Extracto
factor de activación de células B (BAFF) es una citoquina que pertenece al factor de necrosis tumoral (TNF) superfamilia. Se ha informado de que BAFF es elevada en pacientes con pancreatitis autoinmune y contribuye a la potencial maligno de cánceres de la sangre y los tumores sólidos. En este estudio, se obtuvo evidencia clínica de aumento de los niveles de BAFF en pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), y las funciones y mecanismos de BAFF en PDAC se aclararon en los tejidos humanos de PDAC y de
in vitro
datos de líneas celulares PDAC. Los niveles séricos de BAFF en pacientes con PDAC fueron significativamente mayores que en los sujetos sanos (p = 0,0121). Los pacientes en estadio IV UICC PDAC (T1-4, N0-1, M1) tenían niveles significativamente más altos de BAFF suero en comparación con los pacientes con PDAC (p = 0,0182). BAFF se expresó notablemente en la infiltración de los linfocitos B que rodea el cáncer de páncreas en tejidos pancreáticos humanos, lo que sugiere que BAFF puede jugar un papel en la progresión del cáncer de páncreas. líneas de células se cultivaron con PDAC BAFF humano recombinante, y se analizaron la morfología y la expresión génica; células del cáncer pancreático cambiaron a una morfología similar a fibroblastos, y mostraron expresión de genes alterados de E-cadherina, vimentina y Caracol. Estos cambios BAFF inducida reflejan la motilidad celular y la invasión mejorada. clones de células BAFF-R que sobreexpresan confirmaron la asociación entre estos cambios inducidos por BAFF y relacionadas con los genes epitelio-mesénquima de transición (EMT). BAFF fue elevado en los pacientes con PDAC avanzado metastásico y alteraciones inducidas en células PDAC través de la regulación de los genes relacionados con la EMT. La elucidación de la función exacta y el mecanismo de control del BAFF puede conducir a nuevos enfoques terapéuticos con el objetivo de mejorar la supervivencia del cáncer pancreático
Visto:. Koizumi, M, Y Hiasa, Kumagi T, Yamanishi H, N Azemoto, Kobata T, et al. (2013) El aumento de células B-factor de activación promueve la invasión tumoral y la metástasis en el cáncer de páncreas humano. PLoS ONE 8 (8): e71367. doi: 10.1371 /journal.pone.0071367
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Enero, 2013; Aceptado: June 28, 2013; Publicado: 6 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Koizumi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, KAKENHI 24.590.980 a YH) y el Programa para la mejora de la educación sistemática en la Escuela de Graduados (MK) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón, y por una subvención-en-Ayudas a la Investigación y Desarrollo (YH) Científica del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón japonés. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres con peor pronóstico en los seres humanos. La tasa de supervivencia a los 5 años de cáncer de páncreas es de sólo 6% debido a la dificultad en el diagnóstico en etapas clínicas tempranas, así como a las metástasis frecuentes [1], [2]. Recientemente, se ha informado de nuevas opciones terapéuticas; Sin embargo, las opciones de tratamiento son limitadas y la respuesta a la quimioterapia sigue siendo baja [3], [4]. La identificación de nuevas dianas para el cáncer de páncreas podría mejorar el pronóstico.
Recientemente se ha informado de que el factor de activación de células B (BAFF), una citoquina proinflamatoria, es elevada en pacientes con pancreatitis autoinmune [5]. BAFF es una citoquina que pertenece a un subconjunto de la superfamilia de factor de necrosis tumoral (TNF). En un experimento anterior en el que se examinaron los niveles séricos de BAFF en pacientes con cáncer de páncreas [5], los pacientes con metástasis parecía tener mayores niveles de BAFF.
