Extracto
El potencial de auto-renovación de una célula cancerosa puede estimarse mediante el uso de determinados ensayos, que incluyen los xenotrasplantes en animales inmunocomprometidos o el cultivo en medios de células madre libres de suero no adherentes (SCM). Sin embargo, si las células con potencial de auto-renovación en realidad contribuyen a la enfermedad es desconocida. Aquí se investigó el potencial tumorigénico y destino de las células de cáncer en un modelo de melanoma in vivo. Examinamos las líneas celulares que se derivan de la misma línea parental: una línea celular no metastásico (K1735 /16), una línea celular metastásico (K1735 /M4) y una línea celular que fue seleccionado en condiciones no adherentes (K1735 /16S ). Todas las líneas celulares mostraron una cinética de proliferación similares cuando se cultivan en placas de cultivo. 16 células K1735 /cultivadas en agar blando o en suspensión condiciones no adherentes no lograron formar colonias o esferoides, mientras que las otras líneas celulares mostraron colonogenicity prominente y la capacidad de formación de esferoides. Mediante el uso de esfera análisis de dilución limitante (SLDA) en medio libre de suero, las células K1735 /16S y K1735 /M4 cultivadas en suspensión fueron capaces de formar esferoides incluso en las bajas frecuencias de las concentraciones de, en oposición a K1735 /16 células. El potencial tumorigénico de las líneas celulares se determinó en ratones SCID utilizando inyecciones intra almohadilla plantar. tumores palpables eran evidentes en todos los ratones. De acuerdo con el
estudios in vitro
, la línea celular K1735 /M4 exhibido la cinética de crecimiento más altas, seguidas por la línea celular K1735 /16S, mientras que la línea celular K1735 /16 tenía el potencial de crecimiento del tumor más bajo (
P Hotel & lt; 0,001). En contraste, cuando repetimos los experimentos en ratones C3H /HeN singénicos, la línea de células K1735 /16 produjo tumores macroscópicos 30-100 días después de la inyección, mientras que K1735 /M4 y K1735 /16S tumores derivados regresión espontáneamente en 90 a 100% de los ratones . análisis TUNEL reveló significativamente mayor número de células apoptóticas en los tumores de células K1735 /derivado de la línea 16 y K1735 /M4 en comparación con K1735 /16 tumores (P & lt; 0,001). Los modelos que hemos examinado aquí plantearon la posibilidad, de que las células con actividad de alto tumorigénico pueden ser más inmunogénica y por lo tanto son más susceptibles a la regulación inmune
Visto:. Krelin Y, L Berkovich, Amit M, Gil Z (2013) Asociación entre el potencial tumorigénico y el destino de las células del cáncer del melanoma en un modelo singénico. PLoS ONE 8 (4): e62124. doi: 10.1371 /journal.pone.0062124
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2012; Aceptado: March 19, 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Krelin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel (número 1680-1608 y 482/11), la Asociación de cáncer de Israel (subvención donada por Ellen y Emanuel Kronitz en memoria del Dr. Leon Kronitz número 20090068), el Ministerio de Salud de Israel (número 3-7355 ), el Instituto Weizmann - Sourasky Centro Médico Común Grant, el Tel Aviv Sourasky intramural Grant, el ICRF Barbara S. Goodman dotado el premio de investigación desarrollo de la carrera (2011-601-BGPC) y una beca de la Fundación Binacional EE.UU.-Israel Ciencia (número 2007312) a ZG Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad compleja, que implica las diferencias entre los tumores o células dentro de un tumor dado, así como la variación entre los pacientes. Dentro del espectro de células de un tumor dado, subpoblaciones de células pueden ser fenotípicamente diferentes y exhiben potencial proliferativo distinta. Por ejemplo, el modelo de cáncer de células madre (CSC) sugiere que sólo una pequeña subpoblación de células tiene un potencial de auto-renovación y formación de tumores, mientras que la mayoría del tumor se compone de células no tumorigénicas [1]. La evidencia que apoya el modelo CSC se encuentra en el cáncer de células germinales, leucemia, cáncer de mama, cáncer de colon y en algunos cánceres de cerebro. [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Por otro lado, si los melanomas son consistentes con un modelo de este tipo es un tema de debate continuo [12], [13].
