Extracto
Un fenotipo CpG isla methylator (CIMP) se indica mediante un subconjunto de cánceres colorrectales con una alta frecuencia de la hipermetilación del ADN en un grupo específico de las islas CpG. Estudios recientes han demostrado que una mutación activadora de
BRAF gratis (BRAF
V600E) está estrechamente asociada con CIMP, planteando la cuestión de si BRAF
V600E juega un papel causal en el desarrollo de CIMP o si CIMP proporciona un entorno favorable para la adquisición de BRAF
V600E. Empleamos tecnología de la metilación del ADN GoldenGate Illumina, que interroga a 1.505 sitios CpG en 807 genes diferentes, para estudiar más a fondo esta asociación. En primer lugar, examinamos si la expresión de BRAF
V600E hace que la hipermetilación del ADN expresando de forma estable BRAF
V600E en el CIMP-negativas,
BRAF
de tipo salvaje COLO 320DM línea celular de cáncer colorrectal. Determinamos 100 sitios CpG asociados-CIMP y examinamos los cambios en la metilación del ADN en ocho clones transfectados de manera estable a través de múltiples pasajes. Se encontró que el BRAF
V600E no es suficiente para inducir CIMP en nuestro sistema. En segundo lugar, teniendo en cuenta la posibilidad alternativa, hemos identificado los genes cuya hipermetilación del ADN estaba estrechamente relacionado con BRAF
V600E y CIMP en 235 tumores colorrectales primarios. Curiosamente, los genes que mostró el vínculo más importante son los que median diversas vías de señalización implicadas en la tumorigénesis colorrectal, como
BMP3
y
BMP6 gratis (BMP de señalización),
EphA3
,
KIT
, y
FLT1 gratis (receptores tirosina quinasas) y
SMO gratis (erizo de señalización). Además, hemos identificado la hipermetilación del ADN CIMP dependiente de
IGFBP7
, que se ha demostrado para mediar BRAF
V600E inducida por la senescencia celular y la apoptosis. la hipermetilación del ADN promotor de
IGFBP7
se asoció con el silenciamiento del gen. CIMP-inactivación específica de BRAF
V600E inducida por apoptosis y la senescencia vías por
IGFBP7
hipermetilación del ADN podría crear un contexto favorable para la adquisición de BRAF
V600E en CIMP + cáncer colorrectal. Nuestros datos serán de utilidad para futuras investigaciones hacia la comprensión CIMP en el cáncer colorrectal y la obtención de conocimientos sobre el papel de la hipermetilación aberrante del ADN en la tumorigénesis colorrectal
Visto:. Hinoue T, Weisenberger DJ, Pan F, M Campan, Kim M , J Young, et al. (2009) Análisis de la asociación entre CIMP y BRAF
V600E en el cáncer colorrectal mediante la metilación del ADN de perfiles. PLoS ONE 4 (12): e8357. doi: 10.1371 /journal.pone.0008357
Editor: Chun Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 6 Septiembre, 2009; Aceptado: noviembre 20, 2009; Publicado: December 21, 2009
Derechos de Autor © 2009 Hinoue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Institutos Nacionales de Salud (NIH) subvenciones R01 CA118699-02 (PW Laird), R01 CA075090-09 (PW Laird). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Peter Laird es un consultor para Epigenómica AG y de Celgene Corporation. Los otros autores dan a conocer ningún interés en competencia potencial. Este trabajo no fue apoyada por cualquiera Epigenómica AG o Celgene Corporation. Estas empresas tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Introducción
metilación aberrante del ADN en las islas CpG ha sido ampliamente observado en el cáncer. La hipermetilación del promotor isla CpG asociada con la inactivación de los genes supresores de tumores seleccionados parece ser crítica en los tumores desde el inicio hasta el mantenimiento del fenotipo tumoral [1]. Se han propuesto distintos subgrupos de varios tipos de cánceres humanos para tener un fenotipo isla methylator CpG (CIMP) donde se ha encontrado una frecuencia excepcionalmente alta de la hipermetilación del ADN específico del cáncer [2], [3]. Aunque este concepto ha sido motivo de controversia [4], hemos confirmado la existencia de CIMP en el cáncer colorrectal en un estudio a gran escala completa [5].
