Extracto
Estudios anteriores han demostrado el papel de tumor supresor de la proteína de unión de selenio-1 (SBP1), pero los mecanismos subyacentes no están claros. En este estudio, hemos encontrado que la inducción de SBP1 mostró inhibición significativa del crecimiento de células de cáncer colorrectal y metástasis en ratones. Empleamos más etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) para identificar las proteínas que estuvieron involucrados en los efectos anticancerígenos mediadas por SBP1 en los tejidos tumorales. Se identificaron 132 proteínas expresadas diferencialmente, entre ellos, 53 proteínas se upregulated y se downregulated 79 proteínas. Es importante destacar que muchas de las proteínas diferencialmente alterados estaban asociados con lípidos /metabolismo de la glucosa, que también estaban vinculados a la glucólisis, MAPK, Wnt, NF-kB, Notch y transición epitelio-mesenquimal (EMT) vías de señalización. Estos resultados han revelado un nuevo mecanismo que SBP1 mediada por la inhibición del cáncer es a través de la alteración de los lípidos vías de señalización metabólica de la glucosa /
Visto:. Ying Q, E Ansong, Diamante AM, Lu Z, Yang W, X Bie (2015 ) Análisis cuantitativo proteómico revela que los efectos anticancerígenos de proteína de unión a selenio 1
En Vivo
están asociados con vías metabólicas. PLoS ONE 10 (5): e0126285. doi: 10.1371 /journal.pone.0126285
Editor Académico: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 13 Enero, 2015; Aceptado: March 31, 2015; Publicado: 14 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Ying et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención#91229115 y 81272251), una subvención para el equipo innovador de la Ciencia y Tecnología, la provincia de Henan, china
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La proteína de unión de selenio-1 humana (SBP1, SELENBP1) pertenece a la clase de proteínas que contienen selenio en el que el selenio está estrechamente asociada con el péptido en lugar de incorporado co-traduccionalmente como un selenocysteine de aminoácidos (SEC) en otra clase de que contiene selenio peroxidasa proteína-glutatión 1 (GPx1). El gen SBP1 humano codifica una proteína de 472 amino ácido que tiene un peso molecular igual a 56 kDa. Se expresa en una variedad de células y tejidos (hígado, corazón, pulmón y riñón) y situado en el núcleo y /o citoplasma dependiendo del tipo de célula, el grado de diferenciación, y la señalización del medio ambiente [1-4]. La disminución de SBP1 se ha encontrado en la mayoría de los cánceres humanos incluyendo cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, y cáncer colorrectal [5]. Esta reducción de SBP1 se asocia con pobres resultados clínicos. Sin embargo, las funciones biológicas de SBP1 en cánceres humanos no están claros.
Se ha informado de que SBP1 es un objetivo de la hipoxia-inducible factor-1 de α (HIF1α) para responder a las especies reactivas de oxígeno (ROS) [3] . SBP1 también podría regular negativamente la glutatión peroxidasa 1 actividad (GPx1) sin cambiar su expresión de la proteína a través de una interacción proteína física [6]. proteína de von Hippel-Lindau (pVHL) - interactuar deubiquitinating enzima 1 (VDU1) se ha descubierto recientemente como otro acompañante de la proteína de SBP1, que participó en las vías ubiquitination- y deubiquitination mediada por degradación de proteínas [7]. Todo este trabajo sugiere que SBP1 puede interactuar con otras proteínas a través de diferentes vías de señalización.
Para obtener una comprensión más completa de las funciones SBP1 sobre el cáncer, se empleó un método de proteómica, etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) . iTRAQ es actualmente una de las técnicas más robustas que cuantifica las proteínas sobre la base de etiquetado péptido. A diferencia de método proteómico a base de gel, exposiciones iTRAQ mucho mejor sensibilidad y permite la identificación y cuantificación exacta de las proteínas a partir de múltiples muestras dentro de amplios rangos dinámicos de la abundancia de proteínas [8].
