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PLOS ONE: Caracterización de cáncer de próstata metástasis óseas acuerdo a los niveles de expresión de las enzimas androgénica, y el receptor de andrógenos variantes de empalme


Extracto

Antecedentes

constitutiva del receptor de andrógenos actividad (AR) esteroidogénesis e intra-tumoral se han asociado con el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Este estudio tuvo como objetivo examinar si las metástasis óseas CRPC expresaron niveles más altos de enzimas de conversión de esteroides que las metástasis óseas no tratadas. los niveles de enzimas androgénica, también se analizaron en relación a la expresión de variantes AR constitutivamente activa (AR-V) y para las variables clínicas y patológicas.

Metodología /Principales conclusiones

Si no se trata, la hormona no tratados previamente (HN , n = 9) y CRPC metástasis óseas muestras (n = 45) se obtuvieron de 54 pacientes en cirugía de la metástasis. muestras de próstata no malignas y malignas fueron adquiridos a partir de 13 piezas de prostatectomía. Los niveles de transcripción y proteínas se analizaron por tiempo real de RT-PCR, inmunohistoquímica e inmunotransferencia. No se detectaron diferencias en los niveles de enzimas androgénica, entre CRPC y metástasis óseas HN. niveles significativamente mayores de SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, y mRNA HSD17B10 fueron sin embargo encuentran en las metástasis óseas que en no maligno y /o tejido de próstata maligno, mientras que el CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2, SRD5A2, y los niveles HSD17B6 mRNA en metástasis fueron significativamente menores . Un subgrupo de metástasis expresa niveles muy altos de AKR1C3, que no era debido a la amplificación génica como se examinó mediante ensayo de variación del número de copias. No se encontró asociación entre la expresión y la tinción AKR1C3 AR nuclear, la proliferación de células tumorales o la evolución del paciente después de la cirugía metástasis. Con una sola excepción, se encontraron niveles elevados de proteína AR-V en las metástasis óseas con bajos niveles AKR1C3, mientras que las metástasis con altos niveles de AKR1C3 contenían principalmente bajos niveles AR-V, lo que indica distintos mecanismos detrás de la castración-resistencia en las metástasis óseas individuales.

Conclusiones /Importancia

la capacidad de convertir los esteroides suprarrenales glándula derivados en andrógenos más potentes se indicó en un sub-grupo de metástasis ósea inducida por PC. Esto no se asoció con CRPC sino simplemente con la etapa avanzada de la metástasis. Subgrupos de metástasis óseas podrían ser identificados de acuerdo a sus niveles de expresión de AKR1C3 y AR-Vs, que podrían ser relevantes para la respuesta del paciente al 2
ª línea de terapia de privación de andrógenos

Visto:. Jernberg E, E Thysell, Bovinder Ylitalo E, Rudolfsson S, S Crnalic, Widmark A, et al. (2013) Caracterización de cáncer de próstata metástasis óseas acuerdo a los niveles de expresión de las enzimas androgénica, y el receptor de andrógenos variantes de empalme. PLoS ONE 8 (11): e77407. doi: 10.1371 /journal.pone.0077407

Editor: Kaustubh Datta, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 14 de mayo de 2013; Aceptado: 2 Septiembre 2013; Publicado: 7 Noviembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Jernberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación sueco, el sueco Cancer Society, la Fundación de Investigación del cáncer en el norte de Suecia, Fundación para la Investigación sobre el cáncer del león, y la Universidad de Umeå. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

El tratamiento de primera línea para los pacientes con cáncer de próstata avanzado (PC) es la terapia de privación de andrógenos (ADT). Esta terapia es eficaz en la mayoría de los pacientes, pero después de un periodo de remisión de tumores iniciales generalmente recaen, en su mayor parte dentro del hueso, y luego se denominó PC resistente a la castración (CRPC).

