Crónica enfermedad > Cáncer > artículos del cáncer > PLOS ONE: Berberis libanotica Ehrenb extracto muestra efectos antineoplásicos sobre mango cáncer de próstata /progenitoras Cells

PLOS ONE: Berberis libanotica Ehrenb extracto muestra efectos antineoplásicos sobre mango cáncer de próstata /progenitoras Cells


Extracto

Las células madre del cáncer (CSC), incluyendo los del cáncer de próstata avanzado, son una razón sugerido para la resistencia del tumor hacia la terapia tumoral convencional. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos agentes terapéuticos para la orientación células madre cancerosas. A pesar de la comprensión mínima de sus modos de acción, los productos naturales y las terapias a base de hierbas se han usado comúnmente en la prevención y el tratamiento de muchos tipos de cáncer.
Berberis libanotica
Ehrenb (BLE) es una planta rica en alcaloides que pueden poseer actividad anti-cáncer y un alto potencial para la eliminación de células madre cancerosas. Hemos probado el efecto de BLE en células de cáncer de próstata y nuestros datos indican que este extracto indujo una reducción significativa de la viabilidad celular e inhibe la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata humano (DU145, PC3 y 22Rv1) en una dosis y tiempo dependiente. extracto BLE induce una perturbación del ciclo celular, que conduce a una detención G0-G1. Además, hemos observado 50% de muerte celular, caracterizada por la producción de altos niveles de especies oxidativas reactivas (ROS). La inhibición de la migración celular y la invasión también se consiguió tras el tratamiento con extracto de BLE, lo que sugiere un papel en la inhibición de la metástasis. Curiosamente, el extracto de BLE tuvo un efecto importante en los CAC. Las células fueron cultivadas en un ensayo de esfera-formación 3D para enriquecer una población de células madre /progenitoras cáncer. Nuestros resultados mostraron una reducción significativa en la capacidad de formación de esferas. Tres rondas de tratamiento con extracto de BLE eran suficientes para erradicar la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas altamente resistentes. En conclusión, nuestros resultados sugieren un alto potencial terapéutico de extracto BLE en la orientación de cáncer de próstata y sus células madre cancerosas

Visto:.-El Merahbi R, Liu YN, Eid A, G Daoud, Hosry L, Monzer A, et Alabama. (2014)
Berberis libanotica
Ehrenb extracto muestra efectos antineoplásicos sobre mango cáncer de próstata /Células Progenitoras. PLoS ONE 9 (11): e112453. doi: 10.1371 /journal.pone.0112453

Editor: María Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Italia |
Recibido: 23 de julio de 2014; Aceptado: 8 Octubre 2014; Publicado: 7 Noviembre 2014

Derechos de Autor © 2014 El-Merahbi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Esta investigación fue financiada por fondos del Plan de Ejercicio de la Medicina-MPP (AUB-FM) y el Consejo Nacional Libanés de Investigación Científica (CNRS) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de próstata (PC) es el tumor maligno no cutáneo más comúnmente diagnosticado y la tercera causa más común de mortalidad por cáncer en la población masculina occidental [1], [2]. PC principal es dependiente de andrógenos en la naturaleza y generalmente se trata con terapia de privación de andrógenos (ADT). Con mayor frecuencia, sin embargo, la terapia hormonal conduce a la recurrencia dentro de unos años y PC con el tiempo progresa a un estado independiente de andrógenos o un PC a prueba denominada castración (CRPC). CRPC es una forma agresiva y letal metastásico de PC y en la actualidad, no existe un tratamiento eficaz para ella

Células madre cáncer de próstata (CSC) comparten propiedades con las células madre normales, ya que tienden a expresar altos niveles de.: aldehído deshidrogenasa (ALDH) - una enzima desintoxicante - [3], resistencia a múltiples fármacos (MDR) bombas de salida y transportadores ABC [4] - [6]. Estas estrategias defensivas hacen que la terapia convencional ineficaz, debido a la presencia de células proliferativas rápidos en el volumen del tumor y un gran potencial para dejar las células madre de cáncer /progenitoras putativo [7]. Además, se ha indicado que las CSC de próstata no expresan receptores de andrógenos (AR) [8], [9] y no puede responder a ADT como células tumorales maduros hacen. Después de ADT, las células madre cancerosas pueden administrar con frecuencia para repoblar la masa tumoral con PC independiente de los andrógenos, que es una forma agresiva y letal metastásico de PC.