En la actualidad, el único ensayo que determina el potencial tumorigénico de tumores humanos implica el xenotrasplante de diferente subpoblaciones de células cancerosas en los flancos de los animales altamente inmunosupresores (por ejemplo, NOD /SCID). Además, stemness (es decir, la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse) se evalúa con frecuencia
in vitro mediante ensayos
sustitutas que examinan la capacidad de formación de esferas y clonogenicidad en condiciones de anclaje independiente, como semisólido agar blando [ ,,,0],14]. Experimentos previos mostraron que esferoides tumorales multicelulares son morfológicamente y característicamente similar a los tumores sólidos
in vivo
[15], [16]. También se ha demostrado que el potencial de formación de esferas en suspensión condiciones no adherentes se correlaciona consistentemente con el potencial de crecimiento neoplásico en ratones inmunodeprimidos [17], [18], [19], [20].
Tanto
in-vitro
y
in vivo
ensayos stemness abordan el potencial tumorigénico de distinta subpoblación de células, mientras que la formación real de los tumores en pacientes puede depender de otros factores. El microambiente tumoral que puede ser específico del lugar y el sistema inmune del huésped que se ve afectada en ratones NOD /SCID puede potencialmente alterar el destino de las células cancerosas y su contribución a la enfermedad. Por lo tanto, la cuestión de si las células con un alto potencial tumorigénico en realidad contribuyen al crecimiento del tumor en pacientes con un sistema inmunológico intacto sigue sin resolverse
En este trabajo hemos tratado de comparar dos fenómenos relacionados con el desarrollo del cáncer:. Potencial tumorigénico y el destino de las células cancerosas. Para superar dos de las principales limitaciones que son inherentes a los xenoinjertos subcutánea de células cancerosas humanas en ratones inmunodeprimidos, es decir, la barrera de las especies y el entorno del trasplante, se utilizó un modelo de melanoma singénico y las inyecciones intra almohadilla plantar ortotópico en animales inmunocompetentes.
Materiales y Métodos
líneas celulares
líneas celulares de melanoma de ratón (K1735 /16 y K1735 /M4) fueron un regalo del laboratorio del Dr. Lea Eisenbach (Instituto Weizmann, Rehovot ). La línea de células K1735 /16S se deriva de la línea de células K1735 /16, mediante el cultivo de células en condiciones no adherentes (ver abajo) durante 16 días. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con MSCM, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina, a 37 ° C, 5% de CO2, en un incubador humidificado. Todos los ingredientes del medio se compraron a Biological Industries, Israel. Para los ensayos de auto renovación y crecimiento esferoide utilizamos medios melanoma libre de suero de células madre (MSCM) que consistía en medio modificado /F12, SR KnockOut ™ de Eagle de Dulbecco, 100 mM L-glutamina (Invitrogen), MEM no esenciales-Solution Amino Acids 10 mM, 2 mg /ml FGF (Sigma), y antibióticos. Para los ensayos de crecimiento se utilizó esfera MSCM condicionado con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) CF-1 para 24 h. [21] Los reactivos fueron utilizados también como: azida de sodio, paraformaldehído, xileno y citrato de sodio se adquirieron de Sigma Aldrich, Israel
Ratones y la
in vivo
del cojín del pie Modelo
.
C3H /HeN y ratones hembras inmunodeficiencia combinada severa (SCID) se adquirieron de Harlan (Jerusalén, Israel). Todos los ratones se mantuvieron en las instalaciones de animales del Centro Médico de Tel Aviv (Tel-Aviv, Israel), en condiciones asépticas. Se realizaron
Los estudios en animales en el cumplimiento de todas las políticas, procedimientos y requisitos reguladores de la Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), el Centro de recursos de Investigación de Animales (CARR) de la Universidad de Tel Aviv y los Institutos nacionales de Salud (NIH) "Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio". Todos los procedimientos con animales se realizaron por la inhalación de 2% de isoflurano. Después de los estudios, todos los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación.
