Extracto
Antecedentes
Bmi1 es un componente integral de la Polycomb represivas complejo 1 (PRC1) y participa en el patogénesis de múltiples tipos de cáncer. También juega un papel clave en el funcionamiento de las células madre endógenas y células madre de cáncer. El trabajo previo implicado un papel para las células madre de cáncer en la patogénesis de cáncer de páncreas. La hipótesis de que Bmi1 desempeña un papel integral en la mejora de la tumorigenicidad de páncreas y la función de las células madre del cáncer en el adenocarcinoma ductal pancreático.
Métodos
midieron los niveles endógenos Bmi1 en los adenocarcinomas ductales pancreáticas humanas primarias, de páncreas neoplasias intraepiteliales (PanINs) y páncreas normal mediante técnicas de inmunohistoquímica y Western Blot. La función de Bmi1 en el cáncer de páncreas se evaluó mediante la alteración de la expresión Bmi1 en varios sistemas de modelo celular mediante la medición de la proliferación celular, la apoptosis celular, invasión in vitro, resistencia a la quimioterapia, y el crecimiento in vivo y la metástasis en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas. También se evaluó la frecuencia de células madre del cáncer, tumorsphere la formación y el crecimiento in vivo de xenoinjertos de cáncer de páncreas humano en Bmi1 después de silenciamiento.
Resultados
Bmi1 se sobreexpresa en PanINs humanos, cánceres pancreáticos, y en varias líneas celulares de cáncer de páncreas. La sobreexpresión de Bmi1 en las células MiaPaca2 dio lugar a un aumento de la proliferación, la invasión in vitro, mayor en los tumores in vivo, más metástasis y la resistencia a gemcitabina mientras que los resultados opuestos se observaron cuando Bmi1 fue silenciado en células Panc-1. Bmi1 se sobreexpresa en el compartimiento de células madre del cáncer de xenoinjertos de cáncer de páncreas humanos primarios. tumorspheres pancreáticas también demostraron altos niveles de Bmi1. El silenciamiento de Bmi1 inhibió la formación de tumorsphere secundaria y terciaria, disminuyó el crecimiento de xenoinjertos primaria de páncreas, y bajó la proporción de células madre cancerosas en el tejido de xenoinjerto.
Conclusiones
Nuestros resultados implican Bmi1 en la invasión y la el crecimiento de cáncer de páncreas y demostrar su papel clave en la regulación de las células madre del cáncer de páncreas
Visto:. Proctor e, M Waghray, Lee CJ, Heidt DG, Yalamanchili H, Li C, et al. (2013) Bmi1 mejora la tumorigenicidad y el cáncer Stem la función celular de adenocarcinoma pancreático. PLoS ONE 8 (2): e55820. doi: 10.1371 /journal.pone.0055820
Editor: Klaus Roemer, Universidad de la Escuela de Medicina Sarre, Alemania |
Recibido: 31 Agosto, 2012; Aceptado: 2 Enero 2013; Publicado: 20 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Proctor et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por los Institutos nacionales de Salud R01 CA131045 y el Fondo de la Familia Rogel Rich para la investigación de cáncer de páncreas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDA) es un cáncer epitelial altamente agresivo con el peor pronóstico de cualquier enfermedad maligna importante con una tasa de supervivencia a 5 años informaron de aproximadamente 5%. Es la cuarta causa principal de muerte por cáncer al año en los Estados Unidos y en todo el mundo octava con una incidencia esperada de 43.920 casos en 2012 en los Estados Unidos solamente [1]. A pesar de los avances en nuestra comprensión de esta enfermedad, los eventos moleculares que subyacen al desarrollo y progresión del cáncer de páncreas aún no se conocen y pueden ser la clave para el desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces y novedosos.