Una amplia gama de estrategias se han empleado para el descubrimiento de nuevas fármacos que pudieran ser portadores de efectos beneficiosos para los pacientes con cáncer. Se necesita urgentemente una terapia dirigida para erradicar no sólo el grueso del cáncer, sino también la piscina CSC se encuentran dentro del tumor. Trabajo previo en nuestro laboratorio ha demostrado la capacidad de enriquecer una población de células madre /progenitoras de PC por su cultivo en condiciones de cultivo esferas conformación de 3D, es decir, los llamados prostaspheres [10], [11]. Varios estudios han demostrado recientemente que un número de compuestos bioactivos de los alimentos puede tener un efecto anti-CSC. Por ejemplo, recientemente se ha informado de que la palma de aceite extraído gamma-tocotrienol [12], polisacárido-P (PSP), un componente activo extraído de la seta de cola de Turquía [13], y genisteína, un constituyente principal de isoflavonas de soja y productos de soja [14], exhiben una potente actividad inhibidora sobre la capacidad de formación protosphere y tumorigenicidad de las células PC. Estas sustancias han demostrado que el objetivo células madre cancerosas de próstata
in vitro
, y suprimir la formación de tumores
in vivo
. Estos resultados ponen de relieve el uso potencial de los compuestos bioactivos a base de plantas para la producción de agentes terapéuticos focalización CSC, ya sea para la prevención o el tratamiento de la PC.


Berberis libanotica
, específicamente sus raíces, ha sido utilizado en los remedios a base de hierbas tradicionales libanesas para las enfermedades reumáticas y neurálgicas [15], [16].
B. vulgaris
y
B. Stata ¿Cuáles son las dos especies más estudiadas de
Berberis
[17] - [20]. Alcaloides constituyen la principal clase de compuestos reportados de existir en
Berberis
especies y representan una gama muy amplia de metabolitos secundarios con importantes actividades biológicas [21], [22]. Varios alcaloides a base de hierbas exhibición
in vitro e in vivo
efectos antiproliferativos y anti-metastásicos en varios tipos de cánceres. Alcaloides, tales como camptotecina [23] y vinblastina [24], ya se han desarrollado con éxito en fármacos contra el cáncer. La berberina, un importante alcaloide que caracteriza
Berberis
especies, se ha investigado intensamente por sus propiedades farmacológicas. Se ha demostrado inhibir la migración de células de cáncer de melanoma [25], y el crecimiento de tumores de carcinoma epidermoide de lengua humana en un modelo de xenoinjerto murino [26], mejorar la necrosis tumoral relacionado con el factor inductor de apoptosis ligando en cáncer de mama [27], y ejercen un efecto citotóxico contra muchas líneas celulares [25], [28], [29]. Hasta la fecha, las propiedades biológicas y fitoquímicos de
B. libanotica
extractos sólo se han investigado en dos publicaciones informar de la inhibición de células T del adulto viabilidad leucemia a través de la fracción de etanol [30], y la inhibición de las enzimas clave en relación con la enfermedad de Alzheimer [15]. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto del extracto BLE en la PC y la proliferación y viabilidad de las células madre cancerosas. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es investigar la eficacia terapéutica de los
B. libanotica
extracto de raíz (a través de la extracción de amoniaco-diclorometano) en la inhibición de la proliferación y la reducción de la viabilidad de las líneas celulares PC humanas cultivadas en un modelo de monocapa 2D convencional. Por otra parte, este estudio se centrará en un ensayo avanzado (ensayo de formación de esfera) para investigar el efecto del extracto BLE en la selección de una población enriquecida de células madre cancerosas de la próstata.