BAFF es una glicoproteína péptido ácido 285-amino que se expresa como una proteína transmembrana, y es secretada en una forma soluble a partir de diversos tipos de células (monocitos, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B) [6] - [8]. Se sabe que se asocia con la supervivencia y maduración de los linfocitos B. BAFF es un ligando para tres receptores: BAFF-receptor (BAFF-R) [9]; activador transmembrana, calcio-modulador, y interactor de ligando de ciclofilina (TACI) [10]; y el antígeno B maduración de las células (BCMA) [11]. Por otra parte, una proteína similar a BAFF, nombrado un ligando inductor de proliferación (abril) [12], puede ser un ligando de TACI y BCMA. La unión de BAFF o APRIL a esos receptores puede activar diversas vías de señalización, incluyendo el factor-kB (NF-kB) y la vía nuclear [13] - [15]. Se ha informado de que BAFF y APRIL contribuyen al potencial maligno de cánceres de la sangre y los tumores sólidos [16] - [18]. Sin embargo, los papeles de BAFF, abril, y sus receptores en el cáncer de páncreas aún no se han dilucidado.
En este estudio, se obtuvo evidencia clínica de aumento de los niveles de BAFF en pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), y el papel y el mecanismo de BAFF en PDAC se aclaró desde la evidencia clínica y de
in vitro
datos de líneas celulares PDAC.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras de páncreas
Las muestras de suero se examinaron de 44 pacientes con PDAC y la edad sanos y sexo similares. Para el diagnóstico de la puesta en escena, se utilizó el sistema de metástasis en los ganglios tumorales de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC). Todas las muestras de suero se almacenaron a -80 ° C antes de su uso. Los especímenes de PDAC se obtuvieron de pacientes que se sometieron a cirugía. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes inscritos. El protocolo de estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad de Ehime (Número de autorización: 1107003). Este estudio que incluyó muestras humanas se registró en el Hospital de la Red de Información de la Universidad Médica (UMIN) Ensayos Clínicos registro (número de registro 000 008 654).
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas para BAFF y APRIL
Los niveles séricos de BAFF y APRIL en todos los sujetos se analizaron utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU. para BAFF; BioVendor, Candler, Carolina del Norte, EE.UU. de abril). siguiendo las recomendaciones del fabricante
La inmunohistoquímica de especímenes PDAC
tejidos pancreáticos se fijaron en formalina. Secciones (3 m de espesor) se cortaron de cada bloque y las secciones adyacentes se tiñeron con hematoxilina y eosina estándar (H & amp; E) y técnicas de tinción inmunohistoquímica. muestras embebidas en parafina fueron desparafinados y rehidratados y, a continuación antígenos fueron recuperados por autoclave durante 1 min a 125 ° C en tampón de EDTA (pH 9,0). La actividad peroxidasa endógena se inactivó por incubación con metanol que contiene 1% de peroxidasa de hidrógeno durante 20 min. Las secciones se incubaron a continuación en el suero de bloqueo 1% durante 30 min para reducir las reacciones no específicas. Para la inmunohistoquímica, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla S1) a 4 ° C durante la noche. Las secciones de tejido se trataron con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa (Histofine Simplestain Max PO; Nichirei, Tokio, Japón) durante 1 h a temperatura ambiente, y se incubaron con solución simple DAB de la mancha (Nichirei). Las microfotografías se tomaron usando una Nikon Microphot FXA con una cámara digital Nikon DXM 1200 (Nikon, Tokio, Japón).
Para la tinción de inmunofluorescencia, se montaron y se utilizaron secciones fijadas en formalina. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla S1) a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato, las secciones se incubaron con el burro DyLight488 conjugado anticuerpo anti-cabra de BAFF o BAFF-R, y con el anticuerpo conjugado con DyLight549 burro anti-ratón para CD20. Los núcleos de las secciones se tiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (Wako, Osaka, Japón). Las láminas fueron fotografiado usando un microscopio Zeiss Axioskop 2 Plus fluorescencia y capturado por una cámara digital Zeiss AxioCam HRc (Zeiss, Tokio, Japón) y se guarda en un ordenador. Las fotografías teñidas para BAFF, BAFF-R y CD20 se fusionaron para evaluar sus ubicaciones en las células.
