figura 3C, D. ), confirmó que el antagonismo de miR-21 podría suprimir AKT y la activación de ERK1 /2 en proceso de revertir el fenotipo EMT y CSC.
Re-expresión de miR-21 inducida por EMT y CSC fenotipo, acompañado de abajo-expresión de PTEN, así como la activación de Akt y ERK1 /2
Para confirmar aún más el papel de miR-21 en la regulación de la EMT fenotipo tumoral y CSC, hsa-miR-21 imita o imitadores de control negativo se transfectó en establecida MDA-MB-231/21-miR-células anti. La expresión de miR-21 aumentó a más de 22 veces después de hsa-miR-21 imita tratados, en comparación con el control negativo (p = 0,0037; Fig. 4A), indicó que hsa-miR-21 imita la transfección podría aumentar la expresión relativa de miR-21
.
células-miR-21 contra la empresa MDA-MB-231 /fueron transfectadas con hsa-miR-21 imita a una concentración de 40 nmol durante 72 h. (A) MDA-MB-231 /anti-miR-21 células fueron tratadas con hsa-miR-21 imita elevan la expresión de miR-21, en comparación con los grupos de control (n1 = n2 = 3; p = 0,00373), por tiempo real el análisis RT-PCR. niveles (BF) de proteína de marcadores mesenquimales (N-cadherina, vimentina y alfa-SMA) (B), marcador epitelial (E-cadherina) (B), marcadores CSC (ALDH1 y CD44) (C), PTEN (D), p-AKT y AKT (e), así como p-ERK1 /2 y ERK1 /2 (e) en las células indicadas se midieron mediante análisis de transferencia Western, y las bandas se semi-cuantificado utilizando el software ImageJ (F). Beta-actina o GAPDH se utilizó como control de carga. (* Indica p & lt; 0,05;
★ indica p & lt; 0,001).
Para examinar si la obligación de volver a la expresión de miR-21 puede inducir la EMT y fenotipo CSC, regular a la baja expresión de PTEN , así como activar Akt y ERK1 /2 vías, la expresión de la proteína de biomarcadores de la EMT (N-cadherina, vimentina, alfa-SMA, y e-cadherina), marcadores CSC (ALDH1 y CD44), PTEN, p-AKT, AKT , p-ERK1 /2, y ERK1 /2 se midieron por ensayo de transferencia Western. En comparación con los grupos de control negativo, forzada re-expresión de miR-21 aumento de la expresión de la proteína de N-cadherina, vimentina, alfa-SMA, ALDH1 y CD44 (p = 0,0136, p = 0,0397, p = 0,0067, p = 0,0002 y p = 0,0006, respectivamente; la Fig. 4B, C, F), mientras que la disminución de la expresión de e-cadherina (p = 0,0014; Fig. 4B, F), sugirió que la re-expresión de miR-21 podría inducir EMT y CSC fenotipo en las células MDA-MB-231 /anti-miR-21 establecidos. Mientras tanto, re-expresión de miR-21 disminuyó la expresión de PTEN (p = 0,0081; Fig. 4D, F), demostró que la re-expresión de miR-21 podría afectar la expresión de miR-21 blanco directo en las células. Además, re-expresión de miR-21 también aumentó la expresión de p-AKT y p-ERK1 /2 en las células (p = 0,0008, p = 0,0022, respectivamente; la Fig. 4E, F), indicó que re-expresión de miR-21 podría activar Akt y ERK1 /2 vías. Estos resultados apoyan que el miR-21 podría regular la EMT y CSC fenotipo, y acompañar con alteraciones de PTEN y AKT vías /ERK1 /2.