A pesar de los bajos niveles circulantes de andrógenos en los hombres castrados la mayoría de los tumores CRPC muestran receptor actividad (AR) de andrógenos y expresión de genes regulados AR [1]. Posibles mecanismos detrás de la actividad de AR en CRPC incluyen la amplificación de genes AR y las mutaciones, la síntesis intra-tumoral de los andrógenos, y la expresión de variantes de corte y empalme AR constitutivamente activa [2], [3]. En especial algunos tumores CRPC, y las células tumorales individuales en la mayoría de los pacientes, muestran muy baja o ausencia de inmunotinción AR nuclear, y los factores de menor sea la AR no necesariamente están regulados hasta en esos casos [4], [5], [6] , [7]. Hemos caracterizado recientemente una serie de hormonas ingenuo (HN) y metástasis óseas en pacientes CRPC de acuerdo a la activación de AR y la expresión de las variantes de corte y empalme AR (AR-V) [5], [8]. Los niveles de la AR-V7 (también denominado AR3) [9], [10] y AR-V567es [11] variantes se incrementaron en CRPC en comparación con metástasis HN y, por otra parte, resultó ser altamente expresado en un subgrupo de CRPC especialmente los pacientes con mal pronóstico [8]. El AR-V7 y AR-V567es carecen de dominio de unión a ligando (LBD) y poseen actividad constitutiva [9], y los pacientes que expresan los AR-Vs probablemente muestran una mala respuesta al ADT y anti-AR drogas dirigidas a la LBD. Algunos pacientes CRPC sin embargo responden a 2
nd ADT línea y esto podría ser debido a intratumoral esteroidogénesis y la producción de testosterona, dihidrotestosterona (DHT), u otros andrógenos en niveles suficientemente altos como para la activación de AR, según lo informado por otros [13 ], [14], [15], [16]. Es, sin embargo, no se sabe cuando estas enzimas androgénica, están regulados. Es que ya se incrementaron en las metástasis HN no tratados previamente, o como el AR-Vs [8] se incrementó como resultado de un tratamiento de castración? Un objetivo de este estudio fue, por tanto, para analizar la expresión de las enzimas de conversión de esteroides potencialmente implicados en la síntesis de testosterona y DHT en un conjunto de HN y metástasis óseas CRPC obtenido de pacientes en cirugía de la metástasis. Por otra parte, los niveles de expresión de la enzima se analizaron en relación a la expresión de AR-V, con el fin de identificar posibles mecanismos diferentes CRPC detrás de las metástasis óseas individuales.

Materiales y Métodos

Ética declaración

el estudio fue aprobado por la junta local de ética de la revisión de la Universidad de Umeå y los participantes dieron su consentimiento escrito o verbal. Debido a la situación aguda cuando la cirugía metástasis ósea se lleva a cabo con el fin de síntomas de la espina dorsal y paresia de socorro, la logística no siempre permiten consentimiento por escrito y de la junta de revisión ética local, por lo tanto, también aprobados específicamente consentimiento verbal. El consentimiento verbal está documentado por el médico en la revista paciente.

Los pacientes

El tejido óseo se obtuvo de la metástasis serie de biopsias-frescos congelados y fijados en formalina recogidas de pacientes con PC operados por metástasis vertebral compresión de la médula o fracturas patológicas en el hospital de la Universidad de Umea (2003-2011). Características clínicas y terapias se resumen en la Tabla 1, y esta serie de pacientes se ha descrito previamente en Crnalic et al [5], [17], [18]. El estudio también incluye 13 pacientes que fueron tratados con prostatectomía radical en el Hospital de la Universidad de Umea, entre Feb de 2005 y Septiembre 2006. La edad media de los pacientes fue de 60 años (rango 48-68 años) y la mediana de PSA eran de 6,6 ng /ml (rango 3.5 -24 ng /ml). Once de los pacientes tenían tumores calificado como puntuación de Gleason (GS) 7 y dos como GS 8. Cuatro de los tumores se encontraban en estadio T2 y nueve en estadio T3. Información adicional acerca de la manipulación de tejidos ha sido descrito previamente en hornberg et al [8].

Preparación de la muestra

áreas representativas de las metástasis óseas, PC principal y el tejido de la próstata no maligno eran crio -sectioned en tubos de extracción y el ARN se aisló utilizando el protocolo de Trizol (Invitrogen, Estocolmo, Suecia) o ADN AllPrep /ARN /proteína Mini Kit (Qiagen, Sollentuna, Suecia). Para los casos eran de ADN y proteína se analizaron en paralelo con ARN, ácidos nucleicos y de proteínas fueron aislados de las mismas secciones de tejido utilizando el método AllPrep. Los porcentajes de células tumorales en las muestras estaban por encima de 50% en la mayoría de los casos. Las concentraciones de ARN y ADN fueron cuantificados por medidas de absorbancia utilizando un espectrofotómetro (espectrofotómetro ND-1000; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce Chemical Co., IL, EE.UU.). La calidad del ARN se analizó con el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) y verificado para tener un número integridad del ARN ≥6.

tiempo real RT-PCR

ARN fue Invertida transcrito con transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) en un volumen total de 10 l. La amplificación PCR subsiguiente se realizó usando el Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) o de la PRISM 7900HT instrumento ABI (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) en un volumen total de 20 l usando el SYBR IQ (laboratorios Bio-Rad) green Supermix o la mezcla maestra de la expresión génica TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Estocolmo, Suecia) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla S1. Cada muestra se llevó a cabo por duplicado y se ajusta a los correspondientes niveles de ARNm RPL13A. Análisis de la curva de fusión confirmó los productos amplificados, que también fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar el tamaño esperado (datos no mostrados).