CIMP en el cáncer colorrectal puede surgir a través de una vía distinta los procedentes de algunos subtipos de pólipos serrados [6] y se observa en aproximadamente el 15% de todos los casos de cáncer colorrectal [5], [7]. Las características relacionadas con CIMP en el cáncer colorrectal incluyen el sexo (femenino), la localización proximal, y la histología pobremente diferenciado o mucinoso [3], [5], [7], [8]. Nuestro estudio utilizando un panel de marcadores CIMP de nuevo desarrollo en los cánceres colorrectales esporádicos demostró que la inestabilidad de microsatélites (MSI +) se produce como consecuencia de CIMP-asociado
MLH1
hipermetilación del ADN [5]. Además, se encontró una fuerte asociación de CIMP con la presencia de una forma mutante activado de
BRAF gratis (BRAF
V600E) [5]. Tanto CIMP y
BRAF
mutaciones se han reportado en las primeras etapas de la neoplasia colorrectal: CIMP en la mucosa aparentemente normal de los pacientes predispuestos a múltiples pólipos serrados [9] y
BRAF
mutaciones en focos de criptas aberrantes [10].
La vía de señalización RAS-RAF-MEK-ERK se hyperactivated con frecuencia en el cáncer colorrectal.
KRAS
mutaciones ocurren con mayor frecuencia en el 30-40% de todos los cánceres colorrectales [11] y
BRAF
mutaciones están presentes a una frecuencia de 5-22%, en el que el BRAF activada constitutivamente
cuentas variante V600E de ~ 90% de todos los
BRAF
mutaciones [12]. Las mutaciones en
KRAS
y
BRAF ¿Cuáles son en general mutuamente excluyentes, lo que implica efectos aguas abajo equivalentes en la tumorigénesis [13]. Sin embargo, estudios recientes han indicado que las mutaciones de estos genes podrían desempeñar distintas funciones en la iniciación y /o mantenimiento [10] del tumor, [14].
La asociación muy estrecha entre BRAF
V600E y plantea la CIMP cuestión de si BRAF
V600E juega un papel causal en el desarrollo de CIMP o si asociado-CIMP la hipermetilación del promotor ofrece un entorno favorable para la adquisición de BRAF
V600E. En este estudio, se realizaron búsquedas de posibles explicaciones moleculares para la asociación entre BRAF
V600E y CIMP utilizando la plataforma de la metilación del ADN Illumina GoldenGate, que examina el estado de metilación de ADN de 1.505 sitios CpG localizadas en 807 genes. El ensayo de la metilación del ADN GoldenGate ha sido ampliamente utilizado en varios estudios y ahora es un método estándar para el análisis de metilación del ADN [15] - [24]. Los resultados obtenidos de la disponible en el mercado "GoldenGate metilación cáncer Panel I", en particular, se han validado usando otras técnicas [15] - [17], [22], [23], lo que es una fuente fiable para mediciones de metilación del ADN a través de 1.505 loci. No fuimos capaces de demostrar una contribución causal de BRAF
V600E a CIMP en nuestro sistema de cultivo celular. Sin embargo, hemos identificado los genes cuya hipermetilación del ADN se asoció significativamente con BRAF
V600E en los tumores primarios de colon. La inactivación de estos genes específicos en el contexto de la CIMP podría conducir a la adquisición de BRAF
V600E en CIMP + tumores colorrectales.
Resultados
Caracterización de 21 líneas celulares de cáncer colorrectal humano
en primer lugar, tratamos de determinar si la expresión de BRAF
V600E induciría la hipermetilación del ADN CpG en los sitios asociados con CIMP en un
in vitro
sistema de cultivo celular in. Dado que las células epiteliales del colon primarios no estaban disponibles, se hacen pruebas de líneas celulares de cáncer colorrectal que no tienen la metilación del ADN en los loci sustancial CIMP-que definen y llevan a formas de tipo salvaje de ambos
BRAF
y
KRAS
. Tales líneas de células servirían como sistemas adecuados para la introducción de BRAF
V600E. Se seleccionaron 21 líneas celulares de cáncer colorrectal, caracterizado por sus perfiles de metilación del ADN, y se determinó su
BRAF
y
KRAS
estado de mutación (Figura 1). Utilizamos MethyLight para evaluar el estado de metilación de ADN de cinco marcadores que definen CIMP-identificados previamente en nuestro laboratorio [5]. El uso de un PMR (por ciento de referencia metilado) de ≥10 como un umbral para la metilación positivo, se identificaron seis líneas de células que carecían de la metilación del ADN para todos los marcadores de cinco CIMP-específicos (Figura 1). Para probar nuestra hipótesis, que inicialmente elegimos el
BRAF Opiniones y
KRAS de tipo salvaje
líneas de células Caco-2 y COLO 320DM para su facilidad de cultivo y transfección. Sin embargo, el estudio se describe a continuación se limita a las células COLO 320DM, ya que no fuimos capaces de aislar cualquier Caco-2 clones transfectados de manera estable que mostró un nivel detectable de BRAF
V600E expresión (datos no mostrados).