Células y condiciones de cultivo
Cuatro líneas celulares de cáncer pancreático (PANC-1, BxPC-3 , AsPC-1 y MIA PaCa-2 células), que se generaron inicialmente a partir de pacientes con PDAC, y se obtuvieron las células de Ramos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). El PANC-1 y las células MIA PaCa-2 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal 10% (Life Technologies) y 1% de penicilina. células BxPC-3, AsPC-1 y Ramos se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina. Microfotografías se obtuvieron después de varios tratamientos en un microscopio invertido (Olympus IX70, Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara digital Olympus DP12. Después de ser suero de hambre durante 24 h, las células se incubaron con BAFF recombinante (Reliatech, Braunschweig, Alemania) y TGF-β recombinante (amp I +; D Systems) durante 48 h. Para neutralizar el BAFF, cabra anti-BAFF-R anticuerpo (R & amp; D Systems) se utilizó, y el anticuerpo IgG de cabra. (Amp I +; D Systems) se utilizó como un anticuerpo de control
extracción de ARN, síntesis de ADNc y en tiempo real de RT-PCR
El ARN se transcribe de forma inversa usando kits de RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con un oligo d (T)
16 imprimación en condiciones estándar. En tiempo real la amplificación por PCR se realizó con un LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza) y 2 l de producto de ADNc purificado, 0,5 l de cebador sentido (10 pmol /l), 0,5 l de cebador antisentido (10 pmol /l), 1 l de LightCycler Fast Start DNA Maestro SYBR Green I (Roche), y 0,8 l de MgCl
2 (25 mmol /L) (condiciones experimentales y secuencias de los cebadores utilizados para amplificar los genes humanos se indican en la Tabla S2). gliceraldehído fosfato deshidrogenasa Comercial (GAPDH) conjuntos de cebadores y los conjuntos de cebadores beta-actina (Roche) se utilizaron para la amplificación por PCR en las condiciones recomendadas por el fabricante. GAPDH sirvió como un gen de referencia interna, y el cambio relativo se calculó mediante la cuantificación relativa, la aplicación de la fórmula 2
-ΔΔCt. Los productos de reacción se separaron en geles de agarosa al 2%.
Western Blot
Para el Western Blot, 20 g de proteína se aplicó a los carriles de 4% a 12% Bis-Tris geles (Life Technologies ), a continuación, se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), y se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla S1). kits de anticuerpos adecuados específicos de especie conjugados secundarios se obtuvieron comercialmente (GE Healthcare, Tokio, Japón). Las proteínas se detectaron utilizando el kit ECL primer o el kit ECL (GE Healthcare) con un sistema de ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
Se sembraron cicatrización de la herida /cero prueba
células PANC-1 en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h bajo una condición de suero de hambre. Después de confirmar que se había formado una monocapa completa, las monocapas fueron heridos por el rascado líneas con una punta de plástico. Los pocillos se lavaron una vez para eliminar cualquier residuo, y se observaron y fotografiaron bajo el microscopio. A continuación, las placas se incubaron a 37 ° C bajo 5% de CO
2 de 24 h con el BAFF humano recombinante (Reliatech), después de lo cual se observaron y fotografiaron las células. Las células se visualizaron con un microscopio invertido Olympus Modelo IX70 (Olympus) usando un objetivo de 4 ×. Las imágenes fueron capturadas con una DP12 Olympus una cámara digital (Olympus). La distancia que las células habían migrado se midió en las fotomicrografías. El porcentaje de área heridos lleno se calcula de la siguiente manera: {(media anchura herido - media permanecido anchura) /anchura media heridos} x 100 (%) [19]
Invasión de ensayo
Para investigar. la invasión de células, un kit de ensayo de invasión de células de 96 pocillos (Cultrex, Trevigen, Gaithersburg, MD, EE.UU.) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Establecimiento de clones de células transfectantes BAFF-R humanos
clones celulares que sobreexpresan BAFF-R se desarrollaron usando un plásmido, que podría expresar el gen de BAFF-R y el gen resistente a G418 (pBCMGS-BAFF-R) [20]. células PANC-1 se transfectaron con pBCMGS-BAFF-R usando Lipofectamina 2000 (Life Technologies), y los clones de células transfectadas se seleccionan por incubación con G418 (1000 g /ml, Life Technologies). Por último, se establecieron cuatro clones de células que sobre-expresan BAFF-R.
