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PLOS ONE: Caracterización de Metabolómica Humanos del cáncer de próstata metástasis ósea revela aumento de los niveles de colesterol

2013/8/31


Extracto

Antecedentes

La metástasis al hueso es uno características clínicamente importantes de cáncer de próstata (CaP). los métodos de diagnóstico actuales no pueden predecir metastásico CaP en una etapa curable de la enfermedad. Identificación de las vías metabólicas implicadas en el crecimiento de las metástasis óseas, por tanto, tiene el potencial de mejorar el pronóstico del CP, así como terapia.

Metodología /Principales conclusiones

La metabolómica se aplicó para el estudio de las metástasis óseas CaP (n = 20) en comparación con el correspondiente hueso normal (n = 14), y además de maligno (n = 13) y benignos (n = 17) muestras de tejido de próstata y de plasma correspondientes obtenidos de pacientes con (n = 15) y sin (n = 13) con diagnóstico de metástasis y de los hombres con enfermedad benigna de la próstata (n = 30). Esto se hizo utilizando la espectrometría de masa de cromatografía de gas para la caracterización de la muestra, y la bioinformática quimiométricas para el análisis de datos. Los resultados fueron verificados en un conjunto de pruebas independiente con tejido óseo metastásico y normal de pacientes con otros tipos de cáncer (n = 7). No se encontraron diferencias significativas entre las metástasis óseas CaP, las metástasis óseas de otros tipos de cáncer, y el hueso normal. Por otra parte, hemos identificado metabolitos en tejido tumoral primario y en el plasma que se asociaron significativamente con la enfermedad metastásica. Entre los metabolitos en las metástasis óseas CaP se observó especialmente colesterol. En una prueba de ajustar el nivel de colesterol medio en metástasis óseas CaP fue 127,30 mg /g, en comparación con 81,06 y 35,85 mg /g en las metástasis óseas de origen diferente y el hueso normal, respectivamente (P = 0,0002 y 0,001). La tinción inmunohistoquímica de las metástasis óseas CaP mostraron una intensa tinción del receptor de lipoproteínas de baja densidad y los niveles variables de la receptor scavenger clase B tipo 1 y reductasa 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima en las células epiteliales tumorales, indicando posibilidades de afluencia y

de novo síntesis de colesterol.

metabolitos Conclusiones /Importancia

Hemos identificado asociados a la metástasis del CP y los altos niveles de colesterol específicamente identificados en las metástasis óseas CaP. En base a los resultados y la literatura previa, esto hace que el colesterol una posible diana terapéutica para el CaP avanzado

Visto:. Thysell E, Surowiec I, hornberg E, S Crnalic, Widmark A, Johansson AI, et al. (2010) Caracterización de Metabolómica Humanos del cáncer de próstata metástasis óseas Revela aumento de los niveles de colesterol. PLoS ONE 5 (12): e14175. doi: 10.1371 /journal.pone.0014175

Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América

Recibido: 14 Junio, 2010; Aceptado: 4 de noviembre de 2010; Publicado: Diciembre 3, 2010

Derechos de Autor © 2010 Thysell et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación: Conceder una ayuda : la Sociedad de cáncer de Suecia, el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación de Investigación del cáncer leones, KEMPE fundación, Knut y Alice Wallenberg Foundation, y la Fundación del cáncer norte de Suecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

cáncer de próstata agresivo (CaP), con el tiempo se extienda a los huesos, es una enfermedad común y mortal que requiere un diagnóstico temprano y un tratamiento eficaz. Los métodos diagnósticos actuales; medir los niveles de antígeno prostático específico (PSA) en muestras de sangre y el examen de las biopsias con aguja de la próstata bajo el microscopio de luz, sin embargo, no son particularmente eficaces en la separación de los casos de agresividad de PCA de las formas cada vez más frecuente e indolentes de CaP que a menudo se pueden dejar sin tratamiento, o en la separación de cáncer de otros trastornos de la próstata no malignos [1], [2]. Usando una variedad de técnicas de múltiples investigadores, por tanto, han tratado de encontrar nuevos métodos de diagnóstico y marcadores de pronóstico que pueden separar agresiva de las formas más indolentes de CaP (revisado en [3]).