B-por células sitio específico Moloney virus de leucemia murina de inserción 1 (Bmi1) es un miembro de la familia grupo Polycomb de proteínas que se encontró inicialmente para inducir la formación de linfoma murino de la cooperación con c-Myc [2], [3]. La modulación oncogénica de Bmi1 se ha elucidado aún más en varios aspectos de la proliferación y el desarrollo de las células. Bmi1 se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en la regulación del ciclo celular, al actuar como un represor transcripcional del locus INK4a /ARF [4], [5]. La desregulación por Bmi1 a través de la inactivación estable de la p16INK4a-pRb y las vías p14ARF-MDM2-p53 está implicada en la oncogénesis del sistema hematopoyético [6], [7] y en el desarrollo de carcinoma de células pequeñas en el pulmón [8]. Bmi1 también tiene la capacidad de dirigirse a otros aspectos de la senescencia celular, como la sobreexpresión de Bmi1 se ha demostrado para inmortalizar los fibroblastos normales y las células epiteliales mamarias a través de la reactivación de la telomerasa humana revertir gen de la transcriptasa en estas células [9]. Además, la evidencia sugiere que robusto Bmi1 es crítica para el potencial invasivo y contribuye a la capacidad tumorigénico en el cáncer de colon [10], meduloblastoma [11], cáncer de laringe [12], cáncer de mama [13], y el cáncer de próstata [14]. Estudios recientes también implican Bmi1 como una proteína crucial para el mantenimiento y la auto-renovación de las células madre normales, incluyendo hematopoyéticas, neurales, mieloides y células madre escamosas [15], [16], [17], [18], así como el cáncer las células madre en varios tipos de tumores [14], [19], [20], [21]. Bmi1 se ha encontrado para sostener la renovación de células madre de cáncer en glioblastoma multiforme y para determinar la capacidad proliferativa de las células madre leucémicas [22], [23]. Por otra parte, la pérdida de Bmi1 se ha observado para prevenir la progresión de los tumores de pulmón en un modelo oncogénico K-ras-iniciados ratón de cáncer de pulmón a través de la inhibición de las células madre bronchiolalveolar [24].
Bmi1 ha sido recientemente implicada en varios aspectos de la biología de páncreas. Reglamento del locus INK4a por Bmi1 y mLL1 se ha implicado en el mantenimiento de la proliferación de las células β de páncreas y la capacidad de las células ß para recuperarse después de daño de los islotes pancreáticos [25]. Bmi1 expresar acinares y células de los islotes se han encontrado en el páncreas murino y Bmi1 juega un papel clave en la recuperación del compartimiento acinar después de pancreatitis inducida por ceruleína y la difteria ablación de células acinares mediado por toxinas en ratones [26], [27]. La sobreexpresión de Bmi1 se ha observado en las muestras de cáncer de páncreas humano en comparación con el páncreas normal [28], [29], [30]. Bmi1 se reguló en los tumores pancreáticos que surgen en el modelo de ratón Ela-TTA teto-Cre, KrasG12V ingeniería genética de cáncer de páncreas [28]. Similares observaciones fueron hechas durante la pancreatitis inducida cerulein [28]. La sobreexpresión de Bmi1 se ha correlacionado con un peor pronóstico en una pequeña cohorte de pacientes de cáncer de páncreas [29]. Si bien estos datos implican potencialmente Bmi1 en la tumorigénesis pancreática, tenemos un entendimiento muy limitado de los mecanismos subyacentes de la función Bmi1. En este estudio, se analiza el significado funcional de la expresión Bmi1 en el adenocarcinoma de páncreas usando modelos de xenoinjertos humanos primarios y líneas celulares de cáncer de páncreas. Nuestro trabajo revela que Bmi1 apoya el crecimiento del cáncer pancreático humano mediante la regulación de la progresión del ciclo celular y el mantenimiento del compartimento de células madre del cáncer de páncreas.