Flujo de análisis de citometría de
análisis de citometría se realizó para las células teñidas PANC-1 y humana BAFF-R transfectadas clones de células de flujo . BAFF-R se detectó con el anticuerpo primario específico para el BAFF-R (Tabla S1), seguido de una incubación adicional con anticuerpo secundario Alexa 488 conjugado de IgG de cabra (Abcam, Tokio, Japón). Esas células teñidas se examinaron usando un citómetro (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) y se analizaron con el software FlowJo (TreeStar Corporation, Ashland, Oregón, EE.UU.).
El análisis estadístico
Todo los análisis estadísticos se realizaron utilizando JMP 8.0 (SAS Institute, Tokyo, Japón). Los datos son expresados medios y error estándar (SE) o medios y desviación estándar (SD). Las diferencias se analizaron mediante la prueba t de Student, test de Wilcoxon y χ
2 test. La significación estadística se definió como p & lt; 0,05 en base a una prueba de dos colas. Las correlaciones entre dos variables se evaluaron mediante el uso del coeficiente de correlación de Pearson, y los valores de p & lt;. 0,05 se considera que representan significación estadística
Resultados
Los niveles séricos de BAFF en pacientes con avanzado PDAC
Los niveles séricos de BAFF y APRIL se examinaron en pacientes con PDAC y en la edad sanos y sexo similares (Tabla 1). Los niveles séricos de BAFF fueron 1.704 ± 1.409 pg /ml (media ± DE) en pacientes con PDAC, significativamente mayor que en los sujetos sanos (1.147 ± 315 pg /ml; p = 0,0121) (Fig. 1A). Por otra parte, los niveles séricos de APRIL en pacientes con PDAC no fueron significativamente mayores que en los sujetos sanos (7,7 ± 2,4 vs. 7,3 ± 2,2 pg /ml, respectivamente; p = 0,895) (Fig 1B.). El aumento de los niveles séricos de BAFF se evaluó por la etapa UICC. Los pacientes con PDAC etapa UICC IV (T1-4, N0-1, M1) tenían niveles significativamente más altos de BAFF suero de los pacientes con estadio UICC Ib-III (2.063 ± 1.736 vs 1.186 ± 328 pg /ml, respectivamente; p = 0,0182) (Fig. 1C). El fondo clínica de los pacientes en cada etapa se indica en la Tabla 2. En cuanto a la relación entre los niveles séricos de BAFF y PDAC el tamaño del tumor, no había una correlación positiva significativa, como se indica en la figura. 1D (r = 0,348; p & lt; 0,001). Esto sugirió que el aumento de los niveles séricos de BAFF estaba asociada con el crecimiento tumoral y la metástasis de PDAC.
(A) Los niveles séricos de BAFF se determinaron en pacientes con PDAC (n = 44) y en sujetos sanos (n = 44). (B) Los niveles séricos de abril se determinaron en pacientes con PDAC (n = 44) y en sujetos sanos (n = 44). se indican los niveles de (C) en suero de BAFF y UICC etapa del PDAC. (D) Los niveles séricos de BAFF y el tamaño del tumor primario de PDAC se correlacionaron significativamente en 44 pacientes (p & lt; 0,001). Los datos se muestran como medias ± SD (* p & lt; 0,05). n.s .; no es significativo.