miR-21 dirigida PTEN en la reversión de la EMT y CSC Fenotipo
Para determinar si el agotamiento de PTEN puede bloquear miR-21 antagomir revertir EMT y fenotipo CSC, siPTEN o el control SsiPTEN se transfectó en células MDA-MB-231. Después de 24 h, las células fueron transfectadas con miR-21 antagomir o un control negativo, y luego EMT y fenotipo CSC se examinaron como se describe anteriormente. Se encontró que siPTEN significativa el regulado de la expresión de PTEN (p = 0,002; Fig. 5A, E), en comparación con los grupos SsiPTEN. De acuerdo con los efectos de miR-21 antagomir en EMT y fenotipo CSC en las células MDA-MB-231 (Fig 1 y Fig. 2)., El antagonismo de EMT miR-21 también invertido (N-cadherina, p = 0,0025; vimentina, p = 0,0025; alfa-SMA, p = 0,0003; e-cadherina, p = 0,0308; Fig. 5B, e) y el fenotipo CSC (ALDH1, p = 0,0014; CD44, p = 0,002; Fig. 5C, e) en MDA Las células-MB-231 /SsiPTEN (
+ SsiPTEN grupos de control negativo vs. SsiPTEN + miR-21 grupos antagomir miARN antagomir
); agotamiento de PTEN por siPTEN bloqueado miR-21-antagomir retroceso EMT (N-cadherina, p = 0,0172; vimentina, p = 0,0113; alfa-SMA, p = 0,0015; E-cadherina, p = 0,016; Fig. 5B, E ) y CSC fenotipo (ALDH1, p = 0,0042; CD44, p = 0,0004; Fig. 5C, e) (
SsiPTEN + miR-21 grupos antagomir vs. siPTEN + miR-21 grupos antagomir
). Estos resultados sugieren que el agotamiento de PTEN podría bloquear miR-21-antagomir -reversing EMT y fenotipo CSC, lo que sugiere además que el antagonismo de miR-21 podría tener como objetivo PTEN a revertir EMT y fenotipo CSC. Además, el agotamiento de PTEN activa miR-21-antagomir de bloqueo de AKT y ERK1 /2 vías (p-AKT, p & lt; 0,0001; p-ERK1 /2, p = 0,0037; Fig. 5D, E) (
SsiPTEN + miR-21 grupos antagomir frente a grupos siPTEN + miR-21 antagomir
), indicaron que Akt y ERK1 /2 vías son las vías descendentes de PTEN en la regulación de la EMT y el fenotipo CSC.
. células MDA-MB-231 se transfectaron con siPTEN o el control mezclado SsiPTEN a una concentración final de 50 nmol durante 24 h. Luego, las células fueron transfectadas con hsa-miR-21 antagomir o control negativo a una concentración final de 50 nmol durante 72 h. Las células se trataron con tripsina, y se midieron los niveles de proteína relativos de PTEN (A), los marcadores de EMT (B), marcadores de la superficie de CSC (C), p-AKT y AKT (D), así como p-ERK y ERK (D) y semi-cuantificados (e) como se dijo antes. Los tapones para los representativos de los tratamientos de SsiPTEN además de miR-21 de control antagomir, SsiPTEN además de miR-21 antagomir, y siPTEN además de miR-21 antagomir se muestran en la imagen. Beta-actina o GAPDH se utilizó como control de carga. (* Indica p & lt; 0,05;
★ indica p & lt; 0,001).
miR-21 EMT Regulado y CSC fenotipo, así como la proliferación celular a través de Akt y ERK1 /2 Rutas
Para investigar más a fondo el papel de Akt y ERK1 /2 vías en el miR-21 que regula la EMT y CSC fenotipo, la MDA-MB-231 /anti-miR-21 células fueron transfectadas con el miR-21 imita a una concentración de 40 nmol durante 72 h, y después las células se trataron con LY294002 (el inhibidor de PI3K-AKT) en 20 mmol /l o U0126 (el inhibidor de ERK1 /2) a 10 mmol /l durante 24 h. Se confirmó que el tratamiento LY294002 bloqueado re-expresión de miR-21 inducir la activación de AKT (p & lt; 0,0001; Fig. 6A, E), mientras que el tratamiento U0126 abolió re-expresión de miR-21 inducción de ERK1 /2 de activación (p & lt; 0,0001; Fig . 6A, E). Más interesante, re-expresión de miR-21 inducción de fenotipo EMT y CSC se inhibe por LY294002 (N-cadherina, p = 0,0005; vimentina, p = 0,0005; alfa-SMA, p = 0,0008; E-cadherina, p = 0,0002; ALDH1, p & lt; 0,0001; CD44, p & lt; 0,0001; Fig. 6B, C, E) o U0126 (N-cadherina, p & lt; 0,0001; vimentina, p = 0,0005; alfa-SMA, p = 0,0004; E-cadherina, p = 0,0003; ALDH1, p & lt; 0,0001; CD44, p = 0,0005; Fig. 6B, C, e) en las células, indicó que tanto Akt y ERK1 /2 vías están requiriendo de miR-21 en la inducción de la EMT y CSC fenotipo, que sugirieron además que Akt y ERK1 /2 vías son dos vías descendentes paralelos de miR-21 para la regulación de la EMT y el fenotipo CSC. Por otra parte, tanto LY294002 y U0126 no tienen efectos demostrados en PTEN (p = 0,1208, p = 0,4361, respectivamente; Fig. 6D, E)., Que también apoyaron que la Akt y ERK1 /2 vías son las vías descendentes de PTEN
