Extracto
Antecedentes
Beclin 1 es un actor principal de la autofagia. La expresión de Beclin 1 y su papel pronóstico en el cáncer gástrico es en gran parte inexplorado. El propósito del presente estudio es investigar la expresión de beclin 1 en células de cáncer gástrico, tejidos y su relación con el pronóstico.
Métodos
La expresión de Beclin 1 se detectó en 271 especímenes de ganglios linfáticos positivos pacientes con cáncer gástrico mediante técnicas de inmunohistoquímica. Se estudió la correlación de Beclin 1 de expresión a las características clínico-patológicas y la supervivencia del cáncer gástrico. Beclin-1 de expresión en líneas celulares de cáncer gástrico y muestras clínicas también se detecta mediante PCR con transcripción inversa y Western Blot.
Resultados
beclin 1 está regulado tanto en mRNA y los niveles de proteína en seis líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con los de la línea celular de mucosa gástrica normal (GES-1). La expresión de Beclin-1 en muestras clínicas gástricos es también más alta que las de los tejidos no cancerosos adyacentes. De los 271 pacientes, 229 (84,5%) eran altas Beclin 1 tumores de expresión mediante inmunohistoquímica. Beclin 1 de expresión está estrechamente asociada con embolia intravascular. De Kaplan-Meier análisis mostró alta beclin 1 de expresión se asoció con la supervivencia global más larga. Tanto el análisis univariado y multivariado reveló que Beclin 1 de expresión fueron factores pronósticos independientes en los pacientes con cáncer gástrico con ganglios positivos.
Conclusiones
Nuestros hallazgos sugieren fuertemente que Beclin 1 tiene un papel potencial en la tumorigénesis del cáncer gástrico y podría ser un prometedor biomarcador para predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico ganglios linfáticos positivos. También podría servir como una nueva diana terapéutica para el tratamiento del cáncer gástrico
Visto:. Geng Q-R, Xu D-Z, El L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et al. (2012) Beclin-1 de expresión es un significativo predictor de la supervivencia en pacientes con ganglios linfáticos positivos cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10.1371 /journal.pone.0045968
Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile
Recibido: 4 Abril 2012; Aceptado: 23 Agosto 2012; Publicado: 27 de septiembre 2012
Copyright: © Geng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Médicas de la provincia de Guangdong (núm 2010B031600071). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico sigue siendo un problema importante de salud pública en todo el mundo, especialmente en los países del Este de Asia, la tasa de incidencia estandarizada por edad es & gt; 20 por 100.000 [1]. Para el cáncer gástrico avanzado, su pronóstico sigue siendo pobre, con una tasa de supervivencia global a 5 años estimada de 25% o menos [2], [3]. metástasis en ganglios linfáticos es el más potente indicador de pronóstico después de la resección curativa [4] - [7]. Alrededor del 75% de los pacientes tienen cáncer gástrico avanzado con ganglios positivos, cuyo pronóstico fueron significativamente peores que para aquellos con enfermedad con ganglios negativos [4].
Relación de ganglios linfáticos positivos
En estudios anteriores, hemos encontrado es una organización independiente indicador de pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico ganglios positivos y quimioterapia intraperitoneal puede ser beneficioso [8], [9]. Sin embargo, un paso fundamental hacia la mejora de la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico ganglios linfáticos positivos radica en el mayor conocimiento del comportamiento biológico del tumor y la búsqueda de los posibles objetivos para la terapia individual [10], [11]. Por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) se ha convertido ahora un nuevo marcador de cáncer gástrico después de principios basados en la evidencia [12] .Adding trastuzumab a la quimioterapia estándar podría cambiar la pobre supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico metastásico HER2 positivo [13] - [15]
Recientemente, el papel de la autofagia en el desarrollo del cáncer y el tratamiento del cáncer se ha dado una gran preocupación [16] -. [18]. Beclin 1, un regulador clave de la formación de la autofagia, se encontró que la sobreexpresión en una variedad de cánceres humanos [19] - [22].
Sin embargo, aún hay relativamente pocos estudios que han investigado la asociación entre 1 y beclin cáncer gástrico. En particular, sin embargo, no se han reportado datos con respecto a sus efectos sobre el pronóstico del cáncer gástrico.