Resultados
Bmi1 es altamente expresado en las lesiones PanIN, los adenocarcinomas de páncreas, y en seleccionar líneas celulares de cáncer de páncreas
en primer tratado de determinar la expresión de Bmi1 en muestras de cánceres pancreáticos humanos primarios y los niveles de expresión en comparación con muestras de páncreas normal. Las secciones de tejido de 10 adenocarcinomas diferentes primarias humanas pancreáticas, 10 muestras de páncreas normales, y 16 lesiones preneoplásicas PanIN con distintos grados de displasia epitelial (PanIN 1 a PanIN3) se examinaron para la expresión Bmi1 después de la tinción inmunohistoquímica. Tras la evaluación microscópica, se encontró que las lesiones PanIN y secciones de adenocarcinoma pancreático humano mostraron una regulación al alza de la expresión de Bmi1 marcadas en comparación con los tejidos de páncreas normal (Figura 1A). Un número significativo de lesiones PanIN (con displasia moderada a grave) y adenocarcinoma de secciones teñidas para ambos (flechas en la figura 1A) vi panel de citoplásmicos y nucleares Bmi1. Curiosamente, la tinción Bmi1 se expresó predominantemente en el tejido glandular displásico de ambas muestras PanIN y adenocarcinoma, con mucho menos pronunciada tinción detectado en un subconjunto de células en el componente del estroma de las muestras neoplásicas. En total, se expresó en Bmi1 10/16 secciones lesión PanIN y en 8/10 adenocarcinomas de páncreas primarios. RT-PCR (datos no mostrados) y análisis de transferencia Western de los tejidos normales y cancerosas (Figura 1B) recapitulan los resultados observados en el análisis inmunohistoquímico. También se examinaron cinco líneas celulares de cáncer de páncreas, MiaPaca2, Panc-1, ASPC-1, BxPC-3 y Capan2 para la expresión de Bmi1 usando análisis de transferencia Western (Figura 1C). Los altos niveles de expresión Bmi1 se observaron en líneas celulares de cáncer de páncreas humano BxPC3, Panc-1, AsPC-1, y Capan2, mientras que la expresión fue baja en la línea celular de cáncer de páncreas MiaPaca2. Estos datos indican que la expresión Bmi1 es común en el tejido pancreático neoplásica y en líneas celulares de cáncer de páncreas. Los altos niveles de expresión Bmi1 visto en lesiones precursoras del cáncer de páncreas (PanINs) también sugieren que la expresión de Bmi1 se produce en una etapa temprana en la oncogénesis pancreático y, potencialmente, puede desempeñar un papel en la progresión del cáncer de páncreas.
A. La inmunohistoquímica para la expresión Bmi1 se realizó en muestras de tejido de páncreas con distintos grados de displasia que van desde normal (n = 10) a través de PanIN (n = 16) para adenocarcinoma invasivo del páncreas (n = 10). Como controles negativos, hemos sometido muestras de tejido para el procedimiento de tinción en ausencia de anticuerpo específico Bmi1 (1:100, la señalización celular). Las imágenes fueron capturadas a 10x, 40x, y 60x aumentos. Imágenes representativas muestran pocas células que expresan Bmi1in tejido pancreático normal (i, ii, iii), altos niveles de expresión en las lesiones PanIN (IV, V, VI), y la sobreexpresión significativa en el adenocarcinoma (vii, viii, ix). Se realizó análisis de transferencia de Western de la expresión B. Bmi1 en lisados normales de páncreas (n = 10) y de páncreas lisados de tejido de cáncer (n = 10) de diferentes pacientes. Bmi1 se sobreexpresa en lisados tumorales en comparación con los controles normales de tejido páncreas. beta actina se utilizó como control de carga. C. expresión endógena Bmi1 en líneas celulares de cáncer de páncreas se determinó por análisis de transferencia Western. β-actina sirvió como control de carga.
Bmi1 afecta a la proliferación de células de cáncer de páncreas in vitro
Dado el aumento del nivel de expresión de Bmi1 en el tejido epitelial neoplásico de páncreas y su ciclo celular conocida papel regulador, la próxima pregunta si su sobreexpresión juega un papel funcional en células de cáncer de páncreas. Elegimos las líneas Panc-1 y células MiPaCa2 para estos experimentos debido a sus niveles diferenciales de expresión Bmi1 (Figura 1C). Overexpressed Bmi1 en las células MiaPaca2 y silenciado Bmi1 en células Panc-1 con constructos de lentivirus. La sobreexpresión o desmontables de Bmi1 en estas líneas celulares se confirmó mediante análisis de transferencia Western (Figura 2A). La transfección de control de lentiviral-GFP vector solo no afectó a la expresión Bmi1 en cualquiera de las líneas de células (Figura 2A). El aumento de expresión de Bmi1 en células MiaPaca2 aumentó significativamente la proliferación celular en comparación con las células control MiaPaca2 (235 ± 11% vs. 333 ± 9% a las 72 horas, P & lt; 0,0001, n = 6 experimentos, la Figura 2B). Silenciamiento de la expresión Bmi1 en la línea celular Panc-1 inhibió la proliferación celular en comparación con el control de las células infectadas lentiviral shRNA, aunque los resultados no alcanzaron significación estadística (177 ± 12% vs 141 ± 16% en el día 4, p = 0,11, n = 6 experimentos, la Figura 2B). Estos datos muestran que el aumento de los niveles de expresión de Bmi1 en líneas celulares de cáncer de páncreas aumenta la proliferación celular.
A. expresión de la proteína Bmi1 se analizó después de la transfección de MiaPaca2 (arriba) y las células de cáncer de páncreas Panc-1 (parte inferior) con un vector lentiviral (Bmi1) que codifica Bmi1 o Bmi1 shRNA (shRNA Bmi1) como se ha descrito anteriormente [40]. Un vector lentiviral que expresa GFP (GFP) o el control shRNA se utilizó como control negativo. B.
in vitro
la proliferación celular en las células MiaPaca2 (izquierda) y células Panc-1 (derecha) siguientes modulación de la expresión Bmi1 se evaluó mediante el ensayo de MTS (Promega, Madison, WI). La replicación celular se registró como aumento calculado por ciento proliferación derivada de la captación de reactivo en el momento (t) menos la absorción de reactivo basal en el día 0. Los paneles inferiores muestran los cambios observados en la proliferación de las 72 horas después de la siembra. Los datos se expresan como la media ± SEM. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,0001, n = 6 experimentos independientes. histogramas representativos del ciclo celular C. siguientes análisis de citometría de flujo de yoduro de propidio (PI) se tiñeron las células Panc-1 muestran una reducción en el porcentaje de células que entran en la fase S de la inhibición de expresión Bmi1.
Los cambios en la expresión Bmi1 resultado alterado en la progresión a través del ciclo celular, pero no hay cambios en la tasa de apoptosis
los cambios observados en la proliferación celular después de los cambios de expresión Bmi1 podría ser el resultado de cambios en la progresión del ciclo celular con o sin un cambio en la tasa de apoptosis . Se utilizó el análisis de citometría de flujo con yoduro de propidio para estudiar la distribución de las líneas de Panc-1 y células MiaPaca2 con niveles alterados de Bmi-1 en las diferentes fases del ciclo celular para hacer frente a este punto. En las células MiaPaca2, inducción de la expresión Bmi1 mostró un aumento leve pero no significativo en el porcentaje de células que entran en la fase S (44,7 ± 1,7% a 50,7% ± 2,3%, p = 0,63, n = 3 experimentos, datos no mostrados ). El cambio de expresión Bmi1 condujo a un efecto más pronunciado en las células Panc-1, como la pérdida de Bmi1 en estas células causó una disminución significativa en el porcentaje de división activa células en fase S de 54,9 ± 2,5% a 42,0 ± 1,4% ( * P & lt; 0,05, n = 3 experimentos, Figura 2C). La alteración en la expresión de Bmi1 no provocó cambios significativos en la apoptosis, medido por el sub-G0 fracción /G1 y la tinción de TUNEL en ambas líneas celulares Panc-1 y MiaPaca2 (datos no mostrados).
Bmi1 mejora de páncreas cáncer de la invasión de células capacidad
Bmi1 sobreexpresión previamente se ha asociado con una peor pronóstico y un fenotipo más invasiva en otros tumores malignos. Nos preguntamos si la expresión Bmi1 tuvo tal efecto en las células de cáncer de páncreas utilizando el ensayo de Matrigel in vitro invasión. MiaPaca2 células con elevada expresión Bmi1 mostraron casi 2 veces mayor capacidad (149 ± 26 vs 363 ± 30, * p & lt; 0,0003) para la invasión en comparación con las células de control de vector de tipo salvaje (Figura 3 A, izquierda). El silenciamiento de Bmi1 en células Panc-1 resultó en una capacidad marcadamente reducida para que las células se someten a la invasión (61 ± 12 frente a 14 ± 4, p & lt; 0,004, Figura 3A, derecha). Estos datos sugieren que la expresión Bmi1 no sólo aumenta la proliferación, sino también de la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas. Dado que la expresión mejorada Bmi1 invasión celular, hemos probado la capacidad de Bmi1 para modular los reguladores de la transición epitelial mesenquimal (EMT), un proceso que está asociado con un fenotipo invasivo. Se halló una mayor expresión Bmi1 en las células MiaPaCa-2 se correlacionó con el aumento de la expresión de la vimentina marcadores de EMT y ZEB1, mientras que desmontables de Bmi1 en células Panc-1 conduce a regulación a la baja de estos marcadores y Caracol (Figura 3B), lo que demuestra una clara relación entre Bmi1 y la expresión de marcadores de EMT en células de cáncer de páncreas.
A. La sobreexpresión de Bmi1 en células MiaPaca2 mejora su invasividad in vitro ensayos de invasión en Matrigel (panel izquierdo). Por el contrario, Bmi1 regulación a la baja en las células Panc-1 conduce a la disminución de la invasión de células del tumor (panel derecho). Los datos se expresan como la media ± SEM. * P & lt; 0,0003, ** p & lt; 0,004, n = 6 experimentos independientes. B. La sobreexpresión de Bmi1 en las células MiaPaca2 conduce a la regulación positiva de la vimentina marcadores de EMT, y ZEB1, mientras que la regulación negativa de Bmi1 en células Panc-1 conduce a la reducción de expresión de marcadores de EMT. Los datos se expresan como la media ± SEM en comparación con las células control (* p & lt; 0,005). C. La supervivencia celular de GFP o Bmi1 transfectaron células MiaPaca2 (izquierda) tras el tratamiento con gemcitabina durante 48 horas. Los datos se registraron como factor de cambio por el control grupo no tratado y se expresan como la media ± SEM (* p & lt; 0,05 vs control). El análisis Q-RT-PCR de la expresión de GFP o MRP5 Bmi1 transfectaron células MiaPaca2 (derecha) después del tratamiento con gemcitabina. Se normalizaron los datos a GAPDH y se expresaron como la media ± SEM (* p & lt; 0,05 vs control).
Bmi1 mejora la resistencia a gemcitabina
El fenotipo EMT ha sido descrita para contribuir a la no Sólo invasión pancreática cáncer, sino también la resistencia al tratamiento en las células de cáncer de páncreas [31], [32]. Por lo tanto, la hipótesis de que el IMC-1 podría regular la resistencia frente a los agentes quimioterápicos en células de cáncer de páncreas. Para probar esta hipótesis, las células que expresan GFP MiaPaca2 solo o Bmi1 se dejaron sin tratar o se trataron con 100 gemcitabina mu M durante 48 horas y los ensayos se realizaron para evaluar la supervivencia celular. RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo para medir los cambios en la expresión de ABC MRP5 gen transportador. Miembros de la familia MRP son importantes en la mediación de la resistencia a fármacos, y MRP5 se ha demostrado que se expresa en niveles significativamente elevados en el cáncer de páncreas en comparación con el control de los tejidos pancreáticos, lo que sugiere que podría tener un papel en la resistencia a fármacos [33]. células MiaPaca2 con elevada expresión de Bmi1 habían aumentado la resistencia a la muerte celular en respuesta a la gemcitabina y el aumento de la expresión del gen de resistencia a MRP5 fármaco en comparación con las células control. Estos datos sugieren Bmi1 participa en la resistencia terapéutica en células de cáncer pancreático y que MRP5 puede contribuir a este fenotipo.
Bmi1 mejora la tumorigenicidad de células de cáncer de páncreas in vivo
Desde nuestros estudios in vitro sugieren que desempeña Bmi1 un papel regulador en la proliferación de células de cáncer de páncreas y la invasión, hemos querido abordar la importancia biológica de estos resultados en un modelo ortotópico in vivo de cáncer de páncreas. Para hacer frente a este punto, se inyecta líneas celulares transducidas lentivirales en las colas pancreáticos de ratones NOD /SCID receptor y midió el crecimiento del tumor resultante y el desarrollo de metástasis extrapancreáticas en estos ratones. Después de la inducción de la expresión Bmi1, células MiaPaca2 mostraron significativamente mayor
in vivo
el crecimiento del tumor. células MiaPaca2 inducida Bmi1 mostraron una mayor injerto, con la formación de tumores 100% (5/5) ortotópico mientras que sólo 3/5 ratones inyectados con células MiaPaca2 tipo salvaje mostraron injerto tumor pancreático (Tabla 1). Por otra parte, una tendencia a mayor tamaño del tumor se observó en los tumores formados por células que expresan Bmi1 en comparación con las células control MiaPaca2 (0,27 ± 0,17 vs. 0,98 ± cm3 0,41 cm3, p = NS, Figura 4A). Todos los ratones inyectados con células de control, ya sea Panc-1 (5/5) o Bmi1 silenciados células Panc 1-(5/5) mostró la formación de tumores en el páncreas, sin embargo Bmi1 silenciado células Panc-1 tumores formados que eran 2,5 veces más pequeños en promedio de tumores derivados de control de Bmi1 que expresan células Panc-1 (1,21 ± 0,23 vs. 0,42 ± cm3 0,09 cm
3, * P & lt; 0,05, Figura 4A, panel inferior). Además de mayor tamaño del tumor, exhibido mejoran las células que expresan Bmi1 potencial metastásico
in vivo
. Necropsias realizadas en animales de 28 días después de la inyección de las células que expresan Bmi1 MiaPaca2 revelaron metástasis tumoral bruta de los sitios extra-pancreática, incluyendo el peritoneo, hígado e intestino en (3/5 animales, la figura 4B), mientras que no hay depósitos metastásicos brutas (0 /5) observada en los ratones inyectados con células MiaPaca2 de tipo salvaje a los 28 días (Tabla 1). Estos datos corroboran nuestras observaciones in vitro y apoyan la noción de que Bmi1 coordina los programas de proliferación e invasoras en las células de cáncer de páncreas.
A. Imágenes representativas muestran demostrar relativa diferencia de tamaño del tumor a los 28 días después de la implantación del páncreas ortotópico MiaPaca2 (arriba) y células Panc-1 (parte inferior) en ratones NOD-SCID después de la modulación de la expresión Bmi1. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula para el volumen de una estructura de elipsoide (4/3 * π * ancho /2 * longitud /2 * Altura /2). Los datos se expresan como la media ± SEM (* p & lt; 0,05, n = 5 experimentos independientes). B. La imagen que se muestra es representativa del potencial metastásico mayor en las células MiaPaca2 siguiente expresión inducida de Bmi1. * Los sitios marcados muestran metástasis tumoral bruto de MIAPaCa2 a los sitios extrapancreáticas en NOD-SCID ratones 28 días después de la inyección ortotópico de células.
Bmi1 es altamente expresado en las células madre de cáncer de páncreas y controla su auto -Renovación
Nuestro laboratorio ha identificado previamente una población de subpoblación altamente tumorigénico de células que muestra las propiedades de auto-renovación y diferenciación en el cáncer de páncreas [34]. La hipótesis de que Bmi1 puede jugar un papel funcional en estas células madre del cáncer de páncreas (CSC), dada su implicación en otros sistemas de células madre. Nos dirigimos a xenoinjertos de cáncer de páncreas humano bajo primarias paso para abordar esta cuestión. Utilizando células activadas por fluorescencia (FACS), se aislaron las células madre cancerosas a través de la combinación de CD44, CD24, y la ESA (también conocido como EpCAM o molécula de adhesión celular epitelial) expresión en la superficie celular [34]. RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo para medir los niveles Bmi1 en las células madre cancerosas (marcadores de superficie celular CD44
+ CD24
+ ESA
+) y se compara con las células tumorales a granel restantes cosechadas a partir de los xenoinjertos de cáncer de páncreas humanas cultivadas en ratones NOD-SCID. extractos de páncreas normal sirven como un control adicional. En particular, células madre cancerosas pancreáticas tienen una expresión significativamente mayor de Bmi1 mRNA (aproximadamente 9 veces, * p & lt; 0,05) en comparación con las células normales y células tumorales a granel marcador negativo (hasta 3 veces, p & lt; 0,05, Figura 5A)
A. Se aislaron CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ células mediante citometría de flujo a partir de tejidos de cáncer de páncreas como se describe anteriormente [34]. Se aisló el ARN total y el ARNm se cuantificó por q- RT-PCR en páncreas normal, mayor CD44
- /CD24
- /ESA- células de cáncer de páncreas y CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ células del cáncer pancreático. Los datos se expresan como la media ± SEM (* p & lt; 0,05, n = 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado). B. Inmunofluorescencia tinción de Bmi1 en tumorspheres formado a partir de CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ células. C. El silenciamiento Bmi1 inhibe la capacidad de CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ células para formar esferas con pasos en serie. Los datos se expresan como la media ± SEM (* p & lt; 0,05, n = 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) guía empresas
Los CCC Ordenado también fueron probados
in vitro Hoteles en tumorsphere. Los ensayos para determinar si Bmi1 participa en la renovación CSC en pasos en serie. Expresión de Bmi1 en tumorspheres se evaluó a través de inmunofluorescencia microscopía (Figura 5B). Los altos niveles de expresión se observaron en Bmi1 tumorspheres enriquecidos para células madre de cáncer que correspondían a la elevación observada en los niveles de expresión de ARNm en Bmi1 RT-PCR. entonces transduced las tumorspheres con Bmi1 shRNA contengan o lentivirus control y pases seriados las esferas. formación de primer pasaje esfera no fue significativamente diferente entre Bmi1 silenciado células madre cancerosas y controles infectados lentiviral (34 ± 6 unidades /HPF frente a 30 ± 6 unidades /HPF, p = NS, Figura 5C). Sin embargo, al passaging subsiguiente, las células Bmi1 silenciados muestran capacidad de formar nuevas tumorspheres decreciente. En el paso tres, Bmi1 silenciado células mostraron una disminución de aproximadamente 7 veces en su capacidad para formar nuevos tumorspheres cuando se compara con controles de tipo salvaje (34 ± 7 unidades /HPF vs. 6 ± 1 unidades /HPF, p & lt; 0,05, Figura 5C) . Estos experimentos implican Bmi1 en la regulación de la renovación CSC de páncreas.
Bmi1 silenciamiento en células madre cancerosas resultados en los tumores más pequeños y la disminución de los CAC auto-renovación en vivo
Para probar la relevancia in vivo de los experimentos tumorsphere , se implantó un número igual de Bmi1 silenciados y lentiviral de control transfectadas CD44
+ CD24
+ ESA
+ células madre cancerosas derivadas de xenoinjertos de cáncer de páncreas humanos primarios en el subcutaneum de los ratones NOD /SCID y midieron el crecimiento del tumor resultante. BMI1 tumores silenciados fueron significativamente menores en comparación con los tumores de control cuando se analizaron 30 días después de la implantación (0,4 ± 0,2 cm
3 vs. 1,3 ± 0,2 cm
3, * p & lt; 0,05, Figura 6A). Cuando se analizaron los tumores por su contenido CSC a través de citometría de flujo, Bmi1 tumores silenciados mostraron una disminución significativa en el CD44
Población + CD24
+ ESA
+ CSC en comparación con sus homólogos de control (0,20 ± 0,04% vs. 1,2 ± 0,1%, * p = 0,0007, Figura 6B). Estos datos in vivo, junto con los resultados in vitro tumorsphere en, apoya el papel de Bmi1 en el mantenimiento del compartimento CSC pancreática mediante el control de su auto-renovación.
A. El silenciamiento de Bmi1 inhibe la proliferación tumoral. fotografía representativa (parte superior) de xenoinjertos tumorales muestra. Izquierda - tumoral de control, a la derecha - Bmi1 silenciada tumor. gráfico de barras que muestra la diferencia de volumen del tumor a los 28 días. Los datos se expresan como la media ± SEM (* p & lt; 0,05, n = 4 experimentos independientes). B. El silenciamiento de Bmi1 un impacto directo en el número de CSC en xenoinjertos tumorales. un resultado representativo citometría de parcelas (superior) de CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ el número de células en el control (izquierda) y Bmi1 silenciada (derecha) xenoinjertos a los 28 días. gráfico de barras (parte inferior) cuantifica el número de CSC en xenoinjertos a los 28 días siguientes silenciamiento de Bmi1. Los datos se expresan como la media ± SEM (* p = 0,0007, n = 4 experimentos independientes).
Discusión
El presente estudio proporciona evidencia clara de la participación integral de Bmi1 en la patogénesis del cáncer de páncreas. La sobreexpresión de Bmi1 se observó consistentemente en los tejidos de cáncer de páncreas en comparación con los controles normales. La mayoría de las líneas celulares de cáncer de páncreas humano también se observa que tienen una alta expresión endógena de Bmi1. Es importante destacar que se observó Bmi1 sobreexpresión en una mayoría (10/16) de las lesiones preneoplásicas PanIN con moderada a grados graves de displasia epitelial. Estos datos sugieren que la expresión Bmi1 se produce en una etapa relativamente temprana en la carcinogénesis pancreática y corrobora las observaciones en modelos de cáncer de páncreas humano y murino [28], [29], [30] previamente publicada. A pesar de estos resultados, un papel funcional para Bmi1 no se ha aclarado previamente en el cáncer de páncreas humano o murino.