Se estableció un modelo de melanoma singénico almohadilla de la pata, tal como se describe anteriormente por Harrell et al. [22]. En resumen, treinta, ratones 6 semanas de edad se anestesiaron con isoflurano por inhalación para todos los procedimientos. La almohadilla de la pata trasera izquierda se esterilizó extremidad con alcohol y luego se inyecta lentamente con 50 l de suspensión de células a una concentración de 2 × 10
5 células /50 l durante un período de 2 minutos. Después los ratones se despertaron y su almohadilla de la pata monitorizados para el tamaño del tumor y los signos de dolor o ulceración dos veces a la semana.
Experimento con ratones C3H /HeN singénicos, se repitió 3 veces, y en cada experimento se inyectaron 10 15 ratones por grupo. En los experimentos con ratones SCID se utilizó 6-7 ratones por grupo. En el experimento de clasificación de células, cada grupo (5-6 ratones por grupo) fue inyectado con CD133 ordenada (+), control K1735 /M4 o el control K1735 /16 células a ratones singénicos C3H /HeN.
las muestras de la zona de la inyección de líneas celulares de melanoma se obtuvieron en días 16 y 40, se fijaron en paraformaldehído al 4%, se deshidrataron en alcohol, se aclaró en xileno y se incluyeron en parafina. secciones de cuatro micras fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E), utilizando protocolos establecidos. Para la inmunohistoquímica, las secciones de tejido se desparafinaron en xileno y se rehidratan con la disminución de las concentraciones de alcohol. peróxido endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno y recuperación de antígenos se logra mediante el uso de citrato /L de sodio 0,01 mol (pH 6,0) durante 1 min en una olla a presión. Después de bloquear en el suero normal apropiada, las secciones de tejido se tiñeron con anticuerpos primarios o con el kit de apoptosis Mebstain (ensayo TUNEL) (código 8445 MBL Woburn, EE.UU.). Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: policlonal de conejo anti-ratón /humano Ki67 (1:100; clon ab66155 Abcam Cambridge, Reino Unido), ratón anti-ratón /humano MelanA (1:20; clon ab731 Abcam Cambridge, UK). El kit Vectastain Elite ABC peroxidasa (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) se utilizó para la detección de anticuerpo secundario. La visualización se realiza utilizando DAB como un (ab64238 clon, Abcam Cambridge, Reino Unido) sustrato. Un patólogo examina las diapositivas de una manera ciega
inmunotransferencia
Para la expresión de ABCB5 (1:1000; PAB9925 clon, Abnova la ciudad de Taipei, Taiwán)., La nestina (1:200; mab353 clon , Chemicon, Billerica, EE.UU.) y CD271 /NGFR (1:200; clon sc-8317, Santa Cruz, EE.UU.), las células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos. A continuación, las células fueron puestos en libertad sin digestión enzimática a 4 ° C. Los sedimentos celulares se sometieron a ultrasonidos durante 10 segundos y se clarificaron por centrifugación. La proteína total (50 g) se sometió a electroforesis en 7,5% de geles de Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno, bloqueados y se expone a anticuerpo primario, seguido por un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las bandas se desarrollaron usando un sistema de detección ECL Plus (Amersham, Piscataway, NJ). La densidad se cuantificó usando una cámara CCD controlada por ordenador (AlphaImager Imaging Systems, Alpha Innotech, San Legndra, CA).
citometría de flujo y la célula Ordenando
Para detectar marcadores de superficie de las células tumorales, el melanoma líneas de células se trataron con tripsina o no enzimáticamente independiente con EDTA y se centrifugaron a 1500 rpm /min durante 5 min. [23] En resumen, las células fueron lavadas con Ca
2 + exento de Mg
2 + exento de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y 4 ml de EDTA 1 mM (Sigma Aldrich) se añadió a cada matraz . Los matraces se incubaron a 37 ° C durante 5 minutos y se agitaron lentamente hasta que se desprendieron las células. Diez mililitros de tampón PBS se añadió a continuación en cada matraz y se recogieron las células a tubos, se centrifugaron y se lavaron con Ca
2 + /Mg
2 + libre de PBS. El número de células desprendidas se contó con un hemocitómetro (Marienfeld, Alemania). Las células se recogieron a continuación, se lavó con hielo frío 0.5% de FBS y 0,02% de azida de sodio en PBS y se bloquearon con una solución de 0,5% de FBS y 5 mg /ml purificada anti-CD16 /CD32 (BioLegend, San Diego, EE.UU.) en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se tiñeron para APC conjugado anti-ratón-CD133 mAb (clon 13A4, eBioscience, San Diego, EE.UU.), APC-anti-ratón marcada CD117 (clon 2B8, eBioscience, San Diego, EE.UU.), marcado con FITC-anti Sca-1α de ratón (clon D7, eBioscience, San Diego, EE.UU.), CD271 (clon ab8874, Abcam Cambridge, Reino Unido) y de cabra policlonal secundaria de anticuerpos IgG de conejo (ab6108 clon, Abcam Cambridge, Reino Unido) durante 30 minutos en hielo. a continuación, las muestras fueron lavadas y analizadas con BD FACSCanto ™ II (BD Bioscience, EE.UU.).