Establecido células MDA-MB-231 /anti-miR-21 se transfectaron con hsa-miR-21 imita a una concentración de 40 nmol durante 72 h. A continuación, las células se tripsinizaron y se trataron con LY294002 (20 mmol /l) o U0126 (10 mmol /l) durante 24 h. (AE) Los niveles de proteína relativos de p-AKT y AKT (A), p-ERK y ERK (A), los marcadores de EMT (B), marcadores de la superficie CSC (C), así como PTEN (D) de control en blanco, se muestran LY294002, y U0126 grupos de tratamiento, y semi-cuantificadas (e) como se dijo antes. Beta-actina o GAPDH se utilizó como control de carga. (* Indica p & lt; 0,05;
★ indica p & lt; 0,001;
▴ indica p & gt; 0,05). . (F) Los efectos del antagonismo de miR-21, re-expresión de miR-21, LY294002, y U0126 sobre la proliferación celular mediante recuento de células (A
vs Francia B, p = 0,0077; B + C
vs Francia B + D, p = 0,0091;. B + D
vs Francia B + D + E, p = 0,0109;.. B + D
vs Francia B + D + F, p = 0,0031).
Además, para verificar los papeles de Akt y ERK1 /2 vías de miR-21 regulación de la proliferación celular en las células que se mencionan más arriba, los números de crecimiento de células de la se calcularon las células a 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72 h después de los tratamientos por el recuento de células. Se encontró que el antagonismo forzada de miR-21 disminución de la proliferación celular en células MDA-MB-231 células (p = 0,0077; Fig. 6F), mientras que re-expresión de la proliferación celular elevada miR-21 en MDA-MB-231 /anti-MIR -21 células, durante 0-72 h (p = 0,0091; Fig. 6F). Los resultados sugieren que miR-21 podría regular la propagación de células en un cierto grado en las células MDA-MB-231. Mientras tanto, tanto AKT y Erk1 /2 inhibiciones se redujeron la proliferación celular (p = 0,0109, p = 0,0031, respectivamente; Fig. 6F)., Lo que sugiere que la regulación de AKT o ERK1 /2 vinculado a los cambios en la proliferación de células
Discusión
miRNAs son pequeños ARN no codificantes que pueden actuar como oncogenes o genes supresores de tumores [37], [38]. La creciente evidencia mostró que miR-21 sobre-expresión se detecta en varios tipos de cánceres humanos incluyendo cáncer de mama, y se asocia con EMT [25] - [27] y las características CSC [26], [28]. Pero las funciones directas y mecanismos moleculares centrales de miR-21 en la regulación de la EMT cáncer de mama y el fenotipo CSC queda por esclarecer. En este estudio, encontramos que el antagonismo de miR-21 en las células MDA-MB-231 y CSC invertido EMT fenotipo, regulado hasta la expresión de PTEN, así como AKT inactivado y ERK1 /2 vías. Los resultados demostraron que el antagonismo de miR-21 es suficiente para invertir EMT y CSC fenotipo a través de la modulación de la expresión de PTEN y AKT /ERK1 /2 vías, proporcionando cierta evidencia directa y mecanismos moleculares que miR-21 es capaz de regular EMT y CSC fenotipo .
para investigar el papel de miR-21 en la regulación de la EMT y CSC fenotipo de las células de cáncer de mama, antagomir de miR-21, que puede unirse específicamente a e inhibir endógenos miR-21 moléculas, o su oligómero control negativo , se transfectó en células MDA-MB-231. El antagomir disminuyó 90% de la expresión endógena miR-21 en las células (Fig. 1A). Curiosamente, la EMT relativa y fenotipo CSC fueron contrarrestados por el antagonismo de miR-21 (figura 1B-G;. La Fig. 2A-J), que en consonancia con el miR-21 consiste en la promoción de la EMT y (o) fenotipo CSC en las células de cáncer de páncreas [26], [28], las células de carcinoma de tiroides [27], y nuestro estudio previamente en células MCF-7 [29]. Acompañado con los resultados, el antagonismo de miR-21 aumentó significativamente la expresión de PTEN (Fig. 3A, B, D), así como la disminución de AKT y ERK1 2 activación /(Fig. 3C, D). Estos resultados demostraron que miR-21 juega un papel importante en la mediación de EMT y el fenotipo CSC, acompañar mediante la regulación de la expresión de PTEN, así como AKT y ERK1 /2 de activación.