La expresión de BAFF y BAFF-R en el tejido humano PDAC
Se llevaron a cabo experimentos de inmunohistoquímica para determinar si BAFF se expresa en el tejido pancreático. tejido pancreático a partir de especies quirúrgicas obtenidas de pacientes con PDAC se tiñó para BAFF y BAFF-R (Fig. 2 y 3). Se encontraron Tumor-infiltración de células inmunes que rodea las células PDAC a BAFF notablemente expresa y BAFF-R (Fig. 2). Se realizó la tinción adicional de CD20 (un marcador de linfocitos B), CD3 (receptor de células T, un marcador de linfocitos T) y CD68 (un marcador de monocitos /macrófagos) para identificar sus tipos de células infiltrantes expresan BAFF o BAFF-R. La distribución de BAFF- y células BAFF-R-positivas apareció coherente con la distribución de los linfocitos B, en lugar de la de los linfocitos T o los monocitos /macrófagos (Fig. 2). Recientemente, se ha demostrado que los linfocitos B pueden secretar BAFF [7], [8], [16]. Se realizó tinción de inmunofluorescencia doble con BAFF y CD20, CD3, CD68 (Fig. 3A), y tinción con BAFF-R y CD20, CD3, CD68 (Fig. 3B). La distribución de BAFF (verde) y CD20 (rojo) se fusionó y apareció amarilla (Fig. 3A). Por otra parte, la distribución de BAFF-R (verde) y CD20 (rojo) también se fusionó y apareció amarilla (Fig. 3B). Sin embargo, la distribución de BAFF y BAFF-R no fueron co-localizada con CD3 o CD68. Estos resultados indican que los linfocitos B, que expresan altos niveles de BAFF y BAFF-R, están en el infiltrado y proliferan en el tejido que rodea el PDAC
(A) La tinción con hematoxilina y eosina. (H & amp; E) y se muestran inmunohistoquímica de BAFF, BAFF-R, CD3, CD20 y CD68 en PDAC y los tejidos circundantes. En primer lugar Ab (-) indica el control de tinción sin primer anticuerpo. Los linfocitos B en el tejido circundante PDAC tenían un nivel notablemente alto de expresión BAFF. Magnificación como se indica encima de cada fotomicrografía. Las barras de escala representan 200 micras bajo aumento (x40) y 50 micras con gran aumento (x200 y x400).
(A) La tinción de inmunofluorescencia con BAFF (verde), y CD20, CD3, se muestran CD68 (rojo). La imagen resultante de la concentración se indica como "fusionar". Expresiones de BAFF y CD20 fueron co-localizados (amarillo); sin embargo, no se co-localizan BAFF y CD3 o CD68. se muestra (B) tinción de inmunofluorescencia con BAFF-R (verde) y CD20, CD3, CD68 y (rojo). La expresión de BAFF-R y CD20 fueron co-localizada (amarillo); sin embargo, no se co-localizan BAFF-R y CD3 o CD68. En primer lugar Ab (-) indica el control de tinción sin el primer anticuerpo
La expresión de BAFF receptores en los tejidos PDAC humanos y líneas celulares humanas PDAC
Con el fin de investigar la expresión de receptores de BAFF. en PDAC, inmunohistoquímica se realizó en tejidos PDAC obtenidas de pacientes, así como en líneas celulares PDAC humanos. BAFF-R se expresa en las células PDAC, que tenían señales positivas de MIB-1 y CA19-9 (Fig. 4A, columna de la izquierda). Sin embargo, otros receptores BAFF (TACI y BCMA) no se expresaron en las células PDAC (4A. Fig, columna derecha). Las líneas celulares humanas PDAC, PANC-1, BxPC-3, ASPC-1 y MIA Paca-2, se utilizaron para los
in vitro
estudios. Cualitativa RT-PCR para la expresión del gen de BAFF-R, TACI, BCMA y revelaron única expresión de BAFF-R (Fig. 4B). células Ramos, conocido como un tejido que expresa BAFF-R, TACI y BCMA, se utilizaron como control positivo [21]. Por otra parte, se realizó la transferencia Western para evaluar la expresión de la proteína de estos receptores BAFF (Fig. 4C). La expresión de BAFF-R se confirmó en todas las líneas celulares PDAC, pero la expresión de TACI y BCMA no podía ser detectado. En conjunto, estos resultados mostraron que el aumento de los niveles de BAFF resultado de los linfocitos B infiltrantes y de la proliferación de los tejidos que rodean PDAC; estos mayores niveles de BAFF pueden estimular PDAC través de la señalización de BAFF-R. Para identificar el papel de BAFF en PDAC, un
in vitro
ensayo se realizó usando la línea PANC-1 PDAC célula, su transfectante clonado de BAFF-R, y BAFF humano recombinante para su posterior análisis.