En el sistema de separación MACS® de clasificación se utilizó (# 130-090-312, Miltenyl Biotec Inc., EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En pocas palabras: K1735 /M4 células se tiñeron con APC conjugado anti-ratón-CD133 mAb y separación celular procedieron con microperlas anti-APC (# 130-090-855, Miltenyl Biotec Inc., EE.UU.). La partición de células se realizó dos veces con mismas células con el fin de enriquecer la población de células CD133 positivas. Después de población de células positivas de la separación celular CD133 se lavó con PBS y se preparó para inyección (7,5 × 10
4 células /200 l /ratón) o para la verificación por FACS.
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1000 células por pocillo con DMEM-MSCM. Después de 24, 48 y 72 horas, el crecimiento celular se determinó utilizando el ensayo de proliferación celular colorimétrico XTT (Beit Haemek, Israel). Las muestras fueron analizadas con Spectra MR Dynex (Chantilly, EE.UU.).
Ensayo en agar blando
Las alícuotas de 10
4 células de melanoma se resuspendieron en 1 ml de agar, un 0,35% en MSCM. Las alícuotas se vertieron en placas de seis pocillos en la parte superior de una capa de 1,5 ml de 0,5% de agar en MSCM, se deja solidificar y se incubaron durante 21 días a 37 ° C en presencia de 5% de CO2. Los platos fueron fotografiados con un sistema de formación de imágenes estereoscópicas (estéreo Lumar.V12. Zeiss, Alemania) y las colonias número por 1 /cm
2 se estimó después de la adquisición usando ImagJ (NIH, Bethesda, MD) de software de análisis de imágenes.
Evaluación de la formación de esferoides de tumor y Análisis de auto-renovación
Una capa de agar 2 ml más baja fue preparado por re-suspensión de agar 0,5% con MSCM, que se dejó solidificar en placas de 6 pocillos. Partes alícuotas de 3 × 10
4 células de melanoma en MSCM se sembraron en condiciones de suspensión en la capa de agar blando y se incubaron durante 2-16 días a 37 ° C, en presencia de 5% de CO
2 antes del análisis.
Esfera análisis de dilución limitante (SLDA) se realizó como se ha descrito anteriormente. [24] En resumen, las esferas se recogieron después de 14 días se conserva en condiciones de suspensión en placas de 6 pozos, separadas con tripsina y chapado de nuevo en condiciones no adherentes en MSCM usando alícuotas de la dilución de: 1000, 300, 100, 50, 10 células /96 -wells plato. Catorce días después, se cuantificó el número de pozos sin formación de esfera y los datos fueron transformados log y se representó frente densidad de placas. Una regresión lineal se utilizó para calcular la frecuencia de células capaces de proliferar para formar una esfera melanoma.
cuantitativa transcripción inversa-PCR
ARN total fue extraído de las líneas celulares de melanoma de ratón utilizando un Mini RNeasy Kit (Qiagen, Países Bajos), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ARN purificado se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., EE.UU.). El ADNc se sintetizó a partir de 200 ng de RNA total, utilizando el cDNA Kit VersoTM (Thermo Scientific, Epsom, Reino Unido) y hexámeros aleatorios. cDNA de amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando el Platinum® SYBR Verde qPCR Supermix UDG-con ROX (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EE.UU.) en un Paso Uno Plus sistema Real Time PCR (Applied Biosystems) con pares de oligonucleótidos específicos del gen (Sigma Aldrich, Israel). Cada gen se comprobó mediante tres diferentes pares de cebadores, que se enumeran en la Tabla S1. Para asegurar la especificidad de las condiciones de reacción, al final de las carreras individuales, se midió la temperatura de fusión (Tm) de los productos amplificados para confirmar su homogeneidad. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 30 segundos para un total de 40 ciclos. Cada muestra se analizó por triplicado. Para la cuantificación, las curvas de calibración se obtuvieron utilizando cDNA diluido en serie amplificada de la misma en tiempo real PCR plazo. Los resultados se normalizaron a los niveles de mRNA ACTB y 18S. Se aplicó el método 2-ΔΔCT para analizar los cambios relativos en la expresión de genes. Después de que el procedimiento de cuantificación, los productos se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2,5% para confirmar que la reacción se había amplificado fragmentos de ADN del tamaño esperado.
Análisis estadístico
Student
t
ensayos o análisis entre los grupos (ANOVA) se utilizaron para el análisis estadístico según el caso. Las diferencias se consideraron significativas a
P Hotel & lt; 0,05. Todos los datos se representan como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. Todos los experimentos se repitieron por triplicado. se muestran datos de los experimentos representativos.
in vivo
experimentos consistió en 10-15 ratones de cada grupo experimental.
Resultados
Con el fin de evaluar la correlación entre la célula cancerosa potencial de auto-renovación y el destino celular, se seleccionaron las células de melanoma murino, que fueron derivados de la misma línea celular de sus padres, pero que tienen diferentes fenotipos
in vivo
y
in vitro
. La línea de células de melanoma murino K1735 se ha utilizado ampliamente para estudiar melanoma [25]. Esta línea celular, que tiene una baja propensión a formar metástasis, se indujo en los ratones C3H /HeN por la exposición crónica a la radiación ultravioleta B. Para nuestro estudio, hemos escogido tres líneas celulares, que se derivan de esta línea celular de sus padres, pero que diferían significativamente en su potencial tumorigénico, la capacidad de formación de esferas y clonogenicidad [26], [27], [28]. El K1735 /16 es una línea celular no metastásico y la línea celular K1735 /M4 se deriva de una metástasis de pulmón y tiene un alto potencial metastásico. Una tercera línea celular, K1735 /16S, se derivó de la línea de células K1735 /16 mediante el mantenimiento de las células en suspensión condiciones no adherentes durante 16 días. Todas las tres líneas celulares exhibieron la cinética de proliferación similares cuando se cultivan en placas de cultivo (Fig. 1A).
Se determinó
(A) la tasa de proliferación en placas de cultivo tratadas después de 96 horas usando el ensayo XTT. Los datos son la media ± SD de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. (B) Media del número de colonias que crecen en agar blando después de 21 días de cultivo. Los datos son la media ± SD de cinco campos de alta potencia (P & lt; 0,001). (C) imágenes microscópicas representativas de esferoides de tumor 21 días después de la siembra. (D) Las imágenes microscópicas representativos de esferoides tumorales, 6 días después de la siembra en condiciones no adherentes.
Posibles
Las células tumorales formación de colonias en agar blando y Esferoide cultivadas en tres dimensiones multicelular esferoides son considerados por muchos un confiable
in vitro
modelo que reproduce algunas de las características complejas de tumores sólidos [29]. En primer lugar, tratado de caracterizar la clonogenicidad y la capacidad de formación de esferas de tres líneas de células K1735 /16, K1735 /16S y K1735 /M4 en el agar blando. La línea de células K1735 /16 cultivado en el agar blando no logró formar colonias después de 21 días en la cultura (Fig. 1B y C). Por otro lado, tanto la línea celular metastásica K1735 /M4 y la línea celular K1735 /16S tenían prominente una capacidad de formación de colonias (Fig. 1B y 1C). A continuación examinó si la misma heterogeneidad fenotípica se mantiene en suspensión condiciones no adherentes, la cual es considerada por muchos como la aproximación más cercana de
in vivo tumorigenicidad
entre los ensayos in vitro en [30], [31 ], [32], [33], [34]. La capacidad de formación de esferas se evaluó 6 días después de la siembra con MSCM. Una muestra en la figura 1D, el K1735 /M4 y K1735 /16S líneas celulares mostraron una capacidad prominente de formación de esferas, mientras que la línea de células K1735 /16 no logró crecer en estas condiciones de estrés. Sin embargo, cuando las células K1735 /16 se mantuvieron en estas condiciones durante 16-20 días, unos esferoides podría ser detectada en algunos de los platos.