Mucho esfuerzo se ha puesto en el reconocimiento de perfiles genéticos y proteómicos para CaP (revisado en [4]), y espectroscopía de resonancia magnética se han utilizado para explotar los cambios metabólicos asociados con CaP [5], [6], [7]. Zakian y colleauges proporcionan una buena revisión sobre el tema [8]. En un artículo reciente, sin embargo, Sreekumar y sus colegas utilizaron líquidos y cromatografía de gases - tiempo de espectrometría de masas de vuelo (GC /TOFMS) al perfil del metaboloma en el tejido, orina y plasma de pacientes con CaP y alteraciones identificadas asociadas con la progresión de la enfermedad [9] . En concreto, identificaron sarcosina, el
N
derivado de metil glicina, como un marcador potencialmente importante para la invasión CaP celular, la migración, y la agresividad. El estudio Sreekumar junto con otros estudios recientes [10], [11], [12], [13] verdaderamente indican que los métodos basados ​​en espectrometría de masas podrían ser utilizados para caracterizar los cambios metabolómicos durante la progresión del cáncer y además para identificar posibles biomarcadores de diagnóstico y pronóstico o patrones de biomarcadores, así como aumentar nuestro conocimiento sobre la progresión de la enfermedad.

Este estudio se realizó con la hipótesis de que los posibles nuevos marcadores para CaP agresivo podrían ser descubiertos mediante la búsqueda de factores notablemente hasta reguladas en las metástasis óseas y luego examinar si el mismos factores también están aumentados en las muestras de sangre y en los tumores primarios de pacientes con enfermedad metastásica. Para ello hemos realizado un estudio de las metástasis óseas metabolómica CaP en comparación con el correspondiente hueso normal, tumor primario CaP y el tejido normal de la próstata, utilizando tejido metastásico recogido en la cirugía para las complicaciones de las metástasis óseas [14]. Además, se analizaron muestras de sangre de pacientes con y sin metástasis óseas diagnosticados, con el objetivo de identificar los metabolitos que podrían utilizarse para mejorar el pronóstico y la terapia de CaP avanzado. Los resultados fueron verificados en un ensayo separado fijado también incluye tejido óseo metastásico de otros tipos de cáncer. Esto se hizo utilizando la espectrometría de masa de cromatografía de gases para la caracterización de la muestra y la bioinformática quimiométricas para el análisis y la evaluación [15] de datos.

Resultados

metástasis óseas del cáncer de próstata muestran claras diferencias metabólicas al hueso normal y a metástasis óseas de otros tipos de cáncer, incluido el aumento de los niveles de colesterol

cromatografía de gases-espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC /TOFMS) se utilizó para caracterizar las metástasis óseas de PCA de 14 pacientes (7 pacientes con CaP hormono-ingenuos y 7 pacientes con CRPC) y piezas de hueso normalmente aparecen adyacentes que estaban disponibles a partir de 10 de los pacientes (Tabla 1). En total, 123 picos cromatográficos correspondientes a los metabolitos putativos fueron encontrados por deconvolución [16] después de la exclusión de los picos procedentes de las normas internas, la contaminación y los artefactos. De los metabolitos 123 putativos, 49 podrían asignar una identidad mediante sus espectros de masas y de índice de retención correspondiente (figura 1). Ortogonales mínimos cuadrados parciales análisis discriminante (OPLS-DA) reveló una separación evidente y estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,001) entre las muestras de huesos y metástasis ósea normales, independientemente del tratamiento, determinados por ANOVA de la cruzada modelo validado (Figura 2b). Las diferencias significativas entre los grupos de la muestra (VIP & gt; 0,9, importancia variable en el modelo OPLS-DA o
P Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney U-test) se encontraron el 58,5% (71 de 123) de los metabolitos putativos (Figura 2a, el cuadro S1). De los 71 metabolitos que discriminan significativamente, 34 se podrían asignar una identidad por sus espectros de masas y el índice de retención correspondiente, mientras que 37 fueron asignados solamente a una posible clase de compuesto o permanecieron sin identificar. Para validar la firma metabolómica detectado en el tejido óseo metastásico y para investigar si existe un patrón único para CaP metabolito, un conjunto de muestras adicionales se perfila en una carrera independiente. Esta "prueba de conjunto 'incluyó muestras de metástasis ósea de la próstata (6), mama (3), riñón (2) y de células escamosas (2) adenocarcinomas, así como muestras de huesos normales de los pacientes correspondientes preparados, perfilado y predijo como una cohorte de validación independiente (Tabla 1). Predicción de las metástasis óseas CaP y las correspondientes muestras de huesos normales (ciegos al modelo) en el modelo OPLS-DA revelaron una clara discriminación entre las clases de prueba en el conjunto de prueba (Figura 2c). Además, un modelo OPLS-DA separada dio una diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,001) entre las metástasis óseas CaP y las correspondientes muestras de huesos normales en la prueba y los metabolitos que separan significativamente los grupos de la muestra (Tabla S2 ) se superponen en buena medida con los metabolitos detectados significativos en el modelo de serie (Tabla S1). Por otra parte, OPLS-DA expone un (LT P &; 0,005) evidente y significativa separación entre las metástasis óseas CaP y las metástasis de los otros tipos de cáncer (Figura S1)