Para eliminar los posibles efectos secundarios de la transfección, se establecido una línea celular inducible SBP1 estable usando un sistema de expresión inducible Tet-el gen que produce la expresión SBP1 altamente controlable y alcanza un nivel muy alto de inducción en las células. Se observó tumor inhibición de la función SBP1
in vivo
. Las proteínas expresadas diferencialmente en los tumores de xenoinjerto de ratón SBP1 inducida se ensayaron por iTRAQ y los cambios de algunas proteínas identificadas fueron validados por inmunotransferencia. Nuestros resultados revelaron un mecanismo novedoso contra el cáncer de SBP1
in vivo
, que estaba vinculado al metabolismo de los lípidos /glucosa y se asocia con MAPK /Wnt, NF-kB, Notch y EMT vías de señalización.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad médica de Xinxiang. Toda la cirugía se realiza bajo anestesia con pentobarbital y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Cultivo de células
El colon humano HCT116 línea celular de carcinoma se obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection, EE.UU.) y mantenido en medio 5A de McCoy (Mediatech, Manassas, VA). GP2-293 línea celular fue adquirido de Clontech (Mountain View, CA) y se mantuvieron en medio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA). Todos los medios se complementó con 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Todas las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado (Thermo Fisher Scientific).
Construcción de plásmidos
Para generar retroviral plásmido de expresión pRetroX-Tight-Pur -SBP1, humano SBP1 cDNA se amplificó y se subclonó en el vector pRetroX-Tight-Pur (Clontech, Mountain View, CA) usando los sitios de restricción NotI y EcoRI. Se utilizaron los siguientes cebadores: 5 'hacia adelante ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGAAAT-3' y 5'-reverse ACGAATTCGCTCAAATCCA GATGTCAGAGC-3 '. Dos plásmidos pRetroX-Tet-On Avanzados (Tet en vectores activador) y pVSV-G (vector de empaquetamiento) se adquirieron de Clontech (Mountain View, CA).
embalaje Retrovirus
Las células de empaquetamiento GP2-293 fueron cultivadas en 25 cm
2 frascos y transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) con 6 mg pVSV-G y, o bien 2 mg pRetroX-Tight-Pur-SBP1 o 2 mg pRetroX-Tight-On avanzada. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogió el virus que contenía sobrenadante y se congeló a -20 ° C. línea celular HCT116-TetSBP1 se generó mediante la infección de células HCT116 con el virus que contiene tanto pRetroX-Tight-Pur-SBP1 y pRetroX-Tight-On avanzada. colonia individual fue recogido después de la selección con 400 mg /ml de G418 (Sigma) y 1 mg /ml puromicina (Sigma). línea celular HCT116-Ley se generó mediante la infección de células HCT116 con el virus que contiene pRetroX-Tight-On avanzada. colonia individual fue recogido después de la selección con 400 mg /ml de G418 (Sigma).
análisis de inmunotransferencia
células HCT116-TetSBP1 y HCT116-Act fueron tratados con 1μg /ml de doxiciclina (Sigma) durante 72 horas antes del análisis. Las células recogidas se lisaron en tampón de lisis celular 1x (Señalización Celular, Danvers, MA) que contiene 1 mM PMSF (Señalización Celular). lisado celular aclarado de cada línea celular se llevó a ebullición con NuPAGE LDS tampón de muestra (Life Technologies) y 10x agente reductor (Life Technologies) durante 5 minutos antes de ser cargados en un gradiente de 4-12% Bis-Tris gel de poliacrilamida desnaturalizante (Life Technologies). Después de la separación de la muestra por electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana Immobilon-FL (Millipore) por medio de electrotransferencia. anticuerpos y diluciones primarias incluyendo SBP1 a escala 1: 1000 (ratón, MBL Internacional, Woburn, MA), β-actina a escala 1: 10000 (ratón, Sigma), DKK1 a escala 1: 1000 (conejo, Proteintech, Chicago, IL), ANXA4 a escala 1: 1000 (conejo, Proteintech, Chicago, IL), ppia a escala 1: 1000 (conejo, Proteintech, Chicago, IL), FABP4 a escala 1: 1000 (conejo, Proteintech, Chicago, IL), UGDH a escala 1: 1000 ( conejo, Proteintech, Chicago, IL), ALDH2 a escala 1: 1000 (conejo, Proteintech, Chicago, IL), p21 a escala 1: 1000 (conejo, Proteintech, Chicago, IL), fosfo-Akt (Ser473) a 1: 1000 ( conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), Akt a escala 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), fosfo-FoxO1 a escala 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), fosfato JNK a escala 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), JNK a escala 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), Pc-Jun a 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA ), fosfo-ciclina D1 en 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), ciclina D1 en 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), fosfo-p53 (Ser15) a 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), TWIST a escala 1: 1000 (conejo, Señalización celular Tecnología, Danvers, MA), β-catenina en 1: 500 (cabra, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), y GPX1 a 1: 1000 (ratón, MBL International, Woburn, MA) se incubaron con la membrana a 4 ° C durante la noche. El anticuerpo secundario apropiado (Instituto de Biotecnología Beyotime, China) se aplicó (1: 1.000, de conejo o de ratón) a temperatura ambiente durante 1 h. La señal se detectó utilizando BeyoECL Plus (Instituto de Biotecnología Beyotime, China).