stemness Potencial
Para evaluar la auto-renovación potencial de las tres líneas de células, llevamos a cabo una serie de ensayos de dilución mediante el uso de SLDA en medio libre de suero, dirigida a examinar la capacidad de un análisis de dilución limitante de células de melanoma para formar esferoides en condiciones no adherentes y establecimos una frecuencia análisis de la formación del melanoma esfera. [24], [35], [36] las tres líneas celulares tenían un potencial de proliferación similar cuando sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos en condiciones normales (Fig. 2A). En el contraste, el potencial de auto-renovación en un medio libre de suero de la línea celular no metastásico, K1735 /16, difería significativamente de las otras dos líneas celulares. SLDA realiza después de la segunda resiembra reveló que la frecuencia de células capaces de auto renovación era 1/216 de la línea de células K1735 /M4, 1/296 de la línea de células K1735 /16S y 1/36733 para la línea celular con K1735-16 MSCM (Fig. 2). Además, K1735-16 células no eran capaces de formar esferas en las condiciones adeherent, mientras que las células K1735 /M4 sphares en medio libre de suero formados espontáneamente.
SLDA realiza después de la segunda resiembra con MSCM reveló que la frecuencia de células capaces de auto renovación fue A. 1/216 de la línea de células K1735 /M4, B. 1/296 de la línea de células K1735 /16S y C. 1/74720 para la línea celular K1735-16. La intersección de log (37% pocillos negativos) se utilizó para calcular la frecuencia de formación de esferas (ver materiales y métodos).
En conjunto, estos datos sugieren una heterogeneidad fenotípica de las células de melanoma murino individuales, que se derivan de la misma línea celular de sus padres. El potencial de auto-renovación en el ensayo de suspensión no adherente es comparable a la capacidad de formación de esferas y clonogenicidad en el ensayo de agar blando.
potencial tumorigénico en ratones SCID
A continuación tratamos de evaluar el potencial tumorigénico de las tres líneas celulares en ratones inmunocomprometidos utilizando inyecciones intra almohadilla plantar ortotópico. Esto se evaluó mediante la inyección de 2 × 10
5 recién disociadas K1735 /16, K1735 /K1735 M4 y las células de cáncer /16S en la pata de los ratones SCID. tumores palpables eran evidentes en todos los ratones dentro de 20 días. Como se muestra en la Figura 3A, la línea celular metastásico, K1735 /M4, exhibió la cinética de crecimiento más altas, seguidas por la línea celular K1735 /16S, mientras que la línea celular no metastásico /no colonogenic 1735-1716 tenía el potencial de crecimiento del tumor más bajo (n = 6-7 ratones por grupo,
P Hotel & lt; 0,001). Estos datos sugieren que el potencial de auto-renovación
in vitro
puede predecir el
in vivo
potencial tumorigénico en ratones SCID.
líneas celulares de melanoma (A) (2 x 10
5) inyecta a la almohadilla plantar de ratones SCID. La línea de células K1735 /M4 mostró la cinética de crecimiento más altas del tumor, seguida por la línea celular K1735 /16S. La línea de células K1735 /16 tenía el crecimiento del tumor más lento (n = 5-6 por grupo, P & lt; 0,001). (B) La misma concentración de las células se inyectan en la almohadilla de la pata de los ratones C3H /HeN singénicos. Esta vez, el K1735 /M4 y K1735 /16S mostró potencial tumorigénico mínima, mientras que la línea celular K1735 /16S tuvo el mayor kinetc el crecimiento del tumor (experimentos realizados 3 veces consecutivas con n = 10-15 animales por grupo; P & lt; 0,001 entre el 16S K1735 /16 y el K1735 /M4 o el K1735 /líneas celulares). (C) las características histológicas representativas de tumores que crecen en animales inmunocompetentes, 16 días después de la implantación. (D) El análisis inmunohistoquímico con anticuerpos anti-Ki-67 Ab (un marcador de proliferación) que muestra la expresión similar en las tres líneas celulares. (E) La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-Melan A Ab (un marcador de melanoma) mostró expresión positiva en todos los tumores, pero no en el tejido normal adyacente.