A continuación, se exploró los mecanismos subyacentes y moléculas de señalización relativos en el antagonismo de miR-21 y revertir EMT fenotipo CSC. En consonancia con la que el miR-21 suprime la función de la expresión de PTEN supresor de tumores mediante la unión de su extremo 3 'UTR [20], hemos demostrado que el antagonismo de miR-21 hasta reguladas expresión de PTEN (Fig. 3A, B, C). Como era de esperar, PTEN abajo-expresión particular bloqueado EMT y fenotipo CSC miR-21-marcha atrás (Fig. 5B, C, E), confirmó que el antagonismo de miR-21 exhibe su papel en parte por promover la expresión de PTEN, y la recuperación de la expresión de PTEN reduciría su función de supresor de tumores.
por otra parte, también se encontró que la re-expresión de miR-21 por el miR-21 imita llevaron a la activación de Akt y ERK1 /2 vías (Fig. 4E, F) . Más interesante aún, trataron las células con PI3K-AKT o ERK1 /2 inhibidor (LY294002 o U0126), prohibido el miR-21 imita recobren EMT y CSC fenotipo (Fig. 6B, C, E). Los resultados sugirieron que la (o) ERK1 /2 en el miR-21-regulación de la EMT y el fenotipo CSC, de acuerdo con lo AKT y (o) se requiere que los efectos de la Akt y ERK1 /2 vías para promover la EMT y (o) fenotipo CSC en cáncer de mama MCF-7 células [32], las células epiteliales de mama [33], [34], células de cáncer de colon [35], células de cáncer cervical [32], y las células de los carcinomas de ovario [36].
en resumen, nuestros resultados demostraron que el antagonismo de miR-21 invierte EMT y CSC fenotipo a través de AKT y ERK1 /2 vías inactivación mediante la inducción de la expresión de PTEN en las células MDA-MB-231 (Fig. 7). Este estudio mostró un papel directo y novedoso mecanismo de miR-21 en inversing EMT y fenotipo CSC, y la información puede ser útil para desarrollar una nueva terapia para el tratamiento de los cánceres de mama en el futuro.
El antagonismo de miR 21 podrían inactivar Akt y ERK1 /2 vías presumiblemente a través de PTEN regulación, y finalmente revertir la EMT y el fenotipo CSC en las células MDA-MB-231.
Materiales y Métodos
Reactivos Los anticuerpos y
tiene-miR-21 humano (MIMAT0000076) antagomir y control negativo, imita y control negativo fueron adquiridos de Ribobio (Guangzhou, china). Los cebadores de PCR fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China). en tiempo real kits de ensayo de RT-PCR se adquirieron de Takara (Dalian, China). secuencia específica dúplex y control de mezcla aleatoria siRNA siPTEN (SsiPTEN) fueron adquiridos de Ribobio. LY294002 y U0126 se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Lipofectamine ™ 2000 se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Kit ALDEFLUOR® se adquirió de Aldagen (Durham, NC, EE.UU.). isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con anti-CD44 y anticuerpo ficoeritrina (PE) marcado con anticuerpo anti-CD24 se adquirieron de BioLegend (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos primarios incluidos anticuerpo de conejo antihumano E-cadherina (n: BS1098; Bioworlde, St. Louis, MO, EE.UU.), anticuerpos N-cadherina (n: BS2224; Bioworlde), anticuerpos vimentina (n: BS1776; Bioworlde), alfa-SMA anticuerpo (n: ab5694; Abcam, Cambridge, Reino Unido), el anticuerpo ALDH1 (n: ab51028; Abcam), anticuerpo CD44 (n: BA0321; Boster, Wuhan, china), anticuerpos PTEN (n: BS1304; Bioworlde), anticuerpo AKT (