(a) la tinción con hematoxilina y eosina (H & amp; e) y la inmunohistoquímica de MIB-1, se muestran CA19-9, BAFF-R, TACI y BCMA en PDAC. En primer lugar Ab (-) indica el control de tinción sin el primer anticuerpo. La ampliación es como se indica encima de cada fotomicrografía. Las barras de escala representan 200 micras bajo aumento (x40) y 50 micras con gran aumento (x400). (B) Análisis cualitativo RT-PCR de los receptores de BAFF en líneas celulares PDAC. GAPDH se indica como un gen de mantenimiento. ARN aislado de células Ramos se utilizó como control positivo. N.C. es un control negativo sin muestra. (C) Análisis de transferencia Western de los receptores de BAFF en líneas celulares PDAC. β-actina se indica como una proteína de limpieza. células Ramos se utilizó como control positivo. Carolina del Norte es un control negativo sin muestra.
BAFF induce EMT en una línea celular PDAC
En el
in vitro
ensayo, la morfología de las células de la PANC-1 se observó a cambiar después de la adición de BAFF humano recombinante al medio de cultivo (Fig. 5A). Las células parecían adoptar una morfología más similar a fibroblastos (tipo husillo) y demostraron una reducción de contacto célula-célula. Estos cambios morfológicos son similares a los cambios observados con el tratamiento con TGF-β. A partir de este resultado, se planteó la hipótesis de que el aumento de BAFF podría inducir alteraciones en genes relacionados con la transición epitelial-mesenquimal (EMT) en células PDAC. PANC-1 se aisló de tejido indiferenciado PDAC [22] y es positiva para el marcador epitelial E-cadherina y la vimentina proteínas mesenquimales. Por lo tanto, se utilizó PANC-1 como modelo de una célula PDAC que todavía tiene un potencial epitelial. Análisis para la expresión alterada de genes representativos relacionados con EMT se realizó mediante la adición de BAFF recombinante humana al medio de cultivo. Una regulación a la baja significativa de E-cadherina mRNA, así como la regulación positiva significativa de la vimentina y caracol mRNAs, se observó de una manera dependiente de la dosis con BAFF (Fig. 5B). GAPDH mRNA se utilizó como gen de mantenimiento para la PCR cuantitativa, y se confirmó que los niveles de ARNm de GAPDH no fueron alterados por el tratamiento con BAFF (Fig. S1). resultados de transferencia Western para estas moléculas fueron similares a los resultados de tiempo real de RT-PCR (Fig. 5C). Las alteraciones BAFF-inducida en células PDAC fueron similares a las alteraciones observadas durante la EMT. El aumento de BAFF en PDAC podría promover alteraciones genéticas asociadas con la EMT a través de una disminución de la E-cadherina y un aumento de la vimentina a través de las vías de señalización del caracol.
(A) La morfología celular de las células PANC-1 cambió después de la adición de BAFF al sobrenadante. TGF-β se utilizó como control positivo. De manera similar a TGF-β, la adición de BAFF causó la morfología de las células PANC-1 para convertirse husillo-similares. (B) Análisis de tiempo real RT-PCR para marcadores de EMT (E-cadherina, vimentina, y Caracol) se indican. Estos genes fueron modulados en una forma dependiente de la dosis con BAFF. Los datos se muestran como medias ± SE de cuatro experimentos separados (* p & lt; 0,05 vs. BAFF 0 ng /ml). (C) Análisis de transferencia de Western de los marcadores de EMT indica que la expresión de cada proteína se modula mediante la adición de BAFF. β-actina se muestra como una proteína de limpieza.
El tratamiento con BAFF recombinante humana y la motilidad y la invasión de las células PDAC
En conjunción con cambios morfológicos, se sugirió que BAFF induce EMT en PDAC. Estos resultados llevaron a estudio de los otros efectos de BAFF, tales como la motilidad y la invasión. células PANC-1 se incubaron con BAFF recombinante humana, y cambios en la motilidad se evaluaron con la prueba de la curación de heridas /cero. El tratamiento con BAFF aumentó la motilidad de las células PANC-1 y resultó en cierre de la herida acelerado (p & lt; 0,01) (Fig 6A y 6B.). Por otra parte, el tratamiento con BAFF recombinante humana mejoró significativamente la capacidad de las células para invadir la matriz extracelular
in vitro
(Fig. 6C).