potencial tumorigénico en ratones inmunocompetentes
a continuación, hemos querido evaluar si el potencial tumorigénico de las tres líneas celulares, según lo revelado por los dos
in vivo
y
in vitro
ensayos descritos anteriormente, se puede predecir el destino real de las células cancerosas en animales inmunocompetentes. Esta pregunta sólo puede abordarse en modelos de ratones singénicos que pueden reflejar la reacción inmune anti-tumoral y la respuesta microambiente. Por lo tanto, repetimos las inyecciones intra almohadilla plantar realizados con anterioridad en ratones SCID, pero esta vez utilizando ratones C3H /HeN singénicos.
Para nuestra sorpresa, el destino de las células cancerosas en el modelo singénico era todo lo contrario de lo que se ha descrito previamente en ratones SCID. Como se muestra en la Figura 3B, K1735 células /16 se inyecta en la almohadilla de la pata intra de ratones C3H /HeN mostraron los más altos cinética de crecimiento del cáncer, mientras que sólo un pequeño número de animales desarrollaron tumores después de la inyección de la K1735 /M4 o /línea celular 16S K1735 (experimentos realizado 3 veces con n = 10-15 ratones por grupo,
P Hotel & lt; 0,001). El análisis histológico de los tumores con H & amp; E, y la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-Ki67 Ab (un marcador de proliferación) o anti-Melan-A Ab (un marcador de melanoma) reveló expresión similar de estas proteínas por las tres tumores derivado de la línea de células de cáncer ( La Fig. 3D-E). Más análisis de los tumores individuales revelaron que todos los ratones inyectados con la almohadilla plantar de ratones C3H singénico /gallina con la línea de células K1735 /16 mostraron tumores macroscópicos 30-100 días después de la inyección (Fig. 4A). Por el contrario, algunos ratones inyectados con el K1735 /M4 o K1735 líneas celulares /16S realmente desarrollados tumores pequeños 40 días después de la inyección, pero estos tumores una regresión espontánea en 90 a 100% de los ratones dentro de 80 días después del experimento fue iniciado (Fig. 4B y C).
() Gráficos A-C muestran las curvas de crecimiento de tumores de las tres líneas celulares en ratones singénicos, 1-100 días después de la inyección de 2 x 10
5 células. Cada gráfico muestra el desarrollo de tumores en animales individuales (n = 5 por grupo).
regresión espontánea del tumor en el K1735 /K1735 M4 y líneas celulares /16S puede ser debido a las células en proceso de apoptosis días después de la implantación o Las células restantes en estado latente durante un largo período de tiempo. Por lo tanto, examinó el número de células apoptóticas en estos tumores 40 días después de la inyección en las patas de ratones C3H /HeN. análisis TUNEL de apoptosis reveló un número significativamente mayor de células apoptóticas en los tumores derivados de la línea K1735 /célula 16S y K1735 /M4, en comparación con que los tumores en K1735 /16-derivados (Fig. 5). Este hallazgo indica que el potencial tumorigénico del melanoma es específico del ensayo y que el
in vivo
heterogeneidad fenotípica de las diferentes subpoblaciones de células en animales normales, no pueden predecirse únicamente por su potencial stemness.
La apoptosis se evaluó usando el ensayo de TUNEL. (A-C) imágenes microscópicas representativas (ampliación X20) de células FITC positivas apoptóticos tumorales (verde) y la tinción de contador con yoduro de propidio (rojo). (D) Porcentaje de células apoptóticas se cuantificó por el número medio de células FITC positivas en 6 campos de alta potencia microscópicas. Los datos se expresan como la media + SD (n = 6 tumores, P & lt; 0,001). TUNEL análisis reveló que el número de células apoptóticas en los tumores derivados de la línea K1735 /16 células fue significativamente menor que en K1735 /16S y tumores derivados de líneas K1735 /M4 células.