En vivo
desnuda ratones tumorigénesis y metástasis ensayo
Para el experimento de xenoinjertos, HCT116-Ley y HCT116 -TetSBP1 células fueron tratadas con 1μg /ml de doxiciclina durante 72 horas y luego 2 × 10
se inyectaron 6 células en 100 pl de PBS por vía subcutánea en ratones BALB /c CD-1 ratones hembra de 6-8 semanas de edad, Nu en los diferentes lados ( HCT116-Ley estaba en el lado izquierdo y HCT116-TetSBP1 estaba en el lado derecho). La doxiciclina (200 mg /ml) disuelto en 5% de sacarosa suministrado como agua potable se intercambió cada 3 días. Cuatro semanas después de la inyección, los tumores fueron aislados y (3 mm
) de los tumores se determinaron el peso (g) y el volumen. Los tumores fueron almacenadas a -80 ° C hasta su utilización para el análisis de inmunoblot y iTRAQ.
Para producir metástasis pulmonar experimental, las células HCT116-Act y HCT116-TetSBP1 fueron tratados con 1μg /ml de doxiciclina durante 72 horas y luego 2 × 10
6 células en 100 l de PBS se inyectaron en las venas de la cola laterales de 6-8 semanas de edad BALB /c CD-1 NU ratones hembra. La doxiciclina (200 mg /ml) disuelto en 5% de sacarosa suministrado como agua potable se intercambió cada 3 días. Seis semanas después, los ratones fueron sacrificados bajo anestesia. Los pulmones se recogieron y se fijaron en formalina al 10%. Para la evaluación la morfología del tejido, hematoxilina y eosina (HE) de tinción se realizó en secciones de muestras embebidas.
La extracción de proteínas, la digestión y el etiquetado iTRAQ
proteínas totales se extrajeron a partir de tejido de tumor de HCT116-Act inyecta (Ley) y HCT116-TetSBP1 ratones inyectados (TetSBP1) utilizando el siguiente protocolo. Tres repeticiones biológica se llevaron a cabo para cada muestra y se mezclan juntos para la extracción de proteínas. El tejido tumoral se llevó a ebullición en tampón de SDT (4% de SDS, 100 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7,6) durante 5 min, se homogeneizó usando FastPrep-24 (MP Biomedicals, 6M /S, 30 años, dos ciclos) y luego se sometió a ultrasonidos ( 100w, 30 segundos en 30 segundos apagado, 10 ciclos). El homogeneizado se centrifugó a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. Las concentraciones de proteína se sometieron a ensayo según el método de Bradford [9]. Una cantidad igual de proteínas se preparó para cada muestra. La digestión de proteínas se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito por FASP Wisniewski, Zougman et al. [10] y el péptido resultante mezcla se marcó utilizando el reactivo iTRAQ 4-plex de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Brevemente, 200 g de proteínas de cada muestra se incorporaron en 30 l de tampón de STD (4% de SDS, DTT 100 mM, 150 mM Tris-HCl pH 8,0). El detergente, DTT y otros componentes de bajo peso molecular se eliminaron usando tampón de UA (8 M urea, Tris-HCl 150 mM, pH 8,0) mediante ultrafiltración repetida (unidades Microcon, 30 kD). A continuación, se añadieron 100 l de yodoacetamida 0,05 M en tampón UA para bloquear los residuos de cisteína reducidos y las muestras se incubaron durante 20 min en la oscuridad. Los filtros se lavaron con 100 l de tampón de UA tres veces y luego 100 l de tampón de DS (triethylammoniumbicarbonate 50 mM a pH 8,5) dos veces. Por último, las suspensiones de proteína fueron digeridos con 2 g de tripsina (Promega) en 40 l DS tampón durante la noche a 37 ° C, y los péptidos resultantes se recogieron como un filtrado. El contenido de péptido se estimó por densidad espectral de la luz UV a 280 nm usando un coeficiente de extinción de 1,1 de la solución que se calculó sobre la base de la frecuencia de triptófano y tirosina en las proteínas de vertebrados 0,1% (g /l). Para el etiquetado, cada reactivo iTRAQ se disolvió en 70 l de etanol y se añadió a la mezcla de péptido respectivo. Las muestras fueron etiquetados como (TetSBP1) -114, (Ley) -115, y fueron multiplexados y se secaron al vacío.