(A) La prueba de la curación de heridas /cero indicó que la motilidad de las células PANC-1 se mejoró por 24 h de incubación con BAFF. (B) El porcentaje de área heridos lleno en la prueba de curación de la herida /cero se muestra como un gráfico (* p & lt; 0,01 vs. BAFF 0 ng /ml). (C) El ensayo de invasión muestra la mejora de la invasión con BAFF en células PANC-1 (* p & lt; 0,05 vs. BAFF 0 ng /ml). (D) La prueba de la curación /cero de heridas con anticuerpo neutralizante anti-BAFF-R indicó que la motilidad de las células PANC-1 con BAFF fue inhibida por el anticuerpo. (E) El porcentaje de área heridos lleno en la prueba de curación de la herida /cero se muestra como un gráfico. Los datos se muestran como medias ± SE de seis experimentos separados (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01).
ensayos adicionales se realizaron usando anticuerpo BAFF-R anti-humano, que puede inhibir la unión de BAFF a BAFF-R [23]. Con la adición de BAFF recombinante humano al sobrenadante de las células cultivadas, el área herida por ciento incorrectamente completado aumentó significativamente (15,1 ± 2,3 vs. 27,2 ± 2,3; p & lt; 0,01). Con la adición de tanto BAFF recombinante humana y el anticuerpo BAFF-R anti-humano, cierre de la herida se redujo significativamente en comparación con la adición de anticuerpo de control de cabra (27,2 ± 2,3 vs. 20,9 ± 2,4; p & lt; 0,05). (Fig 6D y 6E ). Estos datos sugieren que la estimulación causada BAFF aumento de la motilidad y la invasión de las células PANC-1.
clones de células BAFF-R-overexpressing y la expresión de genes relacionados con el EMT
Cuatro clones de células que sobreexpresan BAFF pueden -R a través de la transfección con un plásmido (pBCMGS-BAFF-R) [20] y la selección mediante el cultivo con G418 se establecieron. La sobreexpresión de BAFF-R se confirmó en estos clones celulares por transferencia Western y análisis FACS (Fig. 7A y S2). señalización funcional de transducida BAFF-R en estos clones de células se confirmaron mediante la incubación con BAFF (Fig. S3). El aumento de expresión de la proteína p52 de NF-kB fue visto en la transferencia Western, lo que indica que la vía de NF-kB fue activada por la sobreexpresión de BAFF-R; esta activación de la ruta de NF-kB también se reflejó en la disminución de expresión de E-cadherina y el aumento de expresión de vimentina y Caracol en estos clones. Esas alteraciones fueron similares a los resultados del ensayo con BAFF humano recombinante.
Cuatro clones de células PDAC, que pueden sobreexpresan BAFF-R a través de la transfección con un plásmido (-BAFF-R pBCMGS), se establecieron. (A) En los cuatro clones, se confirmó la sobreexpresión de BAFF-R, y no se encontraron las proteínas asociadas con la EMT para ser modulados de una manera dependiente del nivel de BAFF-R. niveles (B) de ARNm de cada gen se evaluaron con el tiempo real de RT-PCR. Los datos se muestran como medias ± SE de cuatro experimentos separados (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 vs. PANC-1). (C) La prueba de la curación /cero de la herida indicó que la motilidad de estos clones de células se mejoró en comparación con el original PANC-1. (D) El porcentaje de área heridos llenado de cada clon en la prueba de curación de la herida /cero se muestra como un gráfico. Los datos se muestran como media ± SE de seis experimentos separados (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente PANC-1).
Además, se evaluó la expresión de ARNm utilizando en tiempo real RT -PCR (Fig. 7B). Se observó una disminución de la E-cadherina ARNm en todos los clones de células BAFF-R-overexpressing, mientras que se observó un aumento de la vimentina y Snail mRNAs en la mayoría de los clones de células. Motilidad de clones de células se confirmó que era significativamente mayor que la de las células no transfectadas-R BAFF PANC-1 en la prueba de curación de la herida /cero (Fig. 7C y D). Tomados en conjunto con los resultados de los clones de células, se confirmó que la estimulación con BAFF induce alteraciones genéticas asociadas con EMT en células PDAC.