Los metabolitos identificados se clasifican de acuerdo a la clase química y el número. de metabolitos por clase asociada significativamente con la metástasis está indicado (
P Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney u-test, o VIP & gt; 0,9). Clasificación de los metabolitos de acuerdo a la clase química (metaboloma humano DB; www.hmdb.ca). n = número de metabolitos identificados dentro de cada clase metabolito

A) cargas de correlación (p [1]) a partir del análisis OPLS-DA de los metabolitos que diferencian significativamente (
P
. & lt; 0,05, Mann-Whitney u-test, o VIP & gt; 0,9) entre las metástasis óseas de cáncer de próstata y el hueso normal que muestran valores positivos para los metabolitos con un aumento de los niveles en las metástasis óseas y valores negativos para los metabolitos con disminución de los niveles de las metástasis óseas. Clasificación de los compuestos no identificados de acuerdo con la clase química (metaboloma humano DB; www.hmdb.ca) B) OPLS-DA gráfica de las puntuaciones que muestra la separación estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,001) entre el hueso normal y el cáncer de próstata metástasis óseas. predicciones C) prueba de conjunto de las metástasis óseas del cáncer de próstata y las correspondientes muestras de huesos normales (ciegos al modelo) en el modelo OPLS-DA que muestran una clara discriminación entre las clases de muestra, en base a la firma metabolómica detectado.


Entre los metabolitos detectados en las metástasis óseas PCA (Figura 2a y el cuadro S1) Se encontraron niveles de varios aminoácidos aumentado en comparación con el hueso normal, lo que indica el metabolismo del ácido amino alta. En consecuencia, los 12 mejores vías canónicas en las metástasis óseas CaP sugeridas por la vía de análisis de sistemas (Ingenuity Systems, Inc.) estaban relacionados con la síntesis de ácidos amino y el metabolismo (Tabla S3). metabolismo de los aminoácidos fue también la función de arriba enumerados por vía de análisis Ingenuity para las metástasis óseas PCA (Tabla S4). Además, se detectaron altos niveles de colesterol, mio-inositol-1-fosfato, ácido cítrico, fumarato, glicerol-3-fosfato, y los ácidos grasos (Tabla S1), que están relacionados con funciones moleculares y celulares dentro de las metástasis óseas CaP como se indica en la Tabla S4.

Hemos observado específicamente los altos niveles de colesterol en las metástasis óseas CaP como colesterol mostró el valor más alto VIP cuando diferenciar metástasis óseas de PCA de tejido óseo normal (Tabla S1, Figura 2a), así como de otra metástasis óseas (Tabla S5). Por otra parte, el colesterol se ha sugerido para promover el desarrollo y progresión del cáncer (revisado en [17]), y por lo tanto se eligió para el análisis adicional. El alto nivel de colesterol en las metástasis óseas CaP en comparación con el hueso normal (
P
= 3.12E-5, la figura 3a) se comprobó claramente en los datos del conjunto de prueba (
P = 0,001
, la figura 3b). Curiosamente, los niveles de colesterol en las metástasis óseas CaP eran altos también en comparación con los niveles en metástasis óseas de otros tipos de cáncer (p = 0,0002, Figura 3b).