Materiales y Métodos

Cultivo Celular

líneas celulares de cáncer de próstata humano, PC3, DU145, y 22Rv1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), y fueron enviadas a nosotros como un regalo por el Dr. Kathleen Kelly, de los Institutos nacionales de Salud ( Bethesda, MD). Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 AQ (Sigma, EE.UU.) suplementado con 10% de FBS (Sigma, EE.UU.), 1% de aminoácidos no esenciales de penicilina-estreptomicina (Sigma, EE.UU.) y 1% (Sigma, USA) y se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado (95% de aire, 5% de CO
2). Las células fueron cosechadas por la tripsina-EDTA a 37 ° C (Sigma, EE.UU.). Las células se sedimentaron, se resuspendieron y se transfirió a nuevos-75 cm
frascos de cultivo 2 de tejido para el mantenimiento, o sembradas para los experimentos a una concentración de 1 × 10
4 células /cm
2 para PC3 y Du145 y el 1,5 × 10
4 células /cm
2 para la línea celular 22Rv1.

BLE Extracción

las raíces de
Berberis libanotica
Ehrenb se recogieron en Septiembre de 2011 desde la zona de los cedros en el norte de Líbano (1400-1700 m de altitud, la ubicación aproximada del GPS: N 34 ° 14'41 "; E 36 ° 2'15"). No se necesitaron permisos específicos para estos lugares /actividades, ya que no implican peligro de extinción o especies protegidas. La planta fue identificado por Pr. G. Tohmé (CNRS, Líbano). Las ejemplar de muestra (número de código BLCS12) fue depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias II, Universidad del Líbano, Beirut, Líbano.

Las raíces de las plantas eran de sombra seca y en polvo usando una batidora eléctrica. El extracto de amoniaco-diclorometano se preparó como sigue: 10 g de polvo de planta se humedecieron durante 2 h con NH
solución 4OH seguido de la adición de diclorometano (100 ml). La mezcla se macera durante 24 h bajo agitación magnética, seguido de filtración. La fase orgánica se concentró a 40 ° C bajo presión reducida y crio-seca. Los extractos obtenidos se guardan en un lugar fresco en recipientes oscuros. El evaporador rotatorio utilizado fue IKA RV 10 BASIC y el liofilizador era LYOVAC GT4.

MTT /Ensayo de citotoxicidad

Se midieron los efectos anti-proliferativos y citotóxicos de BLE
in vitro
a través de MTT ([3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio]) ensayos. células DU145 y PC3 se sembraron en 100 l de medio completo en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 7500 células /pocillo y 22Rv1 células a una densidad de 13250 células por pocillo. Las células se incubaron durante la noche en la incubadora y después se trataron por triplicado con diferentes concentraciones de extracto diluido en 100 l medio completo para 24, 48 y 72 h. En el caso del eliminador de ROS N-acetil-L-cisteína (NAC; Sigma), las células DU145 se pretrataron con NAC 5 mM durante 30 minutos y las células se trataron luego con 30 g /ml de extracto de BLE de 24 y 48 h como anteriormente . Para cada punto de tiempo, 20 l de 5 mg /ml - en 1 x se añadió fosfato reactivo -MTT solución salina tamponada (PBS) a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Finalmente, se añadieron 100 l de solución de solubilización a cada pocillo para disolver los cristales de formazán. La reducción de la densidad óptica MTT (OD) se midió a una longitud de onda de 595 nm usando un lector de ELISA (Multiskan Ex). El porcentaje de viabilidad celular se presenta como una relación de OD entre las células tratadas y no tratadas a las concentraciones indicadas.

La exclusión de azul de tripano Método

Se cosecharon los sobrenadantes de células vivas que contienen las células muertas fueron recogidos y unidos por la tripsina EDTA y se añadió al sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en 100 medios de comunicación mu l y 50 l de suspensión de células se mezcló con 50 l de azul de tripano y luego vivir /células muertas se contaron usando un hemocitómetro.

análisis del ciclo celular por citometría de flujo

DU145 y PC3 células se sembraron por duplicado en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo y se incubaron durante 24 h antes del tratamiento de drogas durante 24, 48 o 72 h. Las células se recogieron a continuación, se lavó dos veces con PBS, se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min a 4 ° C, se resuspendieron en 1 ml de PBS frío, se fijaron en 4 ml de etanol absoluto frío y después se almacenó a -20C ° hasta que la tinción y análisis. Las células fijadas se trataron a continuación durante 1 h con 200 g /ml de DNasa libre de RNasa A, se tiñeron con 1 mg /ml de yoduro de propidio (PI) (Sigma, EE.UU.) y se incubaron durante 10 min en la oscuridad en un tubo de flujo (BD Flacon ). La fluorescencia de PI, una medida del contenido de ADN en una población de células, se realizó mediante citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson). Un total de 10.000 eventos cerradas fueron adquiridos con el fin de evaluar las proporciones de células en diferentes etapas del ciclo celular. Análisis de la distribución del ciclo celular se realizó mediante FlowJo Software.

lactato deshidrogenasa (LDH) Ensayo

Se determinó la citotoxicidad de extracto BLE en la línea celular DU145 mediante la medición de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH ) liberada del citosol de las células dañadas utilizando una citotoxicidad Detección Kit PLUS (LDH) (Roche Diagnostics GmbH). El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogieron los sobrenadantes de medio de control y las células tratadas y se añadió un volumen igual de mezcla de reacción. Las mezclas de reacción se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, se determinó la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas ELISA. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como:. (Exp.value - control de la liberación espontánea) ÷ (liberación max.control - control de la liberación espontánea) × 100

detección de ROS por nitro-tetrazolio ensayo

DU145 las células se cultivaron por triplicado en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células /cm
2 y luego se incubaron durante 24 h antes de la BLE tratamiento de los extractos para 24, 48 o 72 h. En cada condición, la producción de ROS se evaluó mediante un ensayo de nitroazul de tetrazolio (NBT, Sigma). Los medios de cultivo fueron aspirados y las células se incubaron en PBS que contenía 1 mg /ml de NBT en 37 ° C en la oscuridad durante 60 minutos. NBT se redujo en un ROS a una forma insoluble de color azul oscuro de NBT formazán llamada que podría ser visualizado. Para cuantificar el producto de formazán, el formazano se solubilizó en intracelular KOH 2 M y DMSO 5 solución M, y se determinó la absorbancia a 630 nm usando un lector de placas de ELISA.

Apoptosis Ensayo

La apoptosis se ensayada mediante la fragmentación del ADN celular ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) para la detección de fragmentos de ADN marcadas con BrdU en sobrenadantes de cultivo y lisados ​​celulares. El ensayo se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante y como se describe anteriormente [31]. Las células se incubaron con 30 g /ml de extracto de BLE durante 48 h en presencia o ausencia de 5 mM N-acetil-L-cisteína que se añadió 30 minutos antes del tratamiento BLE. La apoptosis en las células no tratadas de control se ajustó a 100% y los resultados se representaron como porcentaje de control.

Cicatrización de heridas ensayo

Para la curación de heridas, o el ensayo cero, las células se sembraron en una de seis placa -bien con los mismos números, y se incubaron hasta que alcanzaron el 80-90% de confluencia. Las células se trataron a continuación con 10 g /ml de mitomicina C (Sigma) durante 2 h con el fin de bloquear la proliferación celular. Una punta de 200 l estéril se utiliza para heridas al rayado de la misma anchura en cada monocapa, las placas se lavaron dos veces con PBS para eliminar las células separadas, y las células restantes se cultivaron en medio completo con o sin tratamiento. Las fotografías fueron tomadas posteriormente a 0, 12, 30, y 48 h. La distancia recorrida por las células en el área herida enumeró el cierre de las heridas. El experimento se repitió tres veces con mediciones por duplicado en cada experimento.

Esfera Formación Ensayo

En este estudio, las tres líneas celulares, PC3, DU145 y 22Rv-1, fueron capaces de formar esferoides en la cultura no adherente, lo que sugiere la presencia de células madre, como el cáncer dentro de estas líneas celulares. Después de contar la suspensión de células individuales de líneas de células de cáncer de próstata, una concentración de 1.000 células /pocillo se suspendió en frío Matrigel ™ /libre de suero RPMI-1640 (1:01) en un volumen total de 50 l. Las células se sembraron uniformemente de manera circular alrededor del borde inferior de un pocillo en una placa de 24 pocillos y se deja solidificar en la incubadora a 37 ° C durante 45 minutos, antes de 0,5 ml de RPMI-1640 completo -2% de medio FBS ( se añadió suavemente con o sin tratamiento) en el medio de cada pocillo. Esferas fueron repuestos con los medios de calentamiento como en la siembra original (con o sin tratamiento) cada dos a tres días. Las esferas se contaron después de 13 días. Para propagar esferas, se aspiró el medio y Matrigel ™ se digirió con 0,5 ml de solución de dispasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1 mg /ml, disuelto en RPMI-1640 medio incompleto) durante 60 minutos a 37 ° C. Se recogieron las esferas, se incubaron en 1 ml de tripsina EDTA caliente a 37 ° C durante 5 minutos, y después se pasa a través de una jeringa de calibre 27 5 veces. Las células se contaron mediante un hemocitómetro y re-sembrado.

Transwell invasión Ensayo

Para el ensayo de invasión, 2,5 × 10
5 células fueron sembradas en un medio libre de suero con o sin tratamiento en la cámara superior en el Matrigel ™ presenta el revestimiento de membrana (inserto de 24 pocillos; tamaño de poro, 8 m; Falcon), y se utilizó un medio suplementado con suero como un quimioatrayente en la cámara inferior. Cada pocillo se recién recubierto con 100 l de Matrigel ™ (BD Bioscience) a una dilución de 1:10 en PBS frío y fue luego durante la noche antes de iniciar el ensayo de invasión se secó al aire. Las células se dejaron migrar a través de la membrana recubierta con Matrigel ™ a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 y 48 h. Las células no migratorias en la cámara superior se rasparon suavemente con un aplicador de punta de algodón. células invasoras en la superficie inferior de la membrana fueron fijadas y teñidas con hematoxilina y eosina. Después de la tinción, el número total de células invasoras se contó con el microscopio óptico (objetivo × 10) a partir de 6 campos consecutivos para cada pozo.

extracción de RNA y PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR)

ARN total fue extraído a partir de células, tratados o no tratados con 30 mg /ml de extracto de BLE durante 48 h, usando el Kit RNeasy Micro (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc a partir de ARN total utilizando el Sistema de Síntesis de Super Escritura III Primera Strand para RT-PCR (Invitrogen), y la PCR se realizó usando Platinum Taq polimerasa (Invitrogen). Para RT-PCR cuantitativa, la etapa de amplificación se realizó utilizando el verde mezcla maestra de PCR SYBR (Applied Biosystems, Bedford, MA). Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado utilizando los cebadores específicos enumerados a continuación y todos los valores se normalizaron a la casa de mantenimiento de genes GAPDH. Los cebadores utilizados fueron: GAPDH-F: 5 'ACCTGGCTAGCGAAAAGCAA3'; GAPDH-R: 5'CCACTTTGTCAAGCTCATTTCCT3 '; Sox2-F: 5'AACCCCAAGATGCACAACTC3 '; Sox2-R: 5'GCTTAGCCTCGTCGATGAAC3 '; Oct4-F: 5'AGAACATGTGTAAGCTGCGG3 '; Oct4-R: 5'GTTGCCTCTCACTCGGTTC3 '; Nanog-F: 5'ACCTCAGCTACAAACAGGTGAA3 '; Nanog-R: 5'AAAGGCTGGGGTAGGTAGGT3 '; CD44-F: 5'TTTGCATTGCAGTCAACAGTC3 '; CD44-R: 5'GTTACACCCCAATCTTCATGTCCAC3 '; CD166-F: 5'TGGCAATATCACATGGTACAGG3 '; CD166-R:. 5'AGCCTTGGTTGTCTTGTACTC3 '

Análisis de Datos

El análisis estadístico se realizó utilizando Microsoft Excel 2013. La importancia de los datos se analizaron mediante la prueba t de Student, y las diferencias entre los dos significa con p & lt; 0,05 (*) y p. & lt; 0,01 (#) se consideraron significativos y muy significativa, respectivamente

resultados

extracto inhibe la proliferación de células PC BLE de la dosis y dependiente del tiempo de manera

Nuestro primer objetivo fue investigar la
in vitro
efectos del extracto BLE sobre el crecimiento celular y la viabilidad de PC. El uso de ensayos MTT (Fig. 1A), la actividad de proliferación de líneas de células PC se encontró Du145, PC3 y 22Rv-1 que se correlaciona inversamente con la concentración del extracto en el medio de cultivo. Después de 72 h de tratamiento, el efecto inhibidor se inició a bajas concentraciones y la proliferación significativamente inhibida por 50% cuando se hicieron crecer células PC en medios suministrados con 30 g /ml de extracto de BLE. Sin embargo, a una concentración de extracto de alta (100 mg /ml), se logró de manera significativa alrededor de 75% del efecto anti-proliferativo. Estos resultados fueron compatibles con los cambios de confluencia en cultivo (Figura S1) y verificado mediante ensayos de exclusión con azul de tripano (Fig. 1B). A altas concentraciones (60 y 100 g /ml), el aumento se observó citotoxicidad y la muerte celular.