Discusión
Este es el primer estudio para informar que los niveles séricos de BAFF se incrementa en pacientes con PDAC, y el primer estudio para investigar el papel de BAFF en PDAC humano. En este estudio, se reveló que: i) los niveles séricos de BAFF en pacientes con PDAC (en particular, en aquellos con metástasis) fueron elevados en comparación con sujetos sanos; ii) los linfocitos infiltrantes de tumores, B expresan BAFF y tejidos PDAC expresan BAFF-R; y iii) aumento de alteraciones genéticas inducidas por BAFF se asociaron con EMT en una línea celular PDAC, y con la motilidad de las células tumorales mejorada y la invasión.
BAFF se sabe que se expresa por monocitos, células dendríticas, linfocitos T, B linfocitos, y células epiteliales [6] - [8], [24], [25]; sin embargo, su perfil de expresión precisa en pacientes con PDAC no se ha definido anteriormente. Recientemente, Nakajima et al. mostró a través de inmunohistoquímica que BAFF-expresan linfocitos B se infiltran en los tejidos sinoviales de la artritis reumatoide [26]. La mayoría de las células que se infiltran en el tejido circundante PDAC en el presente estudio fueron BAFF-expresión de los linfocitos B. Por otra parte, muchos de estos linfocitos B también expresaron BAFF-R. A partir de estos resultados, los linfocitos B que expresan BAFF-infiltran podrían considera que tiene un papel importante en la regulación al alza de BAFF en pacientes PDAC. El aumento de BAFF probablemente tiene un papel en la progresión de la PDAC, porque los niveles séricos de BAFF se upregulated notablemente en los pacientes con avanzado PDAC. BAFF producido a partir de estos linfocitos B también puede tener un papel importante en la supervivencia, la activación y proliferación de la infiltración de linfocitos B que rodean PDAC.
BAFF pertenece a la superfamilia de TNF, y está estrechamente relacionado a abril. Ambos tienen un papel importante en la activación y proliferación de linfocitos B. BAFF se une a los tres receptores de BAFF (BAFF-R, BCMA y TACI), mientras que abril se une a dos de ellos (BCMA y TACI). En el presente estudio, sólo los niveles séricos de BAFF (no de abril) se upregulated significativamente en pacientes con PDAC, y sólo la expresión de BAFF-R puede ser detectada en los tejidos PDAC. Por lo tanto, el papel de BAFF y BAFF-R en PDAC se exploró más. Uno de los mecanismos más importantes de BAFF-inducida es la activación de NF-kB. Se ha informado de que BAFF-R activa NF-kB inductor de quinasa (NIK), y que la activación de NIK induce el procesamiento del factor de transcripción NF-κB2 p100 a NF-κB2 p52 [27], [28]. La correlación entre la activación de NF-kappa B y la expresión de Snail ha sido previamente informado [29]. NF-kappa B parece tener un papel importante en la inducción de EMT
EMT es el fenómeno en el que las células epiteliales se convierten en células mesenquimales.; es fundamental para el desarrollo embrionario e implica profundos cambios fenotípicos, incluyendo la pérdida de la adhesión célula-célula y la polaridad celular y la adquisición de propiedades migratorias e invasivas [30]. En informes anteriores, la EMT se ha caracterizado por la adquisición de una morfología de tipo huso /fibroblástica, la regulación positiva de marcadores mesenquimales como la vimentina, y la regulación a la baja de marcadores epiteliales como E-cadherina [31], [32]. Snail ha sido considerado como un disparador de EMT a través de regulación a la baja de la expresión de marcadores epiteliales y la regulación positiva de la expresión de marcadores mesenquimales [33]. Estas moléculas se upregulated por BAFF en células PDAC; regulación a la baja de E-cadherina y la regulación positiva de la vimentina, también se observaron en estas células
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A partir de los resultados actuales, se propone que BAFF y BAFF-R de señalización induce la EMT en las células PDAC (Fig. 8). células PDAC moduladas por el aumento de BAFF muestran una morfología en forma de huso, la adhesión célula-célula y la polaridad celular perder, y adquieren la capacidad de la motilidad celular y la invasión. Es ampliamente aceptado que la E-cadherina juega un papel crítico en la EMT, un evento temprano en la invasión de células del cáncer y la metástasis [34]. EMT se considera que es un evento importante durante la progresión del tumor maligno y metástasis [35], [36].