El presente estudio investigó Beclin 1 de expresión en células de cáncer gástrico, tejidos y su significado clínico patológica en pacientes con gástrico ganglios linfáticos positivos cáncer. Por otra parte, se analizaron las relaciones entre la expresión Beclin 1 con el pronóstico para determinar si Beclin 1 puede predecir el resultado clínico.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
líneas celulares de cáncer gástrico humano HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 fueron regalos de la Escuela de Oncología de la Universidad de Pekín (Beijing, República Popular de china.) [23], [24]. La línea normal de células de la mucosa gástrica, GES-1, derivado de un epitelio de la mucosa gástrica fetal humano, se obtuvo de la Primera Affiliated Hospital de Sun Yat-Sen Universidad [25]. Estas líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone), penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 unidades /ml) a 37 ° C y 5% CO2 en un incubador humidificado .
PCR con transcripción inversa
El ARN total se extrajo utilizando el método del Trizol. El ARN se trató previamente con ADNasa y se utiliza para la síntesis de ADNc con hexámeros aleatorios. La mezcla (25 l total) para la PCR consistió en 0,5 l de ADNc, 0,5 U de ADN Taq polimerasa, 2,5 l de 10 x tampón de PCR, dNTP 2,5 mM mezcla, y 50 pM de sentido y antisentido cebadores cada uno. Beclin 1 se analizaron mediante cebadores siguientes: 1 beclin 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '
cebador inverso 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';
Actina: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3'
y 5 '3 GTGGTGGTGAAGCTGTAGC '.
análisis de transferencia de Western
las células se lisaron en tampón de lisis y la concentración de proteína se determinó por el método de colorante de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Cantidades iguales de extracto de células se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad). La expresión de Beclin 1 se determinó con un anticuerpo monoclonal de conejo (1:1000, Novus Productos Biológicos, NB500-249) de acuerdo con los protocolos sugeridos por el fabricante.
Pacientes estudiados
El estudio consistió en 271 gástrica los pacientes con cáncer sometidos a resección radical para el diagnóstico histológico de carcinoma gástrico del Centro de cáncer de la Universidad Sun Yat-sen, entre enero de 1998 y diciembre de 2006. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes involucrados en este estudio. La aprobación ética se obtuvo de Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer comité de ética de investigación. Los criterios de elegibilidad incluyeron histológicamente confirmado resección R0, que se define como la ausencia de tumor residual macroscópica y microscópica y el tiempo de supervivencia postoperatoria 6 meses o más. Los pacientes con metástasis a distancia o la terapia preoperatoria o ganglios linfáticos negativos fueron excluidos del estudio. La clasificación 7thTNM por el Comité Conjunto sobre el Cáncer y la Unión Internacional contra el Cáncer criterio se utilizó para la estadificación patológica [26]
Todos los pacientes tuvieron un seguimiento después de la cirugía entre los 6 y 12 meses de intervalo.; La mediana de tiempo de seguimiento fue de 38 meses (rango de 10 a 145) para todos los pacientes. La supervivencia global se define como fue definido como el período entre el momento de la cirugía y la muerte o fue censurado en el último seguimiento.
La inmunohistoquímica
Beclin 1 se detectó con un anticuerpo monoclonal de conejo ( 1:100, Novus Productos Biológicos, NB500-249). Todas las muestras de tumor se obtuvieron de cáncer gástrico resecado quirúrgicamente antes de la terapia adyuvante. , bloques de parafina de tejido fijados con formol se almacenaron a temperatura ambiente identificado por un número de identificación. Los procedimientos se realizaron de manera similar al método descrito anteriormente [23]. Las secciones inmunoteñidas se evaluaron y los tejidos de adenocarcinomas de próstata humanos sirvieron como control positivo. Todas las diapositivas fueron evaluados por dos observadores independientes con base en la proporción de células tumorales teñidas positivamente e intensidad de tinción. De acuerdo con los criterios descritos recientemente por calificar Beclin 1 de expresión, la intensidad de la tinción de membrana varió de débil a fuerte: 0 (sin tinción), 1 (tinción débil), 2 (tinción moderada) y y 3 (tinción intensa) [27]. El porcentaje de células tumorales positivas se puntuó como 0 (& lt; 5%), 1 (6% a 25%), 2 (26% a 50%), 3 (51% a 70%) y 4 (& gt; 70% ). Índice de tinción se calcula mediante la suma de la puntuación de intensidad de la tinción y el porcentaje de puntuación de células positivas. Inmunorreactiva puntuación igual o superior a 4 se utilizó para clasificar los tumores con alta Beclin 1 de expresión, y una puntuación por debajo de 4 tinción se utilizó para indicar una baja expresión Beclin 1.