MethyLight se utilizó para evaluar el estado de metilación del ADN de los cinco marcadores CIMP definitorias. A PMR de ≥10 se utilizó como umbral de metilación positivo. Las cajas negras indican PMR ≥10, y las cajas blancas indican PMR & lt; 10. Las frecuencias de metilación del ADN de los cinco marcadores CIMP aumentan de arriba a abajo. estado de inestabilidad de microsatélites para cada línea celular se muestra como microsatélites estables (MSS) o la inestabilidad que alberga (MSI). El estado de la mutación de
BRAF
exón 15 y
KRAS
exón 2 se enumeran.
transfección estable de BRAF
V600E en células COLO 320DM
Estamos transfectadas las células COLO 320DM con una marcada con HA BRAF
V600E ADNc y clones aislados resistentes a G418. El nivel de expresión de BRAF
V600E se determinó por transferencia de Western utilizando un anticuerpo contra el epítopo de HA (Figura 2A). La actividad de BRAF
V600E se confirmó mediante el examen de la activación de ERK1 /2 utilizando un anticuerpo contra fosforilados ERK1 /2 (Figura 2A). Ocho clones transfectados de manera estable que muestran alta expresión de BRAF
V600E, así como una fuerte activación de ERK1 /2, se cultivaron individualmente en cultivo, y se aisló el ADN genómico en varios pasajes (entre 2 y 27) a partir de estos clones. Cuatro vacío en vectores clones transfectadas (EVCS) se cultivaron en las mismas condiciones y se usaron como controles.
(A) Expresión de BRAF
V600E y ERK1 /2 fosforilación en células COLO 320DM transfectadas de forma estable. Las transferencias se sondearon con los anticuerpos anti-HA-HA para BRAF
V600E, anti-fosfo-ERK1 /2, y anti-ERK1. Los asteriscos indican los V600E transfectadas clones ocho BRAF
que fueron sometidos a análisis de la metilación del ADN en varios pases celulares. perfiles (B) de metilación del ADN de las células no transfectadas COLO 320DM, vector vacío y BRAF
V600E transfectaron clones COLO 320DM, tal como se determina mediante el ensayo de metilación del ADN GoldenGate Illumina. Los datos de metilación del ADN se anotó como valores de beta como se define anteriormente [16]. Cada fila corresponde a un locus CpG individuales y los datos fueron ordenados por medio de β-valor en todas las muestras. Cada clon se ordena de izquierda a derecha en el aumento de número de pasajes. EVC: vacío vector transfectadas clones
El análisis de metilación del ADN de la BRAF
V600E transfectadas COLO 320DM clones
A continuación se determinó el estado de metilación de ADN de 1.505 sitios CpG localizadas en. 807 genes diferentes en cada uno de los ocho BRAF
clones V600E y cuatro EVCs utilizando la plataforma Cancer Panel metilación Illumina GoldenGate 1 (Figura 2B). Se encontró que los ß-valores de metilación del ADN en todos los 1.505 sitios CpG en los clones BRAF
V600E transfectadas (independientemente de su BRAF
nivel de expresión V600E) fueron muy similares a las de los clones de control de vacío en vectores y relativamente estable a lo largo hora. Esto sugiere que no hubo un aumento general en la hipermetilación del ADN en BRAF
V600E transfectadas clones en el CpG objetivos analizados (Figura 2B).