Después de la incubación de las líneas celulares de cáncer de próstata tres (DU145, PC3 y 22Rv-1) para 24, 48 y 72 h con o sin tratamiento con extracto de BLE, se determinó la proliferación celular. Los resultados se expresan como porcentaje del grupo estudiado comparación con su control. Los datos representan un promedio de cinco experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01).

extracto BLE inducida por la toxicidad celular en la línea celular DU145
era citotóxica
BLE e indujeron significativa la muerte celular en la línea celular DU145 de la dosis y tiempo-dependiente (Fig. 2). El potencial citotóxico del extracto BLE se determinó sobre la base de la medición de la enzima LDH intracelular, que es una enzima citosólica estable liberado en el medio de cultivo celular a daño de la membrana de plasma. Un efecto citotóxico 30% se logró de manera significativa a las 48 h con 100 g /ml y a las 72 h con 60 g /ml. Sin embargo, el porcentaje máximo de la muerte celular fue de alrededor de 50% después de 72 h de tratamiento a una concentración de 100 mg /ml de extracto de BLE.

La muerte celular se determinó por la lactato deshidrogenasa (LDH) de ensayo tratados con o sin concentraciones indicadas de extracto de BLE para 24, 48 y 72 h. La muerte celular se calculó como el porcentaje de liberación de LDH de acuerdo con una fórmula anteriormente mencionada. Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01).

BLE pro-oxidativo inducido por la actividad DU145 muerte celular

intracelulares especies reactivas del oxígeno (ROS ) de producción se midió utilizando nitroazul de tetrazolio (NBT). La intensidad del colorante es inversamente propotional a la presencia de ROS. Los resultados de la Figura 3 indican la dosis y de la reducción dependiente del tiempo de NBT. reducción de NBT se inició a 24 h con 100 g /ml, mientras que el porcentaje máximo de reducción de NBT fue después de 72 h de tratamiento con 100 mg /ml de extracto de BLE. Curiosamente, en presencia de un eliminador de ROS (N-acetil-L-cisteína, NAC), BLE no afectó la viabilidad celular a las 24 h y 48 h. Además, BLE inducida por la fragmentación del ADN celular, indicativo de apoptosis y muerte celular, no se observó en la presencia de NAC (Fig. S2). Esto sugiere que el extracto BLE induce la muerte celular por la inducción de la producción de ROS.

producción de ROS se midió por la reducción de nitroazul de tetrazolio (NBT) en la línea celular DU145 con o sin tratamiento con las concentraciones indicadas de extracto BLE para 24, 48 y 72 h. reducción de NBT se calculó como el porcentaje del control del mismo grupo. Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01).

BLE extractos inducidos detención del ciclo celular en la fase G0-G1

En un intento de entender cómo el extracto BLE es capaz de disminuir el número de células e inhibir la proliferación celular, hemos tratado de analizar el ciclo celular. Se examinó la distribución de contenido de ADN celular por citometría de flujo después de 24, 48 y 72 h de tratamiento. Análisis del ciclo celular reveló que la distribución de contenido de ADN se altera en las células PC3 BLE tratadas (Tabla 1) y DU145 (2 Tabla). Como se resume en la Tabla 1, el tratamiento BLE de células PC3 con ya sea 10 mg /ml o 30 g /ml provocó un aumento, dentro de las 24 h, en el número de células en la fase G1 del ciclo celular, proporcionando evidencia de detención en G1. A las 48 h y 72 h después del tratamiento, la población de G1 aumentó de menos de 50% en el control a más de 60% en células PC3 tratadas con extracto de BLE a 10 mg /ml o 30 mg /ml. Curiosamente, esto se asoció con una disminución concomitante en el porcentaje de células en fase S y una acumulación de células en fase pre-G1 (G0). El mismo perfil se observó cuando las células DU145 se sometieron al mismo tratamiento y el análisis (Tabla 2). Estos datos sugieren que el tratamiento con BLE en una perturbación del ciclo celular.