perfil de expresión de célula madre marcadores
La evidencia sugiere que las células tumorigénicas se pueden distinguir de las células no tumorigénicas basado en la expresión de marcadores específicos. Por lo tanto examinamos la capacidad de los marcadores de células madre reportados para predecir el fenotipo clínico de las tres líneas celulares de melanoma. Se ha demostrado previamente que la c-Kit, CD133 y CD271 ensayos de expresión puede distinguir tumorigénico de células de melanoma no tumorigénicas [13], [37], [38], [39]. También se investigó la expresión de Sca-1α, que fue mostrado estar asociados con potencial tumorigénico en los cánceres de mama, próstata y pulmón [13], [37], [38], [39]. por lo tanto, se examinó la expresión de estos marcadores por citometría de flujo en las tres líneas celulares. Las células fueron separadas utilizando tripsina división o en condiciones libres de enzimáticas utilizando EDTA. Figura 6-tripsina las células tratadas y las células tratadas Figura S1-EDTA muestra que c-Kit, se detectaron células CD133 y CD271 positivas sólo en la minoría de las células. En contraste, la expresión de Sca-1α se encontró en & gt; 50% de las células K1735 /16, pero no en las otras líneas celulares. Estos resultados fueron confirmados por RT-PCR cuantitativa análisis.
se determinó la expresión de marcadores de células madre usando anti-Sca-1α, c-Kit, CD133 y CD271 Abs. A diferencia de los otros marcadores, SCA-1α se expresó en & gt; 50% de las células en la línea de células K1735 /16, pero no en las otras líneas celulares. Los resultados son de uno de los tres experimentos representativos. El porcentaje de células positivas y marcadores se muestran en la esquina superior derecha. Las células de melanoma de ratón B16, médula ósea (BM) o células cerebrales (BC) se utilizaron como controles positivos.
Se buscó además para identificar otros marcadores CSC expresadas por células de melanoma que puede predecir su fenotipo tumorigénico. Por lo tanto, hemos examinado otros 16 marcadores mostrados previamente que se expresa en células madre cancerosas [12], [13], [21], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Utilizando el análisis de RT-PCR cuantitativa no fuimos capaces de detectar más alta expresión de Abcg2, ABCB5, CD20, CD24, CD34, CD44, CD166, Oct4, Cripto-1, CD-90, Gli1 o Sox2 en cualquiera de los K1735 /M4, K1735 /16S y /16 líneas de células K1735 (Fig. 7). Se confirmó estos resultados en algunos de los marcadores por Western blot (Fig. 8). Curiosamente, tres marcadores Nanog, ALDH3A1 y Nestin, se expresaron en la línea celular K1735 /16, pero no en su línea de célula hija K1735 /16S o en la línea celular metastásico K1735 /M4. En total, se proyectó 19 marcadores diferentes que anteriormente se sugiere a ser asociado con el potencial tumorigénico de las células cancerosas, y en todas ellas, las líneas de células altamente oncogénicas K1735 /M4 y K1735 /16S tenido expresión similar o inferior en comparación con el línea celular de bajo tumorigénico.
expresión relativa de 15 marcadores sugirió anteriormente para su uso para predecir el potencial de auto-renovación de las células cancerosas. ALDH3A1, Nanog y nestina se expresan sobre todo en la línea celular K1735 /16, pero no en las líneas de células K1735 /K1735 M4 /16S y. Otros marcadores de células madre, incluyendo SOX2 no mostraron ninguna expresión diferencial entre las tres líneas celulares. Los datos son la media ± SD de tres experimentos diferentes. Se utilizaron células recién disociadas de la médula ósea y el cerebro como controles positivos (columna derecha).
Estos marcadores fueron previamente sugeridos para su uso para predecir el potencial de melanoma auto-renovación. HTB-72 línea celular de melanoma humano y astrocitos murinos (AST) se utilizaron como controles positivos. Tenga en cuenta que el único marcador que fue expresado por las líneas celulares de melanoma murino fue Nestine, que se expresa en la línea celular no metastásico (K1735 /16).
Por último, hemos tratado de confirmar nuestros resultados por célula clonal de clasificación a nivel de células individuales. Este ensayo fue dirigido para determinar si las poblaciones sub de K1735 /M4 pueden dar lugar a una mayor clonogenicidad y auto-renovación.