A. Diagrama de cajas para la concentración de colesterol (mg de colesterol /g de tejido) que muestran niveles significativamente más altos en las metástasis del cáncer de próstata (CaP) ósea en comparación con el hueso normal. parcela B. Box para la concentración de colesterol (colesterol mg /g de tejido) en el conjunto de ensayo que muestra niveles significativamente más altos en las metástasis óseas de CaP en comparación con el hueso normal, así como en comparación con metástasis óseas de otros tipos de cáncer; mama, riñón, y cáncer epidermoide (BCA, KCa y SCA). C-E. La tinción inmunohistoquímica de los receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL-R), el receptor scavenger clase B tipo 1 (SR-B1), y la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HMG-CoA rojo.) en el hueso CaP metástasis muestran una tinción intensa y que indican posibilidades de afluencia así como
de novo
síntesis de colesterol en las células epiteliales tumorales, como se sugiere en FF afluencia colesterol y síntesis es estimulada por el receptor de andrógenos (AR) de acción en parte a través de la activación de la esterol regulador elemento vinculante proteína (SREBP) y la posterior transcripción de LDL-R y de la HMG-CoA roja [24], [25] y los andrógenos podrían proporcionarse a partir del colesterol por su conversión en varios pasos [27], [28].

metástasis óseas del cáncer de próstata tienen la maquinaria para la captación y

de novo síntesis del colesterol

el colesterol constituye una diana terapéutica potencial y, por tanto, hemos querido examinar las posibles razones para los altos niveles de colesterol en las metástasis óseas de PCA. Las células pueden obtener por el colesterol exógeno afluencia a través del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL-R), el tipo de receptor scavenger clase B 1 (SR-B1) o por
de novo
síntesis a partir de acetil-CoA, donde la reducción de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima a (HMG-CoA) en mevalonato se considera que es la tasa de limitación de paso [18], [19]. Por lo tanto, las piezas en parafina procedentes de las metástasis CaP incluidas en el análisis GC /TOFMS Inmunomarcamos de LDL-R, SR-reductasa B1 y HMG-CoA reductasa. Todos los casos de CaP mostraron una fuerte tinción homogénea LDL-R de las células epiteliales metastáticos y de vez en cuando menos intensa tinción de las células adyacentes del estroma, células endoteliales, adipocitos, y células de hueso (Figura 3C, Tabla 2). La tinción epitelial de la reductasa de SR-B1 y HMG-CoA era más heterogénea, que van de débil a intensa (Tabla 2). Curiosamente, la HMG-CoA reductasa mostró particularmente intensa tinción en las células endoteliales, las paredes de los vasos, células inmunes y células óseas (Figura 3E), mientras que SR-B1 mostró tinción negativa estroma (Figura 3d). Nuestros resultados muestran que las células epiteliales tumorales en CaP metástasis óseas posiblemente sintetizan colesterol
de novo
a través de la HMG-CoA reductasa, pero también que otros tipos de células en la médula metástasis microambiente expresan esta enzima, posiblemente, lo que les permite proporcionar el colesterol que podrían ser absorbidos por las células epiteliales tumorales a través de la LDL y receptores SRB-1 (Figura 3F). No hubo relación obvia entre la heterogeneidad en la inmunotinción SR-B1 y HMG-CoA y los niveles de colesterol correspondientes en las metástasis óseas CaP (datos no mostrados). Curiosamente, sin embargo, las metástasis óseas CaP mostraron inmunotinción generalmente más fuerte de LDL-R y SR-B1 de las metástasis óseas de origen diferente (Tabla 2), contribuyendo posiblemente a los niveles de colesterol relativamente más altos observados en las metástasis PCA (Fig. 3) .

Las diferencias metabólicas entre tejidos tumorales primarios de próstata de pacientes de alto riesgo con y sin metástasis óseas establecidos

tejido primario CaP obtenido de pacientes con tumores de alto riesgo (definido como localmente avanzado o pobremente diferenciado cáncer; etapa T3-4 y /o GS 8-10) con (M1, n = 7) o sin (M0, n = 6) metástasis óseas diagnosticados fueron perfilados en comparación con las muestras benignas de la próstata (n = 17, Tabla 3). Esto dio lugar a 157 picos de metabolitos putativos de los cuales 59 se podría asignar una identidad (Figura 1). discriminación clara y estadísticamente significativa (P & lt; 0,001), determinado por ANOVA del modelo de validación cruzada, entre todas las clases de tejido de tres próstata (benigno, M0, M1 y) fue revelada por el modelado OPLS-DA (Figura S2). se detectaron durante 13 metabolitos de los cuales se identificaron ocho (Tablas S6 y S7) Cambios significativos asociados con la enfermedad metastásica, que se define como los cambios de metabolitos en M1 vs. benigna y M1 vs. M0 (0,9 P & lt;; 0,05 o VIP & gt). Curiosamente, cuatro de ellas también se incrementaron significativamente en las muestras de metástasis óseas en comparación con el hueso normal; asparagina, treonina, ácido fumárico y ácido linoleico (Tabla S1).

perfiles de metabolitos distintivas en el plasma sanguíneo de los pacientes con tumores de alto riesgo con y sin metástasis óseas establecidos

Investigación de metaboloma plasma de pacientes con CaP (M1, n = 15) y sin (M0, n = 13) metástasis óseas diagnosticadas y adultos con enfermedad benigna se basó en 179 metabolitos putativos resueltos, y de los que 50 se podrían asignar una identidad (Figura 1). A pesar de la superposición evidente en los niveles de PSA en suero (Tabla 3), una separación significativa (P & lt; 0,003) utilizando el modelado OPLS-DA se obtuvo de la diferencia entre M1 y plasma benigna, así como entre M1 y plasma M0, determinada por ANOVA de la cruzar modelos validados. Veintisiete metabolitos, siete identificado, se encontró que modifican, de manera significativa (P & lt; 0,05 o VIP & gt; 0,9) en el plasma sanguíneo de pacientes M1 en comparación con los pacientes con benigna (Tabla S8) y la enfermedad M0 (Tabla S9). Curiosamente, de estos 27, cuatro metabolitos; ácido glutámico, taurina, y fenilalanina (elevado en la sangre) y ácido esteárico (disminución en la sangre) se encontraron también como marcadores de metástasis en los huesos (Tabla S1). Un resumen de todos los metabolitos identificados en los diferentes tipos de muestras se dan en la Tabla S10 y los datos se pueden encontrar en un archivo de datos de soporte (datos S1).

niveles de sarcosina en muestras de tejido y plasma

los niveles de sarcosina se midieron por separado en las muestras usando AccQ • derivatización Tag seguido por análisis LC /MS. El análisis mostró un aumento de la sarcosina en metástasis óseas CaP en comparación con el hueso normal, mientras que se pudo observar ninguna diferencia en comparación con metástasis óseas de otros tipos de cáncer (Figura S3). Además, no progresión de la enfermedad clara se observa al comparar los niveles de sarcosina entre benigna de próstata y tejido tumoral de próstata primario, aunque el número bajo (n = 5) de los extractos tumorales primarios disponibles para este análisis no afectar a la fiabilidad de los resultados, y también hecho una comparación entre el tumor primario y en los tejidos de metástasis de hueso no fiables. Las comparaciones de los niveles de sarcosina en el plasma sanguíneo no revelaron diferencias significativas relacionadas con el CP o la presencia de metástasis óseas (datos no mostrados).

Discusión

aquí, por primera vez, un informe análisis exhaustivo de los patrones metabólicos en las metástasis óseas CaP en comparación con CaP primario, tejido benigno de la próstata y el tejido óseo normal. Hemos encontrado metabolitos que diferencian las metástasis óseas de PCA de muestras de huesos normales y, además, de las metástasis óseas de origen diferente. También encontramos metabolitos que, en contraste con PSA, mostraron niveles de plasma y del tumor primario alterados en individuos con CaP metastásico en comparación con pacientes con tumores de alto riesgo, pero sin metástasis detectables. Uno de los hallazgos más notables es altos niveles de colesterol en las metástasis óseas ACC, que probablemente se accede por

de novo síntesis de colesterol en las células epiteliales tumorales, así como afluencia de este metabolito de los alrededores a través de LDL R y SR-B1.

El aumento de la biodisponibilidad de colesterol en las células tumorales puede tener gran importancia biológica para el crecimiento de las metástasis óseas, como la administración de suplementos de colesterol se ha demostrado que aumenta la proliferación de células tumorales CaP, la migración y la invasión
In
vitro [20], mientras que la orientación de colesterol induce la apoptosis [21], probablemente al reducir el contenido de colesterol y lípidos balsa por ello interfiere con el factor de crecimiento de señalización [21], [22]. La glándula de la próstata normalmente contiene altos niveles de colesterol en comparación con otros órganos y aumento de los niveles de colesterol han sido previamente asociado con CaP [23]. Además elevación de los niveles de colesterol en las metástasis óseas podría reflejar obviamente una gran demanda para la biosíntesis de la membrana en células en proliferación, sino también el hecho de que el metabolismo del colesterol está directamente regulada por los andrógenos (revisado en [24]). Los andrógenos regulan positivamente LDL-R transcripción de genes y para promover la síntesis de colesterol mediante el aumento de la transcripción de la HMG-CoA reductasa [25] y por lo tanto la conversión limitante de la velocidad de la HMG-CoA a mevalonato [26]. Como los receptores de andrógenos se expresan y presumingly activo en la mayoría de las metástasis óseas en CRPC [14], las acciones de andrógenos probablemente contribuyen a los niveles más altos de colesterol en las metástasis CaP en comparación con metástasis óseas de origen diferente. El colesterol puede a su vez contribuye a la señalización del receptor de andrógenos y por lo tanto el crecimiento del tumor resistente a la castración en pacientes tratados con terapia de privación de andrógenos, por su conversión en andrógenos por las enzimas metabólicas [27], [28]. De acuerdo con ello, una dieta y alta de suero occidentales niveles de colesterol se han asociado con un mayor riesgo de CaP en una serie de estudios [29], [30], [31], aunque los resultados no han sido completamente concluyente (revisado en [17]) . Curiosamente, un estudio reciente demuestra un riesgo menor de desarrollar de alto grado CaP para los hombres con bajos niveles de colesterol en suero [32] y, de acuerdo con este, el uso a largo plazo de la HMG-CoA reductasa ( "estatinas") para la prevención de enfermedad cardiovascular se ha demostrado para reducir el riesgo de progresión de la PCa en la enfermedad agresiva, fatal [33], [34], [35], [36]. agentes reductores de colesterol también se han demostrado para inhibir el crecimiento de células de CaP
in vitro Opiniones y en el modelo de sistemas experimentales
in vivo
[37], [38]. Tomados en conjunto, estos resultados indican la posibilidad de utilizar inhibidores de colesterol como de tratamiento o quimiopreventivos agentes para CaP metástasis, pero nuevos fármacos son entonces necesarios como las estatinas utilizadas hoy en día se concentran principalmente en el hígado y mal llegan a los órganos periféricos [17].

Hemos encontrado altos niveles de muchos aminoácidos dentro de las metástasis óseas de CaP, y el metabolismo de aminoácidos fue la vía funcional más alterado asociado a las metástasis óseas CaP según la vía de análisis Ingenuity. Nuestros resultados apoyan el estudio basado en la metabolómica por Sreekumar y compañeros de trabajo [9] y también los estudios anteriores de genes basados ​​en la expresión, que muestran una mayor síntesis de proteínas durante la progresión del CaP [39]. Curiosamente, un reciente trabajo de alto iluminado que también los niveles de aminoacil ARNt (aaRSs) se incrementan durante la progresión del CaP y, por otra parte, que la transcripción de algunos aaRSs es estimulado por los andrógenos [40]. Este notable descubrimiento podría posiblemente ser conectado al hecho de que hemos encontrado niveles de ciertos aminoácidos como la treonina, glutamato, fenilalanina dentro de las metástasis óseas CaP aumentado en comparación con metástasis óseas de origen diferente. Además de los aminoácidos, otros metabolitos notables en nuestros datos (ácido cítrico, fumarato, glicerol-3-fosfato, y ácidos grasos) indican un metabolismo de alta energía que podría reflejar la alta fracción de la proliferación de células dentro de las metástasis óseas [14]. Por otra parte, los altos niveles de myo-inositol-1-fosfato podría ser una señal de señalización celular activa participación de moléculas basadas en inositol como segundos mensajeros, tales como fosfatos de inositol y fosfatos fosfatidilinositol. Esas moléculas están implicadas en la activación de la proteína quinasa C y Akt y por lo tanto en procesos considerados como características del cáncer, es decir, la proliferación celular, apoptosis, diferenciación, invasión y la angiogénesis [41] regulación. En general, las alteraciones en el metaboloma detectado en este estudio como asociado a las metástasis óseas CaP indican funciones moleculares y celulares alterados de clara relevancia para la progresión del cáncer. La importancia relativa de estas funciones son sin embargo difíciles de asignar, ya que en parte dependen de las clases de metabolitos detectables en el análisis de GC /TOFMS y las identidades obtenidas dentro de las bibliotecas disponibles en la actualidad. Con el método de perfiles metabolito /GC TOFMS que no fueron capaces de detectar sarcosina en las muestras. Sin embargo, usando un enfoque de análisis objetivo, hemos encontrado altos niveles de sarcosina en la metástasis ósea de acuerdo con los hallazgos previos de aumento de los niveles de sarcosina con progresión de CaP [9]. Es importante destacar, sin embargo, no vimos ninguna diferencia en los niveles de sarcosina entre las metástasis óseas CaP y metástasis óseas de origen diferente, lo que indica que no es sarcosina CaP específica pero en vez asociado con el cáncer avanzado y metástasis. Una visión más completa de las redes biológicas específicas de importancia para CaP metástasis se obtendrá el crecimiento como los métodos de análisis se desarrollan y bibliotecas para obtener la identificación más completa, sino que también podría lograrse mediante la combinación de datos metabolómicos con los datos genómicos o proteómicos. Hasta ahora, hemos específicamente en cuenta que la treonina, asparagina, ácido fumárico, y ácido linoleico se aumentado no sólo en las metástasis óseas, sino también en tejido de próstata primario de pacientes con metástasis óseas confirmados en comparación con los pacientes M0. ácidos grasos esenciales como el ácido linoleico se han mostrado para estimular el crecimiento CaP tumor en sistemas modelo [42], [43], y la conversión de ácido linoleico en ácido araquidónico y más en prostaglandinas podría estimular una respuesta inflamatoria que se asocia con la patogénesis del CP [44].

ni el colesterol ni sarcosina eran, sin embargo, el pronóstico para las metástasis óseas en el plasma. En su lugar se encontraron altos niveles de ácido glutámico, fenilalanina, y taurina en CaP tejido metástasis ósea y en el plasma de los hombres con metástasis óseas CaP diagnosticados. El ácido glutámico se demostró recientemente en el estudio de Sreekumar y colegas que se incremente en el tejido CaP [9] y, curiosamente, las células cancerosas que causan la alteración ósea en modelos animales segregan glutamato en su entorno [45]. Como la comunicación intercelular glutamatérgica es importante para la homeostasis normal del hueso a través de los receptores de glutamato en las células óseas específicas (revisado en [46]), es posible que las perturbaciones dentro de este sistema podrían ser detectados durante el proceso de la metástasis ósea. Nuestros resultados también están de acuerdo con un estudio reciente encontró que los niveles de taurina más altos en CaP que en el tejido benigno cuando se evaluó a través de ángulo mágico girando ((1) H HR-MAS), espectroscopia de RMN [47]. El valor de estos metabolitos como marcadores plasmáticos para CaP agresivo sin embargo deben ser confirmadas en estudios posteriores.

En conclusión, hemos identificado metabolitos asociados a la metástasis del cáncer de próstata y en concreto observado altos niveles de colesterol en las metástasis óseas CaP. En base a los resultados y la literatura previa, esto hace que el colesterol una posible diana terapéutica para el CaP avanzado. Aunque este es el mayor estudio de las metástasis óseas metabolómica CaP realizado sin duda, tiene sus limitaciones. Estudios previos
1H NMR han revelado cambios evidentes en los niveles de citrato y colina entre benigna de la próstata y el tejido tumoral [5], [6], [7], pero un poco preocupante, no hemos podido encontrar tales diferencias en los niveles de citrato. Tampoco pudimos con nuestro método de detección de colina. Estos resultados ponen de relieve las limitaciones de nuestro método y señalan la necesidad de enfoques complementarios en la búsqueda de biomarcadores metabolómicos útiles. Por otra parte, el lugar bajo número de pacientes incluidos y la heterogeneidad de la enfermedad metastásica hacer de la evaluación en estudios adicionales necesarias antes de la significación de los resultados podría ser asegurada.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

los estudios fueron aprobados por el comité de revisión ética local de la Universidad de Umeå y los participantes dieron su consentimiento escrito o verbal.

muestras

las metástasis óseas y piezas de tejido óseo normalmente aparecen adyacentes se obtuvieron a partir de una serie de biopsias-helado en fresco recogidas de pacientes con diagnóstico de cáncer o sospecha de cáncer, operado para la compresión de la médula espinal metastásico o fracturas patológicas (Tabla 1). Los pacientes se han descrito a fondo en [14].

El plasma sanguíneo estaba disponible a partir de una serie de hombres que se sometieron a biopsias con aguja guiada por ecografía transrectal de la próstata, debido al aumento de los niveles séricos de PSA, y CaP primario y benigna de la próstata biopsias fueron evaluables en algunos casos (Tabla 3). Los pacientes incluidos en este estudio fueron seleccionados a tener tumores de alto riesgo se define como; presencia de metástasis óseas o un tumor localmente avanzado o un cáncer poco diferenciado (M1 y /o T3-4 y /o GS 8-10), mientras que los hombres con enfermedad benigna tenían al menos dos rondas de biopsias negativas. Los casos de CaP y los casos benignos fueron agrupados de acuerdo al tiempo ya que el muestreo. Información adicional acerca de los pacientes y preparación de la muestra se da en el texto de apoyo (Texto S1).

perfiles de Metabolómica mediante GC /TOFMS

Antes del análisis GC /TOFMS los metabolitos de bajo peso molecular en muestras de plasma fueron extraído y derivado como se describe anteriormente [48]. Las muestras de tejido se extrajeron con H
2O /metanol /cloroformo (01:03:01) mezcla que contiene 11 patrones internos A [48] (1 ml por 15 mg de tejido) distribuidos de manera uniforme sobre la duración de la retención cromatográfica. La extracción se lleva a cabo en molino de perlas con dos perlas de tungsteno y el resto del procedimiento fue el mismo que para las muestras de plasma. extractos de muestras derivatizadas fueron inyectadas en el modo sin división por un inyector automático CTC PAL Combi (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza) en un cromatógrafo de gases Agilent 6890 equipado con una 10 m × 0,18 mm de diámetro interno columna capilar de sílice fundida con un aglutinante químico 0,18 micras DB fase estacionaria MS-5 (J & amp; W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.). El efluente de la columna se introdujo en la fuente de iones de un espectrómetro de masas Pegasus III de tiempo de vuelo, GC /TOFMS (Leco Corp., San José, MI, EE.UU.). Una serie alcano (C10-C40) se ha ejecutado para cada ejecución GC /TOFMS separada. Más detalles con respecto a la preparación de muestras, la derivación y GC /TOFMS análisis se pueden encontrar en la información complementaria. La reproducibilidad del método se ha informado anteriormente [16], [48].

Procesamiento de datos

Los datos pre-tratamiento, incluida la corrección de línea base, la alineación cromatograma, configuración de tiempo de ventana, de curvas multivariante jerárquica resolución (H-MCR) [11] y la normalización se realizaron en MATLAB [versión 7.3] usando scripts personalizados. Más detalles sobre el procesamiento de datos se pueden encontrar en la información de apoyo (Texto S1)
análisis
Datos y estadísticas

ortogonal mínimos cuadrados parciales -. Análisis discriminante (OPLS-DA) [49] fue aplicado para extraer e interpretar la variación sistemática en los /TOFMS tejido y plasma perfiles de GC resueltos relacionados con respuestas específicas. El objetivo era extraer patrones metabólicos relacionados con la PCa y más específicamente a la enfermedad metastásica.

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