extracto BLE reducen en gran medida las capacidades de migración e invasión de células DU145

A continuación, se determinó la efecto del extracto BLE sobre la migración celular y la invasión ,, dos fenotipos que están asociados con la progresión de la metástasis. Utilizando un ensayo de cicatrización de heridas, en presencia de mitomicina C para inhibir la división celular, el tratamiento BLE suprimió significativamente la capacidad de la migración celular de las células DU145 en comparación con el control, por lo que la herida estaba completamente curada después de 48 h (Fig. 4A y B) . Estos datos son compatibles con el ensayo de invasión donde tras el tratamiento con 30 g /ml de extracto de BLE, la capacidad de invasión, en respuesta a FBS, se redujo significativamente por más de tres pliegues en comparación con el control (Fig. 4 C y D). Curiosamente, el tratamiento BLE redujo significativamente la invasión basal (sin FBS) de las células en comparación con el control. Por otra parte, y después de corregir por el efecto sobre la proliferación /apoptosis, el efecto de BLE sobre la invasión siguió siendo significativa entre el tratamiento y el grupo control. Esto sugiere que el extracto de BLE tiene un alto efecto inhibidor sobre la migración celular y la invasión de PC.

(A) Un cero, en las células DU145, se hizo utilizando una punta amarilla, y se tomaron imágenes a T = 0 h, 12 h, 30 h y 48 h con o sin tratamiento, y la cuantificación de el diámetro de la cierre de la herida se evaluó con el tiempo (B). Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01). (C): imágenes representativas de ensayo de invasión trans pocillos. las células DU145 se sembraron en el Matrigel ™ presenta el revestimiento de la membrana en la cámara superior de la trans pocillos y fueron ya sea tratados o no tratados con 30 mg /ml de extracto de BLE en la presencia o ausencia de FBS en la cámara inferior. Las células que invadieron a la cámara inferior después de 48 h se fijaron con metanol, se tiñeron con H & amp; E, se contaron y se representa como un porcentaje de células invadidas en comparación con el control (D). Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01).

extracto BLE dirigido una población enriquecida de células madre /progenitoras PC utilizando 3D esferas de formación de ensayo

La capacidad para formar y propagar esferas en cultivo no adherente es una de las características de células madre cancerosas. Para confirmar que el tratamiento BLE puede inhibir la próstata propiedades CSC, la formación de prostaspheres de líneas de células PC fue estudiada en la presencia o ausencia de extracto BLE. En este ensayo, prostaspheres se generaron mediante la incorporación de 1000 células por pocillo en un solo Matrigel ™ a una concentración de suero baja (2% de FBS). Después de cultivar las células DU145 durante 13 días, un bajo número de estas células fueron capaces de formar esferas tumorales en condiciones no tratados con una unidad de formación de esferas (SFU) de 6,8%. Sin embargo, el tratamiento con 20 mg /ml o 30 g /ml de extracto de BLE redujo significativamente el número de prostaspheres en más de un 50% (Fig. 5A). Además, no se observaron ámbitos en los pocillos tratados con el extracto de BLE a una concentración por encima de 30 mg /ml. Curiosamente, el tamaño medio de prostaspheres extracto tratado con BLE fue significativamente menor en comparación con el control (Fig 5B y D) y esto podría ser explicado por la reducción significativa en el número medio de células por prostasphere como se muestra en la figura 5C.

(A) Unidad de formación de esferas (SFU) se muestra con o sin tratamiento BLE (20, 30, 60 y 100 mg /ml). esferas generados se denominan como G1 Generación esferas (1). SFU se calcula según la siguiente fórmula: SFU = (número de esferas contó ÷ número de celdas de entrada) x 100. Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01). (B) Imágenes representativas de prostaspheres DU145 con o sin tratamiento BLE. Las imágenes fueron visualizadas por microscopio Carl Zeiss un aumento de 10x y analizados por Carl Zeiss Zen 2012 la imagen del software. (C) Cuantificación del diámetro medio de prostaspheres DU145 con o sin las condiciones de tratamiento. Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01). (D) La cuantificación del número medio de células por prostasphere DU145 con o sin tratamiento. Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01).

actividad de auto-renovación se considera que es una de las principales características de las células madre /progenitoras. Por lo tanto, para asegurar que nuestro extracto es capaz de dirigirse a la piscina CSC auto-renovación, la actividad de formación de esferas se evaluó durante cinco generaciones. Se recogieron las células DU145 que fueron capaces de formar esferas en la primera generación (G1) y se propagan por disociar esferas en células individuales y luego el mismo número de células (1000 células /pocillo) fue re-cabeza de serie. El ensayo se realizó hasta que la quinta generación (G5), siguiendo un diseño experimental se ilustra en la figura 6B. El tratamiento con 20 mg /ml de los extractos de BLE fue suficiente para reducir significativamente la capacidad de formación de esfera a alrededor de 50% cuando se trataron una vez y constantemente durante cinco generaciones (Fig. 6A). Curiosamente, después de un tratamiento sucesivo y la propagación de las células que fueron capaces de resistir y sobrevivir el primer tratamiento BLE en G1, SFU extremadamente degradado se produjeron en G2, y no hay prostaspheres se formaron en el G3. En particular, las células que fueron tratadas una vez en G1 fueron capaces de recuperar su capacidad de formación de esferas en la propagación adicional de los prostaspheres en ausencia de cualquier tratamiento (Fig. 6B). Esto sugiere que es necesario un tratamiento con extracto de serie BLE y es capaz de dirigirse a las células madre cancerosas altamente resistentes, y por lo tanto su capacidad de extinción de auto-renovación. Notablemente, las células tratadas con 30 g /ml de extracto de BLE mostraron una reducción significativa en los niveles de expresión de Sox2, Oct4, Nanog, CD44 y CD166, todos los marcadores que se sabe que se expresan en las células madre de cáncer de próstata, en comparación con las células control no tratadas (Fig. S3).

(A) obtenido a partir de SFU prostaspheres pases seriados durante cinco generaciones se muestra en condiciones no tratados (siempre control) y con 20 g /ml de extracto de condición BLE-tratado (tratado una vez después de la propagación de control). (B) de próstata CSC se enriquecieron de la línea celular DU145 y se trató con cualquiera de extractos BLE (20 g /ml) o medios (de control) (G1). Después de cada propagación, las células que se trataron inicialmente con el extracto BLE (20 g /ml) o medio (control) se sembraron en pocillos separados. Las esferas se propagaron durante cinco generaciones en los duplicados de cada condición. SFU se cuenta y un promedio de dos experimentos independientes se representa. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05;#P & lt; 0,01).

Discusión y Conclusiones

El objetivo general de la terapia del cáncer es apuntar sólo las células cancerosas , dejando a las células normales viables indemne. En este estudio,
Berberis libanotica
extracto mostrado efectos anti-neoplásicas mediante la reducción de la viabilidad y la proliferación de líneas celulares de tres PC en un tiempo y dependiente de la dosis de forma, con lo que la línea celular 22RV-1 mostró una mayor sensibilidad al tratamiento que las otras dos líneas celulares (PC3 y DU145). Una concentración de 30 mg /ml de extracto de BLE tuvo éxito en el logro de IC50, mientras que una concentración de 60 mg /ml indujo una inhibición de la proliferación del 70% y la muerte celular se logró a 100 mg /ml.

El conocimiento de la salud

La supervivencia de pacientes con cáncer de próstata afecta a su Income

Men están ganando más de 20 libras después de veinte años ti

Inhibe el crecimiento celular y el amianto mesotelioma Concentrations

muertes entre los trabajadores es una parte triste de la his

cáncer de pulmón del asbesto - cáncer de pulmón symptoms

Asbestos mesotelioma es la forma más común de cáncer de meso

Mesotelioma pronóstico: ¿Cuáles son las posibilidades mesotelioma

Pronóstico:? Cuáles son las probabilidades? Algunos paciente

Enfermedades de sentido común

Enfermedad del corazón | Enfermedades artículos | Enfermedad pulmonar | las preguntas más frecuentes de salud | Salud mental | Diabetes | El sentido común de la Salud | Enfermedades comunes | senior Health | Primeros auxilios
Derechos de autor © Crónica enfermedad[www.enfermedad.cc]