funcionalmente Hemos validado la importancia de la expresión Bmi1 en el cáncer pancreático usando líneas celulares de cáncer de páncreas y xenoinjertos de tumores humanos primarios. Bmi1 sobreexpresión en células de cáncer de páncreas MiaPaca2 conducido a una mayor proliferación e invasión de Matrigel mejorada en ensayos in vitro. Por el contrario Bmi1 caída en células Panc-1 inhibe su proliferación. Estas observaciones se confirmaron adicionalmente por la implantación en los ratones NOD-SCID, donde Bmi1 sobreexpresión en células MiaPaca2 consecuencia un aumento de tamaño del tumor y la capacidad metastásica de las células. En contraste, aunque las células Panc-1 tenían injerto equivalente, independientemente del estado Bmi1, los tumores resultantes de las células Panc-1 que carecen de Bmi1 fueron significativamente más pequeños que los de las células Panc-1 de control. El aumento de expresión Bmi1 se ha asociado con el aumento de la agresión en otros tipos de cáncer [6], [10], [35], [36] y se correlaciona con la invasión tumoral y la metástasis en el cáncer de mama [10], [13]. Nuestros resultados en líneas celulares de cáncer de páncreas humano y xenoinjertos humanos primarios ampliar aún más estas observaciones e implicar Bmi1 en la inducción de la EMT y la resistencia a los medicamentos que regulan así el crecimiento del cáncer de páncreas y agresividad.
Las células tumorales iniciar o madre del cáncer han sido aislados en humanos cáncer de páncreas [34]. Al igual que en las células madre normales, Bmi1 se piensa que es un componente crítico de la maquinaria que mantiene la auto-renovación de células madre cancerosas. Esto fue demostrado ser el caso en el sistema hematopoyético, así como el de mama, cerebro, y de próstata [14], [17], [19], [20]. En nuestro estudio, cuando la expresión Bmi1 fue silenciada en el CD44
+ CD24
+ ESA
+ CSC población de páncreas, tanto
in vitro
CSC y la propagación in
in vivo
el crecimiento del tumor se inhibió de manera significativa. Además, se observó una marcada disminución en el número de células madre cancerosas cuando se analizaron los tumores Bmi1 silenciados por su contenido CSC. Estos datos, por primera vez experimentalmente implican Bmi1 como un importante regulador de páncreas mantenimiento CSC y la iniciación del tumor de páncreas. El estudio adicional está en curso sobre el papel de Bmi1 en el complejo transcripcional programas reguladores que controlan la renovación y el mantenimiento del estado de células madre. Bmi1 ha sido implicado en la renovación de células madre y la proliferación en muchos normal, así como tejidos cancerosos, incluyendo el sistema hematopoyético, el sistema nervioso, la mama, la próstata, los pulmones, el intestino y el páncreas normal. Una observación crítica, cuando uno revisa la mayoría de estos estudios, es que la función Bmi1 principalmente se ha implicado en estos sistemas de órganos utilizando modelos de ratones genéticamente modificados. Hay una escasez de datos que examina la función Bmi1 en los tejidos humanos directamente. Nuestro estudio implica Bmi1 como regulador directo de la tumorigénesis pancreática usando xenoinjertos de paso bajo primarias humanas derivadas del paciente y líneas de células pancreáticas. Es un complemento de los resultados de los otros estudios, y aún más el papel de los cementos Bmi1 como un regulador clave de la renovación de las células madre de cáncer, lo que impacta directamente en la iniciación del tumor y el crecimiento in vivo. Es el primer estudio para implicar Bmi1 directamente en la tumorigénesis pancreática. Es difícil extrapolar cómo la expresión Bmi1 en las células madre de cáncer de páncreas se refiere a la homeostasis normal de páncreas como el único papel abordar función Bmi1 y no sólo la expresión en el páncreas adulto se centra en un modelo murino y no páncreas humano [27]. Es notable que en ese documento Bmi1 no se expresó en las células que expresan los marcadores progenitoras pancreáticas normalmente aceptados, tales como PDX-1, nestina, y Sox9, sino que era presente en lo que parecía ser células acinares completamente diferenciadas. Por lo tanto, es difícil especular sobre el papel de Bmi1 en la homeostasis normal del páncreas en el ser humano, pero nuestro trabajo implica claramente Bmi1 en la tumorigénesis pancreática humana.
Los mecanismos moleculares subyacentes de la función Bmi1 en el cáncer no se entienden completamente. Bmi1 regula la progresión del ciclo celular, al menos en parte por la regulación transcripcional del locus Ink4a, que contiene el p16Ink4a y p14ARF (p16 y p19 en ratones) inhibidores de quinasa dependientes de ciclina [4], [5]. El locus Ink4a se interrumpe en muchos cánceres pancreáticos y mutaciones en o silenciamiento de la expresión /p14 p16 está implicado como un acontecimiento clave en la progresión del cáncer de páncreas [37]. Estudios recientes han demostrado que la expresión aberrante Bmi1 no necesariamente puede estar asociada con la regulación negativa de la expresión p16INK4A [38], [39], [40]. Cada muestra se analizó por triplicado.