Los análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software SPSS (versión 18 para Windows, SPSS, Chicago, IL). Las diferencias en P & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. La asociación de Beclin-1 de expresión con varias características clinicalopathologic se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado. Las curvas de supervivencia se trazaron por el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Un modelo de riesgo proporcional de Cox (hacia atrás, pasos) se aplicó para el análisis multivariable de los factores que alcanzó una significación estadística en el análisis univariable.
Resultados
Beclin 1 de expresión en líneas celulares de cáncer gástrico
sobreexpresión de Beclin 1 se ha reportado en muchos tipos de cáncer. Su estado de expresión en líneas celulares de cáncer gástrico, sin embargo, sigue siendo poco clara. Para determinar los niveles de expresión de beclin-1 transcripciones y proteínas, semi-cuantitativa inversa análisis PCR de transcripción y análisis de transferencia Western se llevaron a cabo por separado en células normales humanos gástricos epiteliales (GES-1) y seis líneas celulares de cáncer gástrico (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Se encontró que Beclin 1 ARNm y proteínas nivel de expresión regulada hasta en las seis líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con las células epiteliales gástricas GES-1 normales. (Fig. 1 A y B)
(A) 1 Beclin nivel de expresión de ARNm hasta reguladas en líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con las células epiteliales gástricas normales por PCR con transcripción inversa. (B) Beclin nivel de expresión de proteínas 1 hasta reguladas en líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con las células epiteliales gástricas normales por el Western Blot. (C) Beclin expresión de ARNm 1 es elevada en los tumores gástricos primarios en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes gástricos emparejados por PCR con transcripción inversa. (D) 1 Beclin expresión de proteínas es elevada en los tumores gástricos primarios en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes gástricos emparejados por Western Blot.
Beclin 1 de expresión en tejidos de cáncer gástrico
Para determinar beclin- 1 la expresión de mRNA y proteína en tejidos de cáncer gástrico, 4 emparejado tejidos de cáncer gástrico y los tejidos no cancerosos adyacentes a lesiones de cáncer se detectaron por análisis de PCR con transcripción inversa y el análisis de Western Blot, por separado. Se encontró que Beclin-1 en las cuatro muestras de tejido de tumor tenía una expresión significativamente mayor en los niveles de ARNm y de proteínas que las que en el tejido normal adyacente a los tumores de los mismos pacientes (Fig. 1 C y D).
beclin 1 de expresión en el cáncer gástrico
Para investigar si beclin-1 podría clínicamente se correlacionan con la progresión del cáncer gástrico, expresión y localización subcelular de la proteína beclin 1 fue detectada por inmunohistoquímica en 271 cáncer gástrico tejidos incluidos en parafina. Específico Beclin 1 tinción se encuentra principalmente en la membrana de plasma y el citoplasma en las células cancerosas, de vez en cuando el núcleo. La Figura 2 muestra ejemplos representativos de Beclin 1 inmunotinción. De los 271 pacientes, 229 (84,5%) eran Beclin 1 tumores de alta expresión.
High Beclin 1 (A) y 1 baja expresión Beclin (B) en muestras de cáncer gástrico humano (× 400), Beclin 1 positivo tinción en el tumor y tinción negativa en la mucosa normal adyacente (x 20) (C).
análisis de supervivencia
los pacientes con baja expresión Beclin 1 cáncer gástrico mostró significativamente menor de 5 años tasas de supervivencia global (SG, P = .011; Fig. 3) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS, p = .010; Fig. 4) que aquellos con 1 Beclin los de alta expresión. La expresión de Beclin 1 está estrechamente asociada con embolia intravascular (P = 0,017). Sin embargo, no hubo correlación significativa entre el nivel de expresión de Beclin 1 y la edad, el sexo, el sitio, el tamaño del tumor, la clasificación T, clasificación N, o etapa patológica de pacientes con cáncer gástrico (Tabla 1). Beclin 1 de expresión, sitio, embolia intravascular, la clasificación patológica T., clasificación patológica N y el estadio patológico fueron factores pronósticos independientes en el análisis univariado (datos no mostrados) .En el análisis multivariable, beclin 1 de expresión, embolia intravascular, el sitio y el estadio patológico fueron significativas independiente factor pronóstico de supervivencia (Tabla 2)
.
los pacientes con alta expresión Beclin 1 mostró una supervivencia global significativamente mayor que aquellos con baja expresión Beclin 1. (P = 0,011).