La cromatografía líquida (LC) -electrospray ionización (ESI) en tándem MS análisis (MS /MS) por Q exactive
La mezcla de péptido se desaló en cartuchos C18 (Sigma), después se concentró por centrifugación al vacío y se reconstituyó en 40 l de 0,1% (v /v) de ácido trifluoroacético. MS experimentos se realizaron en un espectrómetro de masas Q Exactive que fue acoplado a Fácil nLC (Thermo Fisher Scientific). Se inyectaron 10 l de la muestra para el análisis nanoLC-MS /MS. La mezcla de péptidos (5 g) se cargó en una columna de fase reversa-C18 (Thermo Scientific Fácil de columna, 10 cm de largo, 75 m de diámetro interior, resina 3μm) en tampón A (ácido fórmico al 0,1%) y se separó con un gradiente lineal de tampón B (80% de acetonitrilo y ácido fórmico 0,1%) a una velocidad de flujo de 250 nl /min controlado por la tecnología IntelliFlow más de 240 min. los datos de MS se adquirió usando un método Top10 dependiente de los datos de elegir dinámicamente los iones más abundantes precursores de la encuesta de exploración (300 a 1.800 m /z) para la fragmentación HCD. Determinación del valor objetivo se basa en el control automático de ganancia de predicción (PAGC). duración dinámica de exclusión fue de 60 s. exploraciones estudio fueron adquiridas a una resolución de 70.000 a m /z 200 y la resolución de los espectros HCD se establecen en 17.500 a m /z 200. energía de colisión normalizada fue de 30 eV y la relación de llenado insuficiente, que especifica el porcentaje mínimo del valor objetivo probable para ser alcanzado en el tiempo de llenado máximo, se definió como 0.1%. El instrumento se realizó con activar el modo de reconocimiento de péptidos
iTRAQ la identificación y cuantificación de proteínas
espectros MS /MS se realizaron búsquedas utilizando el motor de MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido; versión 2.2). Incrustado en Proteoma descubridor 1.3 (Thermo Electron, San Jose, CA.) contra la base de datos de Uniprot humano (136615 secuencias, descargado el 7 de mayo de 2014) y la base de datos señuelo. Para la identificación de proteínas, se utilizaron las siguientes opciones: Péptido tolerancia de masa = 20 ppm, la tolerancia MS /MS = 0.1 Da, Enzyme = tripsina, la escisión fallado = 2, modificación fija: Carbamidomethyl (C), iTRAQ 4-plex (K), iTRAQ 4-plex (N-terminal), la modificación de variables: oxidación (M), FDR≤0.01. Teniendo en cuenta que múltiples MS /MS Los espectros de fósforo para un péptido, la normalización de las intensidades de señal de cada uno de espectros MS /MS se realizó para encontrar la relación de expresión más probable para un péptido. Para los cambios cuantitativos, se estableció un punto de corte de 1,2 veces para determinar arriba-abajo acumulada y acumulada-proteínas, con un valor de p & lt; 0.05.
Análisis de Bioinformática
Análisis funcional de las proteínas identificadas se llevó a cabo utilizando Gene Ontología anotación (GO) (http://www.geneontology.org/) y las proteínas se clasifican de acuerdo a sus características biológicas proceso, la función molecular y localización celular [11]. Las proteínas diferencialmente acumulados fueron asignados más a la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas de base de datos (KEGG) (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) [12].
Resultados
SBP1 de inducción en ratones desnudos inhibieron el crecimiento de tumores de xenoinjertos
niveles de expresión SBP1 en HCT116-Ley y las células HCT116-TetSBP1 se determinaron mediante análisis de inmunotransferencia. Como se muestra en la figura 1A, línea celular HCT116-TetSBP1 expresó alto nivel de SBP1 después de la inducción doxiciclina, en comparación con las células HCT116-Act. Para probar si la sobreexpresión SBP1 tenía la función de supresión tumoral
in vivo
como se informó anteriormente [13], hemos realizado experimentos de xenoinjertos en ratones desnudos CD1 Nu (n = 10 en total). células HCT116-Act y HCT116-TetSBP1 fueron tratados con 1μg /ml de doxiciclina durante 72 horas y luego 2 × 10
6 células en 100 l de PBS se inyectaron por vía subcutánea en 6-8 semanas de edad BALB /c CD-1 hembra Nu ratones en los diferentes lados, respectivamente. HCT116-Ley estaba en el lado izquierdo y HCT116-TetSBP1 estaba en el lado derecho. Para mantener la inducción persistentemente de SBP1, doxiciclina (200 mg /ml) disuelto en 5% de sacarosa suministrado como el agua potable se intercambió cada 3 días. Cuatro semanas después de la inyección, se aislaron los tumores, y (3 mm
) se analizaron el peso del tumor (g) y el volumen. Se encontró que los tamaños de los tumores derivados de células HCT116-TetSBP1 eran mucho más pequeños que los de las células HCT116-Act grupo control (Fig 1B y 1C). Además, el peso tumores derivados de las células HCT116-TetSBP1 se redujo significativamente, en comparación con HCT116-Act (Fig 1D). Estos resultados sugieren fuertemente que
in vivo
inducción de SBP1 mostraron inhibición de tumores en ratones.
(A) SBP1 inducida por doxiciclina en células HCT116-TetSBP1 fueron validados por análisis de inmunoblot. (B) Las fotografías ilustran los tumores representativos en xenoinjertos con la inducción SBP1 (TetSBP1, derecha) en comparación con los tumores sin inducción SBP1 (Ley, izquierda). 10 ratones en total. (C-D) los resultados de inducción SBP1 en una disminución del volumen del tumor y el peso. Los resultados se analizaron con la prueba t de Student y se muestran como media ± desviación estándar. ** P & lt;. 0,01
SBP1 inducción suprimida la metástasis tumoral
in vivo
Para examinar la inhibición SBP1 de la metástasis tumoral, la HCT116-Ley y HCT116-TetSBP1 las células fueron tratadas con doxiciclina 1μg /ml durante 72 horas y luego 2 × 10
6 células en 100 l de PBS se inyectaron en las venas de la cola laterales de /c CD-1 Nu ratones hembra de 6-8 semanas de edad BALB (n = 5 para cada grupo). Para mantener la inducción persistentemente de SBP1, doxiciclina (200 mg /ml) disuelto en 5% de sacarosa suministrado como el agua potable se intercambió cada 3 días. Después de 6 semanas los ratones fueron anestesiados y se cosecharon los pulmones del ratón, se fijaron y se diseccionaron. Se encontró que los ratones trasplantados con células HCT116-Act tenían nódulos metastásicos pulmonares visibles, mientras que ningún ratón en el grupo HCT116-TetSBP1 mostró metástasis pulmonares visibles (figura 2A). Después de hematoxilina y eosina (HE) de la tinción, se contaron el número de nódulos metastásicos pulmonares. Los resultados mostraron que los ratones con la inducción SBP1 (grupo HCT116-TetSBP1) dieron como resultado una disminución significativa de nódulos metastásicos pulmonares (Fig 2B), lo que indica una inhibición metastásico de SBP1
in vivo
.
( A) imágenes representativas de los pulmones y la hematoxilina y eosina (HE) -staining de pulmones aislados de ratones que recibieron inyección en la vena de la cola de las células HCT116-Act (Ley) y células HCT116-TetSBP1 (TetSBP1). Cada grupo consta de 5 ratones. Las flechas ilustran los nódulos visibles y nódulos metastásicos en el pulmón. Barra de escala = 200 micras. (B) la inducción SBP1 inhibe la metástasis del tumor
in vivo
. El número de nódulos metastásicos pulmonares se contaron bajo el microscopio y se analizaron con la prueba t de Student. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar. ** P & lt;. 0,01
identificación cuantitativa y la bioinformática análisis de proteínas de los tejidos tumorales ensayadas por iTRAQ
Para determinar los mecanismos de inhibición mediada por SBP1 del crecimiento tumoral y la metástasis en ratones, se extrajeron las proteínas totales del tejido tumoral de HCT116-Ley inyectado (Ley) y HCT116-TetSBP1 inyectamos ratones (TetSBP1), y los perfiles de proteínas se realizaron utilizando iTRAQ. En última instancia, se identificaron 9147 péptidos únicos, 2015 y 1975 grupos de proteínas proteínas. La distribución de longitudes y números de péptidos, la masa y la cobertura de secuencia de las proteínas se proporcionan (S1 Tabla).
Se analizaron las alteraciones en el perfil de proteínas en respuesta a la inducción SBP1. 132 proteínas mostraron una diferencia significativa (valor de p & lt; 0,05) con un FDR de menos de 1%, incluyendo 53 proteínas upregulated y 79 proteínas downregulated. información completa al respecto se proporcionan (S2 Tabla). Estas proteínas diferencialmente acumulados enriquecidos 1364 anotaciones a través de análisis de GO, y se clasificaron en tres grupos: proceso biológico, la función molecular, y los componentes celulares (Fig 3A). Las principales categorías de procesos biológicos incluidos proceso celular, proceso de un solo organismo, la regulación biológica, el metabolismo y la respuesta a los estímulos. Sobre la base de diferentes funciones moleculares, estas proteínas se dividen en los grupos de, la actividad de unión catalítica, actividad molécula estructural, regulador de la actividad enzimática, la actividad de transporte y la actividad antioxidante. Estas proteínas también estaban involucrados en diferentes componentes celulares, incluyendo células, orgánulos, complejo macromolecular, la membrana y el lumen rodeados de membrana. Estas proteínas diferencialmente acumulados fueron clasificados usando la base de datos KEGG. Las principales vías implicadas en las proteínas expresadas diferencialmente resultantes de la inducción SBP1, incluyendo una regulación deficiente de la transcripción en el cáncer, las uniones estrechas, lisosoma, procesamiento de proteínas en el retículo endoplasmático, 1 HIF-vía de señalización, vía de señalización PI3K-Akt, vías en el cáncer, los proteoglicanos en el cáncer , microRNAs en cáncer, y la glucólisis /gluconeogénesis, y otras vías. Estudios recientes han demostrado que los lípidos /metabolismo de la glucosa está muy asociada con la carcinogénesis [14-17]. Por lo tanto, a continuación, analizamos las mayoría de las proteínas modificados que enlazaban con el metabolismo de lípidos /glucosa a partir de los xenoinjertos de tumores de ratón. Curiosamente, trece de lípidos proteínas relacionados con el metabolismo y siete proteínas relacionados con el metabolismo de glucosa se modificaron significativamente por inducción SBP1 en xenoinjertos de tumores de ratón. Todas estas proteínas relacionados con el metabolismo de lípidos /glucosa se ilustran en la figura 3B en base a sus funciones biológicas a través del análisis de ontología de genes (GO)
(A) Todas las 132 proteínas diferencialmente acumulados se clasificaron en tres grupos:. Proceso biológico, la función molecular y celular componente a través del análisis de GO. (B) Los números de lípidos /proteínas relacionados con el metabolismo de glucosa se muestran a través del análisis de GO.
Las alteraciones del metabolismo de las proteínas asociadas a lípidos /glucosa en la respuesta a la inducción SBP1
se muestra en la figura 3B, se seleccionaron trece proteínas relacionadas con el metabolismo de lípidos, incluyendo cinco proteínas upregulated y ocho proteínas downregulated (Tabla 1). Las proteínas más upregulated por inducción SBP1 incluyen DKK1 que inhibe la vía WNT [18], DHCR7 que controla el colesterol y vitamina síntesis D [19], ANXA4 que inhibe la vía de NFkB y IL-8 [20], y AGPAT5 que inhibe la proliferación de células de cáncer de mama [21]. Todas estas proteínas han sido reportados para mostrar potenciales efectos anticancerígenos. Considerando que, otras proteínas, tales como LPCAT2 que es altamente expresado en células inflamatorias [22], BPIFA3 que es altamente expresado en el cáncer de pulmón [23], PPIA que activa NFkB vía [24], y FABP4 que tiene función pro-angiogénico [25 ], fueron regulados a la baja en los tumores de xenoinjertos sobreexpresión SBP1. En contraste, siete proteínas relacionados con el metabolismo de glucosa fueron regulados a la baja de manera significativa en los tumores de xenoinjertos sobreexpresión SBP1, incluyendo GAA, GAPDH, ALDH2, tiorredoxina, ENO3, UGDH y Lumican (Tabla 2).
Para validar las alteraciones diferenciales de las proteínas relacionadas con el metabolismo de lípidos de glucosa /ensayadas a partir del análisis proteómico iTRAQ en xenoinjertos de tumores de ratón, se realizaron análisis de inmunotransferencia. Consistentes con los observados desde el perfil iTRAQ, dos proteínas (DKK1 y ANX4) aumentaron significativamente y cuatro proteínas (ppia, FABP4, ALDH2 y UGDH) se redujo significativamente en los tumores de xenoinjertos sobreexpresión SBP1 (S1) Fig. La alta consistencia indica la alta fiabilidad de los resultados iTRAQ. MS /MS datos de estas seis proteínas se proporcionan (Fig S2).
inhibición tumoral de SBP1 se asoció con múltiples vías de señalización
in vivo
Para determinar los mecanismos adicionales de la inducción SBP1 mediada por la inhibición del crecimiento del tumor y la metástasis, se analizó el crecimiento tumoral y las vías de señalización asociados a metástasis utilizando muestras de proteínas de xenoinjerto de tumor de ratón, que también se utilizaron para el análisis proteómico iTRAQ. En primer lugar, GPX1 se downregulated en los tumores TetSBP1 (figura 4), en consonancia con los observados en los tejidos de cáncer de próstata humano [26], pero era diferente de los
in vitro
estudios que demostraron que la sobreexpresión de SBP1 no afectó GPX1 los niveles de proteína en las células HCT116 aunque las actividades GPx1 se downregulated significativamente [6]. Este hallazgo correlación inversa entre el nuevo sugerido SBP1 y GPX1
in vivo no
in vitro
. En segundo lugar, la inducción de SBP1 condujo a la activación de JNK1 /vía Wnt, en términos de aumento de la fosforilación de JNK1 y c-Jun, y disminución de la expresión de beta-catenina y sus objetivos de abajo ciclina D1, en particular, fosforilados ciclina D1 se downregulated significativamente ( Fig 4). Además, los inhibidores de beta-catenina p53 (p53 fosforilada, p-p53) y p21, un objetivo corriente abajo directa de p53, se incrementa en respuesta a la inducción SBP1 en tumores TetSBP1 ratón (Fig 4). En tercer lugar, la inducción de SBP1 condujo a una reducción significativa de TWIST (Fig 4), un regulador crítico para EMT y la metástasis.
Varios marcadores típicos de diferentes vías de señalización se examinaron usando muestras de proteínas de análisis proteómico iTRAQ. Estas vías de señalización relacionadas con el cáncer responden de manera diferente a la inducción SBP1.
Discusión
La reducción de expresión SBP1 se ha observado en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo colorrectal, de pulmón, de esófago, gástrico, mama y cánceres de hígado, y la reducción de SBP1 se asocia con una baja supervivencia [5]. Disminución de SBP1 aumento de la motilidad celular, promueve la proliferación celular, y suprime la diferenciación de células
in vitro
, aunque los ratones con deficiencia genética SBP1 (es decir SBP1 ratones knockout) no mostraron fenotipos obvias [3,27,28]. Por el contrario, el aumento de expresión SBP1 en las células por transfección del plásmido SBP1 expresan podría conduce a la senescencia, la inhibición de la proliferación de células de cáncer, la migración y el crecimiento tumoral en ratones inmunodeficientes [3,13,29,30]. Nuestros estudios previos han demostrado que SBP1 se redujo en los tumores más colorrectal en comparación con los tejidos no tumorales, mientras que tiene niveles de expresión variables en diferentes líneas celulares de cáncer [6,13,29]. Por ejemplo, SBP1 es altamente expresado en LS174T, Caco-2, HT-29 y MCF-7, pero no detectable en HCT116. Así línea celular de cáncer de colon humano HCT116 se utilizó para sobreexpresar SBP1 en nuestro estudio. En este estudio, el uso de un sistema inducible y modelo de xenoinjerto de ratón, se ha encontrado que
in vivo
inducción de SBP1 mostró significativos efectos contra el cáncer, incluyendo inhibió el crecimiento tumoral y la metástasis en ratones desnudos. Ventajas del uso de este SBP1 Tet-en sistema de expresión génica inducible se enumeran de la siguiente manera: 1) Este sistema de expresión génica inducible hace SBP1 sobreexpresión controlable, por lo tanto, se mantienen las células sin interferencia SBP1 y el daño de la transfección se puede minimizar cuando se necesita la sobreexpresión; 2) En este estudio, la expresión SBP1 no tiene ninguna modificación etiqueta y la proteína expresada permanece en estado natural. Todas estas observaciones sugieren que tanto SBP1 endógeno y ectópico podría servir como un supresor tumoral potencial.
Para determinar los mecanismos moleculares subyacentes, se empleó el ensayo de etiqueta iTRAQ técnica proteómica. Entre las proteínas identificadas 1975, 132 proteínas fueron expresadas diferencialmente en el tejido tumoral inducida por SBP1. Un análisis más detallado reducido las proteínas expresadas diferencialmente en siete proteínas relacionados con el metabolismo de glucosa relacionados con el metabolismo de lípidos y trece. Entre las proteínas relacionados con el metabolismo de lípidos trece, cinco fueron regulados positivamente (DKK1, Hsp60, DHCR7, ANXA4 y AGPAT5) y ocho fueron downregulated (LPCAT2, GPX5, GAPDH, NMe2, ALDH2, BPIFA3, ppia y FABP4). En las proteínas upregulated por inducción SBP1, DKK1 es conocido como un inhibidor de la vía Wnt /β-catenina [18]. Upregulation de DKK1 podría activo quinasa Jun N-terminal (JNK) e inducir la apoptosis [31,32], y puede regular negativamente EMT través de la inhibición TWIST [33]. De hecho, nuestros estudios anteriores han demostrado que la JNK1 activada también puede regular negativamente la β-catenina a través de GSK3-beta [34]. Además, el aumento de expresión de DKK1 podría conducir a regulación a la baja de la ciclina D1, un objetivo corriente abajo directa de beta-catenina. Nuestro trabajo previo ha demostrado también una interacción regulatoria entre JNK1 y p21 [35]. En este documento, se encontró que como respuesta a la regulación al alza de DKK1 y JNK1, p21 y p53 su diana cadena arriba también se incrementaron (Fig 4). Curiosamente, en el camino de la señal Wnt /beta-catenina, hay una interacción entre regulador negativo beta-catenina /ciclina D1 y p53 /p21 [36]. Entre las proteínas relacionados con el metabolismo de lípidos validado, ANXA4 estaba regulada por incremento y ppia se downregulated. Se ha informado de que ANXA4 podría suprime la actividad transcripcional NF-kB mediante la interacción con la subunidad NF-kB p50 [20] y citoquinas (por ejemplo IL-8 [37]). Por el contrario, podría ppia activa ruta de NF-kB y la señalización inflamatoria [24]. Numerosos estudios han demostrado claramente que la activación de NF-kB y la inflamación crónica jugar un papel crucial en la formación y progresión del cáncer [38]. Otra proteína downregulated fue FABP4. Se ha informado de que la FABP4 media los efectos pro-angiogénicos VEGFA-dependientes, que está vinculada a la señalización de Notch durante la carcinogénesis y metástasis [25].
Los siete proteínas relacionados con el metabolismo de glucosa fueron regulados a la baja en SBP1 tejido tumoral inducida , incluyendo GAA, GAPDH, ALDH2, tiorredoxina, ENO3, UGDH y Lumican. UGDH (UDP-glucosa deshidrogenasa) cataliza la oxidación de UDP-glucosa para producir ácido UDP-glucurónico, un precursor del ácido hialurónico (HA) y otros glicosaminoglicanos (GAG) en la matriz extracelular. Un estudio previo ha demostrado que la disminución de UGDH inhibe la agregación celular y la migración [39]. Además, se informó de que ALDH2 inactivación podría aumentar la citotoxicidad producida por la peroxidación de lípidos [40]. Estos resultados sugieren que la regulación a la baja de UGDH y ALDH2 podría ser atribuible a los efectos anticancerígenos de SBP1.
En resumen, mediante el uso de un sistema inducible SBP1 y
in vivo
modelo de ratón, nuestros estudios tienen claramente se muestran los roles que la inhibición tumoral de SBP1 se asocian con alteraciones de las proteínas relacionados con el metabolismo de lípidos /glucosa a través de la participación de múltiples vías de señalización, que revela un nuevo mecanismo molecular de la inhibición tumoral por SBP1.