Se determinó a continuación si la expresión estable de BRAF
V600E incrementado especialmente la metilación del ADN de sólo marcadores asociados-CIMP en los 1.505 sitios CpG interrogados. Estos sitios se determinaron mediante el cribado de 58 muestras de tumores colorrectales primarios que utilizan la plataforma de la metilación del ADN Illumina GoldenGate (conjunto de datos S1). El estado de la mutación de
BRAF
y
KRAS
en estas muestras se habían determinado previamente [5] (Tabla S1). No supervisada análisis de conglomerados en dos dimensiones de los ß-valores de metilación del ADN reveló un grupo distinto de 11 muestras de tumores, la mayoría de los cuales contenía BRAF
V600E y mostró metilación del ADN frecuente de marcadores asociados-CIMP conocidos, incluyendo
CDKN2A, IGF2
, y
MLH1
(datos no mostrados). Definimos este subgrupo como tumores CIMP-positivos (Figura 3). A continuación, identificaron un total de 100 sitios CpG que tienen niveles significativamente más altos de metilación del ADN en los tumores CIMP-positivo (CIMP +) frente a CIMP-negativo (CIMP-) (
P Hotel & lt; 0,001 después de la corrección para comparaciones múltiples, consulte la sección de Materiales y Métodos) (Tabla S2). Cabe señalar que las reacciones de tres de los marcadores CIMP basados en MethyLight (
CACNA1G
,
Neurog1
, y
SOCS1
) identificada previamente en nuestro laboratorio no se incluyen en la plataforma Cancer Panel metilación Illumina GoldenGate 1. El
RUNX3
Illumina GoldenGate reacciones no demostraron un comportamiento CIMP-específica. Una posible explicación para esta discrepancia podría ser que estas reacciones están diseñados alrededor del sitio de inicio de transcripción de
RUNX3
isoforma 1, mientras que nuestra CIMP-específica
RUNX3
reacción MethyLight está diseñado en la isla CpG promotor de la
RUNX3
isoforma 2 [5]. No vimos ninguna diferencia aparente en la metilación del ADN entre BRAF
V600E transfectadas clones y EVCs en estos sitios CpG asociados-CIMP (Figura 3). Curiosamente, se observó que la metilación del ADN media β-valor de los loci 100 CIMP-específica se incrementó como una función de paso de células (Figura 4A y 4B). Sin embargo, este aumento no se correlacionó con los niveles de BRAF
expresión V600E y también se observó en las células transfectadas con el vector de control (Figura 4B). Este aumento general de la media β-valor es específico para loci asociados-CIMP, ya que la media β-valor de varios conjuntos de 100 sitios CpG seleccionadas al azar no mostró una tendencia similar (Figura 4C y 4D). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que, aunque asociado-CIMP islas CpG pueden ser propensos a adquirir la metilación del ADN en determinadas condiciones de cultivo, BRAF V600E
no induce específicamente CIMP en las células COLO 320DM.
+ CIMP tumores y la CIMP loci -asociado en 58 muestras de tumor primario se define como se describe en la sección Materiales y Métodos. Cada fila corresponde a un locus individual del panel de 100 locus, y los datos fueron ordenados por la media β-valor de cada locus sobre todas las 58 muestras de tumores primarios. Cada BRAF
V600E clon transfectado y EVC se ordena de izquierda a derecha en el aumento de número de pasajes. Los tumores con
BRAF
y
KRAS
mutaciones se indican con un círculo y un triángulo, respectivamente. X: estado de la mutación no está disponible. Cada BRAF
V600E clon transfectado y EVC se ordena de izquierda a derecha en el aumento de número de pasajes. "P" indica los perfiles de metilación del ADN de las células COLO 320DM untransfected padres.
Las líneas negras indican BRAF
V600E expresando clones y líneas grises representan vacío vector transfectadas control de los clones. Cada punto representa la media de gráficos valores de beta a través de sitios CpG indicados a partir del ensayo de metilación del ADN GoldenGate Illumina en varios pasajes para cada clon. (A) todos los loci 1.505 CpG a partir del ensayo Illumina GoldenGate. (B) Sólo 100 loci asociados-CIMP se perfilan. (C) El cien elegido al azar loci CpG. (D) El cien por no CIMP loci, que muestran la media de los valores de ß similares a los loci asociados CIMP-100.