Los pacientes con alta expresión Beclin 1 mostró SSE significativamente más larga que aquellos con baja expresión Beclin 1. (P = 0,010).
Discusión
La autofagia es un mecanismo de auto-degradación y asociada con la progresión tumoral. Beclin 1, un ortólogo de mamífero de Atg6 levadura, juega un papel crucial en el proceso de nucleación de vesículas de la autofagia [28]. Es un gen imprescindible para las primeras fases de la autofagia [29] - [30].
El presente estudio tiene, por primera vez, mostró Beclin 1 es hasta reguladas en ambos niveles de ARNm y proteínas de cada seis líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con los de las células epiteliales GES-1 gástrica normal. También hemos revelado Beclin 1 expresión es elevada en tumores gástricos primarios en comparación con cuatro muestras de cáncer gástrico emparejados adyacentes a los tumores de los mismos pacientes por transcripción inversa-PCR y Western Blot. Los resultados difieren de los reportados en las células de cáncer de hígado y las células de cáncer de cuello uterino, que mostró Beclin 1 de expresión significativamente menor en comparación con los correspondientes tejidos normales [31], [32]. La posible explicación es que beclin-1 de expresión en los cánceres gástricos contribuir a la inducción de muerte celular por autofagia, produciendo de este modo una presión selectiva para anular la muerte celular durante el desarrollo del cáncer [27], [33].
En este estudio , se observó que 229 (84,5%) pacientes tuvieron una alta expresión Beclin 1 de cada 271 pacientes con cáncer gástrico, de acuerdo con la conclusión del estudio previo de los datos Ahn et al.Their no mostró ninguna o muy débil expresión de Beclin1 en células de la mucosa normal de estómago por inmunohistoquímica [27]. Sin embargo, ellos no exploraron la expresión beclin-1 a nivel de ARNm en las líneas celulares, ni investigar su papel en el pronóstico.
A continuación, analizamos la relación entre la expresión de beclin-1 y las características clínicas de los pacientes . No hubo correlación significativa entre la expresión de beclin-1 y la edad, el género, la clasificación T, clasificación N, o etapa de los pacientes con cáncer gástrico. Interesante, en nuestro estudio, hubo una relación significativa entre la expresión de beclin-1 y embolia intravascular. Es lo que sugiere que beclin-1 podría ser utilizado como una embolia intravascular marcador en los pacientes con cáncer gástrico ganglios positivos. Estas observaciones ponen de relieve la importancia del papel de beclin-1 en el desarrollo de cáncer gástrico.
Además, se encontró bajo beclin-1 de expresión está fuertemente asociada con una menor supervivencia en pacientes con cáncer gástrico (
P
= 0,011) y el subconjunto embolia intravascular (
P = 0,017
). En el análisis multivariable, Beclin-1 de expresión mantuvo su independencia como factor pronóstico (
P = 0,044
). Estos resultados sugieren una utilidad potencialmente prometedoras de beclin-1 como un indicador de pronóstico y supervivencia. El mecanismo todavía no está claro. La explicación alternativa para esto puede ser que beclin-1 de expresión en los cánceres gástricos límites inestabilidad cromosómica y disminuye la frecuencia de mutación adicional [34].
A nuestro entender, el estudio es el primer informe que Beclin 1 tenía una significativamente más alta expresión en células de cáncer gástrico y los tejidos tanto en ARNm y los niveles de proteína en comparación con sus homólogos normales. Por otra parte, encontramos alta beclin 1 de expresión se asoció con la supervivencia global más larga. Tanto el análisis univariado y multivariado mostró Beclin 1 de expresión, sitio, embolia intravascular y el estadio patológico fueron factores pronósticos independientes. Los resultados sugieren fuertemente que Beclin 1 tiene un papel potencial en la tumorigénesis del cáncer gástrico. Podría ser un biomarcador prometedor y una nuevas estrategias terapéuticas para los pacientes con cáncer gástrico con ganglios positivos linfático. También se necesitan más estudios para aclarar el mecanismo por el cual el actor autofagia Beclin 1 está implicado en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico.