Extracto
Aplicaciones
La expresión de desmogleínas (DSGS), que se sabe que son cruciales para establecer y mantener la adhesión célula-célula requerida para la integridad de los tejidos, ha sido bien caracterizado la epidermis y del folículo piloso; sin embargo, su expresión en otros tejidos epiteliales tales como la próstata es poco conocido. Aunque regulación a la baja de cadherinas clásicas, tales como E-cadherina, que se ha descrito en muestras de tejido de cáncer de próstata, la expresión de desmogleínas sólo se ha informado anteriormente en líneas celulares de cáncer de próstata. En este estudio hemos caracterizado antidesmogleína expresión en tejidos normales de la próstata, y se investigaron más a fondo si Desmogleína 2 (DSG2) la expresión específica puede servir como un potencial factor pronóstico clínico para los pacientes diagnosticados con cáncer de próstata primario.
Experimental diseño em
Hemos utilizado la inmunofluorescencia para examinar la expresión DSG2 en la próstata normal (
n
= 50) y en una cohorte clínicamente bien caracterizado de pacientes con cáncer de próstata (
n
= 414). Se analizó la correlación de expresión DSG2 con características clínico-patológicas y la recurrencia bioquímica para evaluar su importancia clínica.
Resultados
Estos estudios revelaron que DSG2 y DSG4 se expresaron específicamente en las células luminales prostáticos, mientras basal células carecen de su expresión. Por el contrario, Dsg1 y DSG3 no se expresaron en el epitelio de la próstata normal. Más análisis de la expresión DSG2 en cáncer de próstata revelaron que los niveles reducidos de este biomarcador eran un marcador independiente significativa de los pobres resultados clínicos.
Conclusión
Aquí mostramos por primera vez que una baja expresión DSG2 fenotipo es un biomarcador pronóstico útil de la agresividad del tumor y puede servir como una ayuda en la identificación de pacientes con cáncer de próstata clínicamente significativa
Visto:. peluquero AG, Castillo-Martin M, DM Bonal, Rybicki- BA, Christiano AM, Cordon -Cardo C (2014) Caracterización de desmogleína expresión en la glándula prostática normal. Antidesmogleína 2 es un factor pronóstico independiente para el cáncer de próstata agresivo. PLoS ONE 9 (6): e98786. doi: 10.1371 /journal.pone.0098786
Editor: Craig N. Robson, Instituto del Norte para la Investigación del Cáncer, Reino Unido
Recibido: 17 Febrero, 2014; Aceptado: May 7, 2014; Publicado: 4 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Barber et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud subvenciones P01-CA087497 (CCC y MCM) y R01-ES11126 (BAR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los desmosomas son un tipo de unión de anclaje célula-célula que se encuentra en los tejidos que sufren un alto grado de tensión mecánica, y la pérdida de adherencia de los desmosomas se asocia con las enfermedades que afectan a la piel, el pelo, y el corazón [1] - [ ,,,0],13]. En el desmosome, la familia de las cadherinas de proteínas está representado por las denominadas cadherinas "no clásicos", que incluyen desmogleínas (DSG 1-4) y desmocollins (DSC 1-3) [14]. Desmogleínas y desmocollins juegan un doble papel en la formación de desmosomas. En el espacio extracelular, desmogleínas y desmocollins sobre las células opuestos interactúan de una manera dependiente de calcio a través de sus dominios heterophilic cadherina repetición. Intracelularmente, las cadherinas se unen con plakoglobina y placofilina, que a su vez se unen a desmoplakina. Desmoplaquina se une a los filamentos intermedios, asegurando de este modo toda la estructura al citoesqueleto [15], [16]. Aunque claramente importante en el mantenimiento de la integridad de los tejidos adultos, el papel de las cadherinas desmosómicas en la progresión del cáncer es menos conocido. La pérdida de heterocigosidad cerca de la región cromosómica que contiene el grupo de genes de cadherina desmosomal se ha informado en el cáncer de esófago, así como de cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas [17], [18]. Las alteraciones en la expresión de desmogleínas se ha informado de una variedad de cánceres. La reducción de expresión de DSG2 se ha informado en carcinomas gástricas y pancreáticas [19] - [21]. Por el contrario, la sobreexpresión de DSG2 y DSG3 se ha informado en los carcinomas de células escamosas de la piel, así como cáncer de cabeza y cuello, respectivamente [22], [23].
La expresión de cadherinas desmosómicas se ha caracterizado a fondo en la epidermis, folículos capilares y tejido aracnoideo. Mientras que la expresión de DSG2 se sabe que es ubicua en todos los tejidos de formación de desmosome-, la expresión de las cadherinas desmosómicas restantes fuera de la epidermis y del folículo piloso es poco conocido [24]. Un estudio realizado por Whittock y Bower en 2003 utilizó RT-PCR para analizar la expresión de
DSG4
en un panel de tejidos y encontraron que
DSG4
podía detectarse en varios tejidos, incluyendo la próstata, lo que sugiere que el perfil de expresión antidesmogleína de la próstata puede extenderse más allá de la expresión ubicua de DSG2 [25]. La regulación a la baja o pérdida de proteínas de adhesión célula-célula - como la cadherina clásica, E-cadherina - es una característica común de una variedad de cánceres, incluyendo el cáncer de próstata, y pueden ser causadas por una variedad de diferentes mecanismos [26], [ ,,,0],27]. Por el contrario, aunque la expresión aberrante de desmogleínas se ha informado en varios tipos de cáncer, la expresión de estas cadherinas en el cáncer de próstata se ha solamente ha informado en las líneas celulares hasta la fecha [28] - [30]. En este estudio caracterizamos por primera vez la expresión de desmogleínas en muestras normales de tejido de próstata humano y determinar el tipo específico de célula en la que próstata desmogleínas específicos se expresan. A continuación, analizar la expresión de DSG2 en una cohorte de pacientes de cáncer de próstata bien caracterizado, y examinar la asociación entre la expresión DSG2 y el resultado clínico de los pacientes. Nuestros resultados revelan que DSG2 y DSG4 se expresan específicamente en las células luminales de la próstata humana normal, mientras que Dsg1 y DSG3 no se expresan en el epitelio de la próstata. Además, se encontró que la expresión reducida de DSG2 que se asociaron independientemente con una recidiva bioquímica más corto, poniendo de relieve la utilidad potencial de expresión DSG2 como un biomarcador pronóstico de la agresividad del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Ética declaración
diapositivas humanos normales congeladas de tejido prostático que corresponden a zona de transición prostática con diagnóstico histológico de las áreas de las glándulas normales de pacientes que se sometieron a una prostatectomía radical se obtuvieron de forma anónima desde el Servicio de Banco de Tumores de Columbia, de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de Columbia Protocolo Universidad#AAAB2447. El TMA utilizada en este estudio fueron construidos en el laboratorio Cordon-Cardo, y se genera a partir de 414 casos de prostatectomía radical, originalmente recogidos entre septiembre de 2000 y enero de 2005 en el Sistema de Salud Henry Ford en Detroit, siguiendo el protocolo aprobado de una Junta de Revisión Institucional#1018 [31]. Cada participante completó una breve entrevista telefónica (demografía y la historia de la salud), un cuestionario de frecuencia de alimentos, y una entrevista cara a cara sobre las exposiciones relacionadas con el trabajo. Además, todos los participantes proporcionaron una muestra de sangre para los análisis genéticos y de la prueba de PSA. La inscripción se cerró en la primavera de 2005, y el IRB permanece abierto para seguimiento de PSA (sin contacto con el paciente) para los sujetos de estudio.
Cultivo de células y Aislamiento de ARN
El epiteliales de próstata benigna BPH- la línea 1 de células (un generoso regalo del Dr. Ralph Buttyan, y disponible en el mercado a través de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares; DSMZ, Braunschweig, Alemania) fue cultivada en RPMI con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CALIFORNIA). Tres líneas celulares de cáncer de próstata metastásico humanos se utilizaron en este estudio: DU145, PC3 y LNCaP. La línea celular DU145 (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en MEM con FBS al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA). La línea celular PC3 (ATCC, Manassas, VA) se cultivó en F12K con 10% de SFB (Invitrogen, Carlsbad, CA). La línea celular LNCaP (ATCC, Manassas, VA) se cultivó en RPMI con 10% de SFB (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para aislar el ARN, las células se lavaron en 1X PBS, se tripsinizaron, y se sedimentaron mediante centrifugación. Las células se cultivaron cuatro días confluencia pasado antes del aislamiento de ARN como se ha informado anteriormente de que su perfil completo expresión desmogleína se alcanza en este punto de tiempo [32]. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1X PBS y después se sedimentaron por centrifugación a lavar. Esta etapa de lavado se repitió dos veces para eliminar todo rastro de los medios de comunicación antes de la recolección de ARN. El RNA se cosechó utilizando el RNeasy Mini Kit y QIAshredder siguiendo el protocolo del fabricante titulado "La purificación del ARN total de células animales Utilizando la tecnología Spin" (Qiagen, Valencia, CA).
Los anticuerpos
Anti -DSG3 (clon 5H10) y Dsg1 (clon 27B2) anticuerpos monoclonales de ratón se han descrito anteriormente y se les dio a nosotros como un generoso regalo del Dr. James Wahl; tanto se utilizaron a una dilución de 1:10 [33]. Anti-DSG2 anticuerpo monoclonal de ratón (clon 10G11) se adquirió de ARP, Inc (Belmont, MA) y se usó en una dilución de 1:50 para el análisis de inmunofluorescencia de líneas de tejidos de próstata y de células normales; anti-Dsg1 /anticuerpo monoclonal 2 de ratón (clon DG3.10) se adquirió de Fitzgerald (Acton, MA) y se usó a una dilución de 1:20 para las TMA. anticuerpo policlonal anti-cobaya DSG4 se generó por el Dr. Lutz Langbein y dado a nosotros como un regalo generoso, este anticuerpo se utilizó a una dilución de 1:2000. Anti-citoqueratina anticuerpo 14 (CK14) policlonal de conejo se adquirió de Covance (Princeton, NJ) y se usó a una dilución de 1:1000. anticuerpo monoclonal de ratón anti-PSA fue adquirido de Dako (Carpinteria, CA) y se usó a una dilución de 1:20. anticuerpo monoclonal de conejo anti-PSA fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA) y se usó a una dilución de 1:200. Los anti-citoqueratinas 8/18 (CK8 /18) anticuerpo policlonal de cobaya se adquirió de Progen (Heidelberg, Alemania) y se usó a una dilución 1:100. Alexa Fluor 594 o Alexa Fluor 488 secundaria de anticuerpos se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se utilizaron a una dilución de 1:600.
RT-PCR
ARN total de la piel normal humana y la próstata normal (tanto de origen de un único donante) se adquirió comercialmente (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). cDNA de la primera cadena se realizó utilizando oligo dT y el sistema de síntesis de la primera cadena Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. PCR se realizó con Platinum PCR Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los cebadores para la transcripción de interés (que se resumen en la Tabla S1). El siguiente protocolo de PCR se utilizó: paso 1: 94 ° C durante 3 min; paso 2: 94 ° C durante 30 seg, 56 ° C durante 45 seg, 72 ° C durante 2 min; paso 3: 72 ° C durante 10 min; repita el paso 2 para 34 ciclos. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa /TBE 1X 1% que contiene bromuro de etidio y se visualizaron usando Kodak Electroforesis Documentación Sistema de análisis y 120 de la cámara (Kodak, Rochester, NY).
QRT-PCR
ARN se recogió a partir de líneas celulares de interés como se describe. cDNA de la primera cadena se realizó utilizando oligo dT y el sistema de síntesis de la primera cadena Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se realizó en una máquina de Stratagene Mx3005P y se analizó usando software Stratagene MxPro QPCR (Stratagene, Santa Clara, CA). Todas las reacciones se realizaron utilizando QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), 200 nM primers (que se resumen en la Tabla S1), y 10 ng de ADNc en un volumen de reacción de 20 l. La siguiente reacción de PCR se utilizó: paso 1: 95 ° C durante 10 min; paso 2: 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 1 min; repita el paso 2 durante 40 ciclos. Todas las muestras se realizaron por cuadruplicado, y las muestras se normalizaron en contra de un control interno, β-actina endógena.
inmunofluorescencia-congelados tejidos y líneas celulares
congelados diapositivas de tejido de próstata humana normales correspondientes a la transición prostática zona con diagnóstico histológico de las áreas de las glándulas normales de los pacientes se utilizaron para caracterizar los anticuerpos para detectar la expresión desmogleína. Las líneas celulares se cultivaron en cubreobjetos de vidrio (Fisher, Pittsburgh, PA) en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (BD Falcon, Bedford, MA). Diapositivas /cubreobjetos se fijaron en metanol frío 100% durante 15 min a -20 ° C seguido de fijación acetona fría 100% durante 2 min a -20 ° C. Slides /cubreobjetos se lavaron en 1X solución salina tamponada con fosfato (PBS) con agitación, se permeabilizaron con 1% de Triton-X100 en 1X PBS a temperatura ambiente durante 5 min, y se lavó de nuevo en PBS 1X con agitación. Slides /cubreobjetos se incubaron en 0,1% Triton X-100/1% de albúmina de suero bovino (BSA) /PBS 1X bloque a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de incubación de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente diapositivas /cubreobjetos se lavaron en 1X PBS con agitación, a continuación, una dilución 1:600 de anticuerpo secundario, ya sea, se añadieron Alexa Fluor 594 o Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y diapositivas /cubreobjetos se incubaron a temperatura ambiente por 45 min. a continuación, diapositivas /cubreobjetos fueron lavados en 1X PBS con agitación, se sumergieron brevemente en agua y se montaron utilizando medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
El análisis de inmunofluorescencia de microarrays de tejidos (TMA) Secciones
TMA se construyeron de la siguiente manera: hematoxilina & amp; Eosina secciones teñidas de especímenes (FFPE) de prostatectomía fijado en formol e incluidos en parafina fueron revisados para identificar las áreas viables, morfológicamente representativas de las glándulas prostáticas normales y adenocarcinoma acinar de la que se podrían tomar muestras de la base de la aguja. De cada muestra, por triplicado núcleos de tejido adyacentes con diámetros de 0,6 mm fueron perforados y dispuestos en un bloque de parafina receptor usando un instrumento de precisión (Beecher Instruments, MD). Todos los golpes se obtuvieron a partir de un foco con la más alta puntuación de Gleason, y la mayoría de los golpes fueron tomadas desde el nódulo tumoral dominante - definen como el más grande de nódulos con la más alta puntuación de Gleason y el estadio en un espécimen de prostatectomía específicos. Los datos de seguimiento para todos los casos relativos a la evidencia de recurrencia biológica estaba disponible para este estudio. secciones de cinco micrómetros consecutivos de estos bloques TMA se utilizaron para el análisis de inmunofluorescencia, y la primera sección se tiñeron con hematoxilina & amp; Eosina para servir como una plantilla para la morfología. Los portaobjetos se desparafinaron y rehidratada, y la recuperación de antígeno se llevó a cabo por las diapositivas de calefacción en un vapor en tampón de citrato, pH 6,0 durante 15 minutos. a continuación, los portaobjetos se lavaron una vez en PBS 1X. Los portaobjetos se incubaron en Triton X-100/1% BSA /suero de bloqueo 1X PBS 0,1% a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de incubación de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. El día siguiente, los portaobjetos se lavaron en 1X PBS con agitación, a continuación, una dilución 1:600 de anticuerpo secundario, ya sea, se añadió Alexa Fluor 594 o Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se incubaron los portaobjetos a temperatura ambiente durante 45 min . a continuación, se lavaron los portaobjetos tres veces en 1X PBS + 0,1% de Triton X con agitación, se lavó tres veces en 1X PBS, brevemente sumergido en el agua y montado utilizando medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se utilizó CK8 /18 expresión para identificar todas las áreas epiteliales (tanto tumorales y las glándulas normales) en los núcleos y la expresión de las proteínas de interés llegó por medio de la determinación del porcentaje de células tumorales con inmunorreactividad por núcleo de tejido (de 0% a 100% ), sin tener en cuenta la intensidad de la señal. La evaluación fue realizada por un uropathologist (MCM) siguiendo la metodología utilizada anteriormente: las zonas tumorales en el núcleo se identificaron por primera vez por DAPI, confirmada por la presencia de CK8 /18 y luego anotó mediante el establecimiento de un porcentaje de células tumorales con expresión en la membrana de DSG2 [ ,,,0],34] .Los valores medios de los núcleos representativas de cada muestra de paciente se utilizaron para los análisis estadísticos. Un corte positivo del 60% se utilizó para realizar análisis estadísticos de correlación con las características clínico-patológicas y la supervivencia, ya que era el valor de la mediana de expresión aproximada observada para DSG2 en esta cohorte de cáncer de próstata, como se informó anteriormente en la literatura [35].
cáncer de próstata cohorte y clínico-patológicas características
En este estudio se analizaron una cohorte de 414 pacientes con diagnóstico de cáncer de próstata primario. características clínico-patológicas de estos pacientes se resumen en la Tabla 1. La edad media al diagnóstico fue de 61 años (rango: 41-74.7 años). La mayoría de los pacientes eran de raza blanca (56%) o (43%) afroamericana. El seguimiento medio fue de 56,8 meses (rango: 1.4-123.6 meses). Sólo 98 (24%) de los pacientes mostraron una recaída bioquímica, definida como teniendo dos aumento de los niveles de PSA detectables consecutivos (& gt; 0,2 ng /ml) cuatro semanas o más después de la cirugía. curvas de supervivencia libre de recurrencia bioquímica correspondientes a conocidos factores de riesgo clínico-patológicas tales como PSA pre-quirúrgica, el estadio patológico, la puntuación de Gleason, angiolinfática invasión perineural y la invasión, se muestran en la Figura S1.
Análisis Estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS v18.0 (IBM, Armonk, Nueva York). Se utilizó la prueba t de Student para comparar la expresión de la proteína de interés en el cáncer de próstata primario y el tejido normal de la próstata. Rango de correlación de Spearman se utilizó para analizar la correlación entre las proteínas de interés y las características clínico-patológicas. la supervivencia libre de recidiva bioquímica fue analizada mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y las curvas se compararon mediante la prueba de log-rank. El análisis multivariado incluyendo la expresión DSG2 y los parámetros clínico-patológicos se realizó a través de Cox de riesgos proporcionales. Un
P-valor
≤0.05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
desmogleínas se expresan específicamente en las células luminales de la próstata humana normal
A medida que el expresión de desmogleínas en la glándula de la próstata no se ha caracterizado hasta la fecha, comenzamos este estudio examinando el perfil completo expresión antidesmogleína en el tejido prostático humano normal, utilizando RT-PCR y análisis de inmunofluorescencia. análisis de RT-PCR mostró que la mayoría de desmogleínas podría ser detectado fácilmente en la próstata humana normal a nivel del ARN, con la excepción de
Dsg1
que mostró sólo la expresión de ARNm débil (Figura 1A). El análisis de inmunofluorescencia reveló que sólo la expresión de DSG2 y DSG4 podría ser fácilmente y consistentemente detectada en el epitelio de la próstata a nivel de proteínas (figura 1B-C), mientras que Dsg1 y DSG3 no eran demostrables en el epitelio de la próstata normal (Figura S2).
(a) Claro expresión de ARNm se puede detectar en la mayoría de desmogleínas, con la excepción de
Dsg1
que muestra expresión sólo leve. análisis (B-C) inmunofluorescencia Representante de DSG2 (B) y DSG4 (C) en la frontera de células del epitelio glandular prostático humano normal. Aumento original: 200X. Las barras de escala corresponden a 100 micras.
Después de haber establecido la expresión de desmogleínas en la próstata humana normal, nuestro propósito es determinar la expresión específica de tipo celular y DSG2 DSG4. El tejido glandular de la próstata se compone de conductos y acini que están alineados por un epitelio cúbico simple dirigida a la luz de las glándulas. Además de este componente secretor, otras dos células especializadas son una parte integral de las estructuras glandulares de la próstata, es decir, las células basales y de las células neuroendocrinas [36], [37]. luminal las células secretan, entre otras moléculas, antígeno prostático específico (PSA) y representan la unidad funcional principal del órgano. Estas células forman una capa continua que se encuentra en la parte superior de las células basales. Las células basales se caracterizan por la expresión de citoqueratinas de alto peso molecular (CKs) - tales como CK14 - y p63. Dispersa a través de los acinos es la tercera población de células, las células neuroendocrinas, el origen y la función de los cuales en la próstata normal, aún no están bien definidas.
Co-inmunofluorescencia se realizó un análisis para examinar la localización de DSG2 y DSG4 con marcador CK14 basal de células específicas, así como la proteína luminal específico, PSA. análisis Co-inmunofluorescencia de DSG2 y CK14 muestra que DSG2 se expresa fuertemente en las células luminales de la próstata y que esta expresión rara vez co-localiza con el de la expresión de CK14 basal (Figura 2A-C). Análisis de DSG2 y PSA expresión reveló co-localización de ambos biomarcadores en las células luminales (Figura 2D-F). La expresión de DSG4 era muy similar a la de DSG2, que muestra una fuerte expresión en las células luminales, rara vez se co-localización con la expresión de CK14 basal (Figura 2G-I) pero co-localización con la expresión luminal PSA (Figura 2J-L). Además, la expresión de DSG2 mostró casi completa co-localización con la de DSG4, con la mayoría de las células luminales que muestra un nivel aún de expresión tanto para desmogleínas y algunas células que muestran un nivel de expresión ligeramente superior para uno con respecto al otro (Figura 2M- O). Tomados en conjunto estos resultados ilustran que la expresión de DSG2 y DSG4 se limita principalmente a las células luminales de las glándulas epiteliales de próstata humanos.
(A-C) DSG2 se expresa en las células luminales de las glándulas prostáticas y este expresión rara vez co-localiza con células basales CK14 expresión. (D-F) DSG2 co-localiza con la expresión de PSA en el compartimento luminal de la glándula. (G-I) DSG4 también se expresa en las células luminales y rara vez co-localiza con células basales CK14 expresión. (J-L) expresión DSG4 co-localiza con la expresión de PSA celular luminal. (M-O) La expresión de DSG4 también muestra casi completa co-localización con la de DSG2 en las células luminales. Aumento original: 200X. Las barras de escala corresponden a 100 micras.
DSG2 se expresa en líneas celulares de cáncer de próstata humano
Tras caracterizar la expresión de desmogleínas en tejido prostático humano normal, hemos querido centrarse en DSG2 de el resto del estudio, ya que es el más ampliamente expresada desmogleína isoforma - que muestra la expresión ubicua en todos los tejidos que forman desmosome. Siguiendo nuestro descubrimiento anterior de que DSG2 se expresa en el epitelio normal de la próstata humana, luego preguntamos si esta proteína se expresa también en líneas celulares de cáncer de próstata humano. Para examinar esta cuestión, QRT-PCR se realizó en ARN extraído de tres líneas disponibles comercialmente y bien caracterizados metastásico de células humanas de cáncer de próstata (Figura 3A). Las líneas celulares de cáncer utilizados para esta parte del estudio incluyen la línea celular LNCaP, que se deriva de un cáncer de próstata que metástasis en el ganglio linfático; la línea celular PC3, que se deriva de un cáncer de próstata que metástasis en el hueso; y la línea celular DU145, que se deriva de un cáncer de próstata que metástasis en el cerebro [38] - [40]. La línea celular HPB-1 sirvió como control para este estudio, ya que es una línea inmortalizada, no tumorigénicos prostática epitelial celular derivada de un paciente con hiperplasia benigna de próstata, una condición no relacionada con la transformación maligna de próstata [41]. Los resultados de este análisis QRT-PCR mostraron que
DSG2
se expresa en diferentes niveles en todas las líneas celulares examinadas. Curiosamente, la expresión de
DSG2
es mayor en todas las líneas celulares de cáncer de próstata metastásico examinó de lo que es en el no tumorigénicos control de BPH-1
.
(A) expresión DSG2 se detecta en todas las líneas celulares examinadas, incluyendo la HBP-1 línea celular inmortalizada de próstata normal. Los datos se representan como media ± DE. ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001. (B-E) DSG2 se expresa en la frontera celular de las células LNCaP y DU145; sin embargo, la expresión borde de la celda no se detecta en células PC3 con sólo algunas células que muestran débil, punteada, y tinción difusa (ampliación de inserción; se muestra a 2,5 veces). Aumento original: 200X. Las barras de escala corresponden a 100 micras.
A continuación, se utilizó el análisis de inmunofluorescencia para examinar la expresión de DSG2 en estas líneas celulares de cáncer de próstata humanos metastásicos en el nivel de proteínas (Figura 3B-E). Se detectó la expresión del borde de la celda, DSG2 en células LNCaP y DU145 HPB-1. Sin embargo, las células PC3 carecían de la expresión de DSG2 en el borde de la celda, mientras que una pequeña población de células mostró sólo una tinción granular difusa para DSG2 en el citoplasma (ver ampliación de inserción en la Figura 3D). Estos resultados son consistentes con y perfeccionan los resultados de un estudio anterior de Lang
et al.
En el que se utilizó un anticuerpo específico para tanto Dsg1 y DSG2 para examinar la expresión antidesmogleína en LNCaP, PC3 y DU145 células [ ,,,0],29], [42]. Los resultados de la qRT-PCR y análisis de inmunofluorescencia muestran que la expresión de
DSG2
está presente en todas las líneas celulares de cáncer de próstata y que, en dos de las líneas celulares de cáncer de próstata examinados tres, DSG2 se localiza en el borde de la celda lo que sugiere que la formación de los desmosomas es retenido en líneas celulares de cáncer de próstata más metastásicos examinado
in vitro
.
a baja DSG2 fenotipo se asocia con la progresión tumoral en pacientes con primaria Carcinoma de próstata
como se mencionó anteriormente, mientras que la pérdida de expresión de cadherina clásica se ha descrito en el cáncer de próstata, a la fecha, la expresión de cadherinas desmosómicas en muestras de tejido de carcinoma de próstata no ha sido reportado. Para evaluar el porcentaje de células positivas para la expresión DSG2 en el carcinoma de próstata en comparación con el tejido normal de la próstata, se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia de la expresión DSG2 en carcinoma de próstata TMA (
n
= 414), así como la próstata normal TMA (
n
= 50). Además de un anticuerpo para la proteína de interés, un anticuerpo para CK8 /18 - citoqueratinas se encuentran tanto en la próstata normal luminal las células epiteliales y células de adenocarcinoma -. También se incluyó en cada TMA como medio de identificación de las células epiteliales en cada muestra
Una disminución significativa en el porcentaje de células positivas para la expresión DSG2 fue encontrado en carcinomas de próstata en comparación con la próstata normal (Tabla 2 y la Figura S3). epitelio de próstata normal se caracteriza por un alto porcentaje de células positivas para la expresión DSG2 (media de expresión de 81,1%, la mediana de 84,5%), mientras que las muestras de tumor de próstata mostraron un porcentaje significativamente menor de células DSG2 positivas (media de expresión de 57,5%, la mediana de 66,7%;
P = 0,0002
). Se utilizó un valor de corte de expresión de células positivas DSG2 60%, ya que éste era el valor de la mediana de expresión aproximada observada para DSG2 en la cohorte de cáncer de próstata, y la mediana se ha utilizado anteriormente y ampliamente para realizar los análisis de supervivencia [35]. El uso de este valor de corte, se observó que el 96% de las muestras de tejido normal de próstata se considera positiva para DSG2, en comparación con sólo el 46% de las muestras de carcinoma de próstata estudiadas. En particular, la cantidad de células que fueron positivas para la expresión borde de la celda de DSG2 era generalmente más alta en áreas bien diferenciadas del tumor, mientras que la cantidad de células que muestran esta expresión era a menudo mucho más baja en las zonas mal diferenciadas del tumor (Figura 4A-L ), un hallazgo que fue validado por más de correlación de Spearman (Tabla 3).
(a-L) el análisis de inmunofluorescencia Representante de DSG2 y CK8 /18 en el cáncer de próstata. (D, E-H) TMA que muestra la expresión de alto DSG2 en el borde de la celda de zonas bien diferenciadas del tumor (Panel D, dentro de la línea amarilla discontinua). (D, I-L) TMA que muestra la expresión de bajo DSG2 en áreas pobremente diferenciado del tumor (panel D, se muestra en el resto del tumor fuera de la línea discontinua de color amarillo). Aumento original: 200X. Las barras de escala corresponden a 100 micras. (M) Los pacientes que expresan niveles más altos de DSG2 tuvieron una supervivencia significativamente más larga libre de recurrencia que aquellos que expresan niveles más bajos de DSG2 (
P
= 0,01).
la correlación entre la expresión de DSG2 y las características clínico-patológicas más comúnmente asociada con un fenotipo agresivo cáncer de próstata, incluyendo la concentración sérica de PSA prequirúrgico, la puntuación de Gleason, y luego patológica etapa se examinó el uso de correlación de Spearman (Tabla 3). Curiosamente, no hubo una correlación negativa significativa entre la expresión DSG2 y la concentración de PSA pre-quirúrgica, así como la puntuación de Gleason. Estos resultados revelaron que un fenotipo de baja a negativa expresión DSG2 se asoció con niveles de concentración de PSA prequirúrgico aumento en suero, así como con altas puntuaciones de Gleason.
disminución de la expresión DSG2 es un factor independiente asociado con una pobre resultado clínico en pacientes con tumor primario carcinoma de próstata
Después de haber examinado la correlación entre el fenotipo DSG2 y factores de riesgo clínico-patológicas del carcinoma de próstata, el próximo fin de determinar si la expresión DSG2 está asociado con la supervivencia libre de recidiva bioquímica. Curiosamente, los pacientes cuyos tumores expresado ≥ 60% DSG2 tenía una supervivencia recurrencia más libre que los que expresan & lt; 60%, y la diferencia entre estos dos grupos fue estadísticamente significativa (Figura 4 M,
P
= 0,01). Se observó en los pacientes con CH 60% fenotipo expresión DSG2, mientras que aquellos con ≥60% fenotipo expresión DSG2 no alcanzó el tiempo medio de bioquímica: Una mediana del tiempo hasta la recurrencia bioquímica de 103,7 meses (87.7-119.8 meses IC del 95% intervalo) recurrencia después de un tiempo de seguimiento de 123,6 meses. Más importante aún, cuando se realizó un análisis multivariante, se observó que la expresión DSG2 fue un factor independiente de recidiva bioquímica (HR = 1,579,
P = 0,050
), así como las características clásicas clínico-patológicas: la puntuación de Gleason y Patológica de la etapa (Tabla 4). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que la expresión DSG2 reducido es un biomarcador independiente asociado con una recurrencia bioquímica más corto en el cáncer de próstata, revelando de ese modo la utilidad clínica potencial de DSG2 como un biomarcador de pronóstico de la agresividad del tumor para los pacientes afectados con esta enfermedad frecuente.
Discusión
los resultados presentados en este estudio proporcionan la primera caracterización molecular de expresión antidesmogleína en la próstata humana normal, la caracterización de DSG2 en líneas celulares de cáncer de próstata metastásico, y el primer análisis de la expresión DSG2 en muestras de tejido de carcinoma de próstata primario. Los resultados aquí reportados revelan que mientras la mayoría de desmogleínas se expresan claramente en la próstata humana en el nivel de ARN, solamente DSG2 y DSG4 están consistentemente identificados en un nivel alto en la próstata humana normal en el nivel de proteínas.