identificación de genes que están metilados significativo en tumores colorrectales que albergan BRAF
V600E
también se consideró la hipótesis alternativa de que la metilación del promotor del gen objetivos específicos proporciona un entorno favorable para la adquisición de
BRAF
mutación en CIMP + cánceres colorrectales. Hemos identificado previamente el estado CIMP y
BRAF
estado de mutación de 235 muestras de tumores primarios de colon [5]. Encontramos BRAF
V600E en 33 tumores (14,0%); 31 de ellos fueron clasificados como CIMP + y sólo 2 como CIMP-. Se realizó el ensayo de metilación del ADN GoldenGate Illumina en estas muestras, y se identificaron 60 genes, representados por 89 sitios CpG metilados, que están significativamente (
P Hotel & lt; 0,001) en los tumores positivos V600E BRAF 33
(Tabla S3). Estos genes son candidatos para la inactivación CIMP-específica, que puede sinergizar estrechamente con el BRAF
V600E para promover la tumorigénesis.
Para validar los datos generados usando la plataforma de la metilación del ADN GoldenGate, se analizó el estado de metilación del ADN de cuatro genes CIMP-específicos (
CALCA
,
EphA3
,
KIT
, y
SLC5A8
) en un subconjunto de cuatro CIMP-positivos y 16 CIMP tumores negativos-en la plataforma de la metilación del ADN Illumina Infinium. Se seleccionaron estos cuatro genes debido a que ambas plataformas analíticas interrogar el estado de metilación del ADN de lo idéntico dinucleótido CpG. A continuación, examinó la concordancia de la metilación del ADN en cada uno de estos loci entre las dos plataformas, y encontramos un alto coeficiente de correlación en todos los casos (
CALCA
: 0,94,
EphA3
: 0,95,
KIT
: 0,95,
SLC5A8
:. 0,86), lo que refuerza el apoyo a nuestra pantalla inicial de la metilación del ADN basada en GoldenGate
confirmado las asociaciones observadas recientemente entre la hipermetilación del ADN de
BMP3
y
MCC
con CIMP + y BRAF
V600E en el cáncer colorrectal [25], [26]. También encontramos CIMP-específica hipermetilación del ADN de
BMP6. Francia El inactivación epigenética simultánea de
BMP3
y
BMP6
ha demostrado ser asociado con la activación de la RAS-RAF vía de señalización -MEK-ERK en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [27]. Por otra parte, hemos observado una asociación de
SLC5A8
y
TIMP3
metilación del ADN con BRAF
V600E en nuestras muestras de tumores colorrectales, como se había informado anteriormente en los carcinomas papilares de tiroides [28]. La consecuencia funcional de la hipermetilación del ADN de estos genes supresores de tumores relacionados con CIMP + y BRAF
V600E sigue siendo especulativa [25] - [28].
Además, se encontró que la metilación del ADN de
SMO
, un componente de la señalización de Hedgehog (Hh), estaba estrechamente ligada con tumores colorrectales con BRAF
V600E (Tabla S3). Curiosamente, se ha informado recientemente de que el aumento de expresión de
SMO
contribuye a la tumorigénesis de colon [29]. Sin embargo, Arimura et al. también mostraron que las líneas celulares de cáncer colorrectal que alberga BRAF
V600E, incluyendo COLO 205, HT-29 y RKO, no parecen mostrar expresión de
SMO
[29]. Nuestros datos indican que CIMP-específica promotor hipermetilación del ADN podría estar implicado en la represión de
SMO Hoteles en tumores colorrectales que llevan BRAF
V600E (Tabla S3).
Promotor hipermetilación del ADN y el silenciamiento transcripcional de
IGFBP7 Hoteles en
BRAF mutante
CIMP + cáncer colorrectal
identificamos la BRAF
IGFBP7
promotor isla CpG como un objetivo para la metilación del ADN en los tumores colorrectales que alberga
V600E (
P
valor = 3.1 × 10
-9, Odds ratio = 12). BRAF
V600E se ha demostrado que induce la senescencia celular [30] - [32]. Oncogene inducida por senescencia (OIS) ha sido reconocido como un importante mecanismo supresor de tumor [33]. El mecanismo molecular subyacente de BRAF
senescencia y la apoptosis inducida por V600E se ha aclarado en un estudio reciente [34]. Se ha demostrado que la expresión de
IGFBP7
es necesaria y suficiente para inducir la senescencia y la apoptosis mediada por BRAF
V600E. Curiosamente,
IGFBP7
ha demostrado ser epigenetically silenciados por hipermetilación de CpG promotor isla específicamente en muestras de melanoma primario que tiene BRAF
V600E, lo que indica que la pérdida de
IGFBP7
expresión es fundamental en el desarrollo de BRAF
melanoma V600E-positivas [34].
el Cancer Panel Illumina GoldenGate metilación 1 plataforma contiene dos
IGFBP7
sondas (IGFBP7_P297_F y IGFBP7_P371_F) que interrogan el estado de metilación del ADN de dos distintos dinucleótidos CpG en el
IGFBP7
promotor isla CpG (Figura 5A). Se encontró que estos dos sitios CpG en el
IGFBP7
promotor son el cáncer, específicamente metilado (Figura 5B) y fuertemente asociado tanto con BRAF
V600E (Wilcoxon la suma de rangos,
P
valor = 2.0 × 10
-10) y CIMP (
P
valor = 3,6 × 10
-9) (Figura 5C). Se ha informado de que los tumores colorrectales con
KRAS
mutaciones también mostrar la hipermetilación del ADN en marcadores asociados-CIMP, aunque a una frecuencia baja, y tienen altos niveles de metilación del ADN de genes que se someten a la edad asociada a hipermetilación del ADN. Estos tumores se han descrito como CIMP-bajo o CIMP2 [35], [36]. No se encontró una asociación entre el
IGFBP7
hipermetilación del ADN y
KRAS
mutaciones cuando se excluyeron los tumores con mutantes
BRAF gratis (
P
valor = 0,85) . De acuerdo con estas observaciones, hemos encontrado que la hipermetilación del ADN de
IGFBP7
es sobre todo presente en líneas celulares de cáncer colorrectal que albergan BRAF
V600E y muestran la metilación del ADN frecuente del panel de marcadores CIMP-específica de cinco genes previamente descrito (Figura 6). En tiempo real RT-PCR análisis de las líneas celulares de cáncer colorrectal mostró que
IGFBP7
la expresión del ARNm estaba inversamente relacionada con la hipermetilación del ADN, como las líneas celulares con
IGFBP7
hipermetilación mostraron poca o ninguna
IGFBP7
la expresión de genes (Figura 6). Entre las células CIMP- hemos examinado, solamente COLO 320DM mostró la hipermetilación del ADN de la
IGFBP7
promotor isla CpG con mínimo nivel de expresión. En retrospectiva, esta característica única de las células COLO 320DM en comparación con las otras líneas celulares CIMP- podría haber permitido a estas células a tolerar mutante
BRAF
sobreexpresión, y puede explicar las dificultades en la obtención de BRAF
V600E clones que expresan en otra línea celular de cáncer colorrectal, como las células Caco-2.
(a) mapa genómico de
IGFBP7
isla CpG promotor asociado, sitio de inicio de transcripción (TSS) y el exón 1 basada en el genoma UCSC navegador (marzo de 2006 ensamblaje). La ubicación de los sitios CpG interrogados por el ensayo de la metilación del ADN GoldenGate Illumina se indica mediante flechas verticales. niveles (B) de metilación del ADN de los dos dinucelotides CpG en el
IGFBP7
promotor isla CpG. ß-valores de cada sitio CpG en 10 tumores (cinco tumores CIMP- de tipo salvaje
BRAF Opiniones y cinco CIMP + tumores con mutantes
BRAF
, barras negras) y adyacentes tejidos no tumorales ( barras grises) se enumeran. (C)
IGFBP7
diagramas de caja promotor de la metilación del ADN de 235 tumores colorrectales humanos estratificados por
BRAF
estado de mutación (izquierda) y CIMP + de estado (derecha) en el
IGFBP7
P371 lugar. En los diagramas de cajas, los extremos de la caja son los cuartiles 25 y 75. La línea dentro del cuadro identifica la β-valor de la mediana. Los bigotes encima y debajo de la caja se extienden a un máximo de 1,5 veces el IQR. El estado CIMP de cada muestra de tumor colorrectal se determina como se describe en la sección Materiales y Métodos.
análisis en tiempo real de RT-PCR cuantitativa de
IGFBP7
expresión.
IGFBP7
niveles de expresión se presentan en relación con
PCNA
expresión. Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado técnicas. El número de loci metilado entre los cinco marcadores y CIMP estado de mutación
BRAF
y
KRAS
que aparece en la Figura 1 se proporcionan.
Discusión
CIMP en el cáncer colorrectal ofrece una oportunidad única para estudiar los mecanismos moleculares que conducen a cambios epigenéticos en el cáncer y las contribuciones de estos cambios en el desarrollo de la enfermedad [3], [37]. Las distintas características que se encuentran en CIMP son claves importantes en la comprensión de este fenotipo [3], [5], [7], [8]. Llama la atención la asociación muy estrecha entre CIMP y BRAF
V600E [5]. Mecanismos que vinculan epigenética (CIMP) y genéticas de interés (
BRAF mutación)
eventos y la secuencia temporal en la que estos dos eventos se llevan a cabo han atraído [37].
En este estudio, mediante el uso de la de alto rendimiento Illumina GoldenGate plataforma de la metilación del ADN, se investigó la relación entre la CIMP y BRAF
V600E en el cáncer colorrectal. Primero probamos si la expresión de BRAF
V600E hace que la hipermetilación del ADN expresando de forma estable BRAF
V600E en el CIMP-negativas,
BRAF
de tipo salvaje COLO 320DM línea celular de cáncer colorrectal. Hemos examinado los cambios de metilación del ADN en 100 sitios CpG asociados-CIMP, y se encontró que BRAF
V600E no es suficiente para inducir la hipermetilación del ADN en estos sitios. Una advertencia de nuestro sistema es que BRAF
V600E podría desempeñar un papel en la inducción de la metilación del ADN solamente temprano en la tumorigénesis colorrectal, como
BRAF
mutaciones se han descrito en la etapa más temprana del desarrollo del tumor [10], [ ,,,0],38], [39]. Es posible que un único conjunto de cambios genéticos y /o epigenéticos que se han producido en las células COLO 320DM podría haber creado un ambiente desfavorable para BRAF
V600E para inducir la hipermetilación del ADN. Experimentos similares a los descritos anteriormente utilizando células Caco-2, que también muestran CIMP- y llevan
BRAF
tipo -wild, no tuvieron éxito. No pudimos obtener cualquier clones transfectados de manera estable que mostraron niveles detectables de BRAF
V600E (datos no mostrados). BRAF sostenida
V600E expresión puede ser incompatible con la proliferación de células Caco-2 debido a la senescencia celular o apoptosis inducida por BRAF
V600E. Es de destacar que nuestro análisis de RT-PCR mostró la expresión robusta de
IGFBP7
, un mediador de BRAF V600E
inducida senescencia o apoptosis, en las células Caco-2 en contraste con las células COLO 320DM.
Anteriormente, hemos descrito la metilación asociada-CIMP de
MLH1
como la base subyacente para la deficiencia de reparación de genes (MSI +) en el cáncer colorrectal esporádico [5]. Minoo
et al.
Informó
MLH1
metilación del ADN tras la transfección estable de BRAF
V600E en la línea celular NCM460 [40]. En nuestro sistema, que no detectó un aumento tal en
MLH1
la metilación del ADN (datos no mostrados). Por otra parte, de los 33 BRAF
tumores primarios V600E hemos examinado sólo el 42% (14/33) mostró
MLH1
hipermetilación del ADN. Por lo tanto, BRAF
V600E puede afectar a la hipermetilación del ADN de
MLH1
pero sólo en determinadas circunstancias. Curiosamente, en la vía serrada propuesto a los tumores CIMP +, tanto
BRAF
mutaciones y CIMP + se han observado en las lesiones precursoras tempranas, mientras que MSI + no tiene [6], [10], [41]. Por lo tanto, la inactivación de
MLH1
podría ocurrir en una etapa posterior del desarrollo del tumor. Minoo y sus colegas observaron la hipermetilación del ADN de
CDKN2A
y otros 15 marcadores asociados-CIMP (
IGFBP7
no fue examinado) en células progenitoras NCM460, lo que limita su capacidad para estudiar más a fondo el papel de BRAF
V600E inducir CIMP en su sistema experimental [40]
.
Curiosamente, se observó que el nivel global de la metilación del ADN de los loci CIMP-específico en nuestras células transfectadas de forma estable aumenta en función de los pasos celulares. Es interesante observar que un fármaco de selección en células cultivadas se ha descrito para dar lugar a cambios en la estructura de la cromatina mundial [42], y un proceso similar puede ser asociado con nuestras observaciones aquí
Además., Encontramos variación relativamente grande entre clonal (entre diferentes clones) en los niveles de metilación del ADN en nuestros experimentos de transfección (figuras 2B y 3), con un promedio R
2 de correlación calculado en base a cuatro EVCs de 0,88 ± 0,01 (± SD). Nuestro promedio intra-clónica (dentro de los clones en diferentes pasajes) R
2 correlación es 0,97 ± 0,01 y el R
2 correlación entre repeticiones técnica en el análisis de metilación del ADN GoldenGate Illumina es de 0,98 ± 0,02 [16]. En consecuencia, hemos encontrado algunas grandes diferencias en la metilación del ADN en varios loci incluso entre los clones de control (Figuras 2B y 3). Esto pone de relieve la importancia de la utilización de múltiples clones para este tipo de estudios.
Por otra parte, la fuerte asociación entre CIMP y BRAF
podría surgir si V600E CIMP proporciona específicamente un contexto celular favorable para BRAF
a V600E promover la tumorigénesis. En la segunda serie de experimentos, se determinó genes cuya hipermetilación del ADN estaba estrechamente ligada con BRAF
V600E y CIMP + en el cáncer colorrectal. Curiosamente, se observó CIMP dependiente de la hipermetilación del ADN y la inactivación transcripcional de
IGFBP7
, que se ha demostrado para mediar BRAF
senescencia y apoptosis [34] celular inducida V600E. BRAF
V600E se ha demostrado que induce la senescencia celular en las células humanas cultivadas y primarios [30], [31], así como modelo de ratón [32]. Oncogene inducida por senescencia (OIS) ha sido reconocido como un importante mecanismo supresor de tumor [33]. Con el fin de BRAF
V600E promover sus efectos oncogénicos, se requieren eventos cooperativos adicionales para evitar la senescencia [33]. Recientemente, la base molecular de BRAF
senescencia y apoptosis inducida por V600E se ha estudiado en detalle. Wajapeyee et al. identificado
IGFBP7
como mediador de BRAF
V600E inducida por senescencia en fibroblastos primarios humanos utilizando una pantalla shRNA de todo el genoma. Sus hallazgos posteriores sugieren que
es necesario y suficiente IGFBP7
expresión para inducir la senescencia y la apoptosis en melanocitos primarios humanos y el melanoma, respectivamente. Por otra parte, se observó pérdida de
IGFBP7 Hoteles en BRAF primarias
muestras de melanoma V600E-positivas y llegó a la conclusión que el silenciamiento de
IGFBP7
expresión es un paso crítico en el desarrollo de un melanoma BRAF albergar
V600E [34].
Promotor asociada isla CpG hipermetilación del ADN de
IGFBP7
se ha informado en líneas celulares de cáncer colorrectal humano también. El inhibidor de la metilación del ADN 5-aza-2 'desoxicitidina se ha demostrado que volver a
IGFBP7
expresión en líneas celulares de cáncer colorrectal, que indica que la hipermetilación del ADN juega un papel importante en el silenciamiento de este gen en el cáncer colorrectal [43 ]. Sin embargo, su asociación con
BRAF
mutación y CIMP + estado en los cánceres colorrectales humanos no ha sido explorado. En este estudio, se encontró que los
IGFBP7
hipermetilación del ADN es y estrechamente asociado con tumores colorrectales que llevan BRAF
V600E y que muestran las CIMP específico de tumor. Por otra parte, se encontró que
IGFBP7
hipermetilación del ADN está asociada con la pérdida de la expresión en líneas celulares de cáncer colorrectal CIMP +. CIMP-inactivación específica de BRAF
V600E-indujeron la senescencia y la vía de la apoptosis por
IGFBP7
hipermetilación del ADN podría crear un contexto favorable para la adquisición de BRAF
V600E en CIMP + cáncer colorrectal.
Es importante destacar que,
IGFBP7
hipermetilación del ADN no se observó en todos los
BRAF
tumores colorrectales mutantes. Lin
et al
. examinado la secuencia de ADN del promotor y exonic regiones de
IGFBP7
en diez líneas celulares de cáncer colorrectal.