La inmunohistoquímica

Las muestras se fijaron en formalina tamponada, descalcificada en ácido fórmico, y embebidos en parafina [5]. Cinco micras secciones de parafina fueron desparafinados acuerdo con procedimientos estándar, hervidas en tampón de 0,01 M de citrato, pH 6,0, y se inmunotiñeron para AKR1C3 (NP6-G6.A6, se diluyó 1:1000, Sigma, Saint Louis, Missouri, EE.UU.), AR (PG -21, diluido 1:25, Upstate, Lake Placid, Nueva York, EE.UU.), PSA (A0562, se diluyó 1:2000, Dako, Glostrup, Dinamarca) y Ki67 (MIB1, diluido 1:50, Dako) con Ultraview universal de detección DAB kit (Ventana Medical Systems). Nuclear AR y citoplasmática AKR1C3 y tinción PSA en las células epiteliales tumorales se obtuvo de acuerdo con la intensidad (0 = sin manchas, 1 = débil, 2 = moderado, 3 = intensa tinción) y la fracción de células teñidas (1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%). Una puntuación total (que van desde 0-12) se obtiene multiplicando las puntuaciones de intensidad de tinción y fracciones. Ki67 fue evaluado mediante la evaluación de las células epiteliales tumorales 300-1000 por paciente, tal como se describe anteriormente [5].

Copiar número de análisis

El número de copias del gen AKR1C3 en las metástasis óseas se examinó el uso de PC la Hs03060693_cn y los ensayos de número de copia Hs02574521_cn TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Estocolmo, Suecia), la orientación AKR1C3 exón 2 y el exón 7, respectivamente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con la descripción del fabricante, con RNasaP como gen de referencia, y se analizaron usando el software de copia de llamadas (Applied Biosystems).

inmunotransferencia
se mantuvieron
22Rv1 células de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( ATCC) y la proteína se extrajo como anteriormente. Las muestras (10 mg de proteína) se separaron por 7,5% SDS-PAGE en condiciones reductoras y posteriormente se transfirieron a membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Las membranas se bloquearon en leche al 5% seguido de incubación de anticuerpo primario en 4 ° C durante la noche (N-20 anticuerpo, se diluyó 1:500 en 1% de leche /PBST, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) con el fin de detectar la plena AR longitud y aproximadamente 80 kDa truncada AR-V con N-terminales intactas. Se aplicó la IgG anti-conejo secundario (Dako, Glostrup, Dinamarca) anticuerpo (diluido 1:20 000 en 2,5% de leche) después del lavado con PBST y se incubó durante 1 h en RT. expresión de la proteína se visualizó después de un prolongado lavado utilizando la avanzada kit de detección ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Los filtros fueron despojados, de acuerdo con procedimientos estándar, y se analizaron para los niveles de proteína actina utilizando el anticuerpo de conejo anti-actina de Sigma (Saint Louis. Missouri), se diluyó 1:8000, con el fin de garantizar la igualdad de carga de la muestra. señales ECL se cuantificaron utilizando un escáner ChemiDoc y el software Quantity One 4 (Bio-Rad Laboratories). La intensidad de la banda de 80 kDa en cada muestra de paciente se analizó y se expresó en relación a la intensidad de la banda AR de longitud completa correspondiente. El extracto de células 22Rv1 se ejecuta como una muestra de control positivo en cada gel.

El análisis estadístico

Las correlaciones entre variables se analizaron mediante el test de rangos de Spearman. Los grupos se compararon mediante la prueba de la U de Mann-Whitney para las variables continuas y la prueba de Chi-cuadrado para las variables categóricas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se realizó con la muerte del PC como evento y el tiempo de seguimiento como el tiempo entre la cirugía de metástasis y el último examen de seguimiento (diciembre de 2012). Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico para las Ciencias Sociales, el software SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, EE.UU.). Un valor de p menor o igual a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

No se inducción general de enzimas androgénica en resistente a la castración en comparación con metástasis óseas hormonas ingenuo

los niveles de expresión de genes de las enzimas clave implicadas en la formación de testosterona y DHT a partir del colesterol (Figura 1) se evaluaron mediante análisis de RT-PCR de HN (n = 9) y metástasis óseas CRPC (n = 45) en comparación con la próstata zona periférica primaria tumoral (n = 13) y el tejido de la próstata no maligno (n = 13).

Las enzimas con significativamente más altos niveles de mRNA se observan en las metástasis óseas que en no maligno y /o tejido prostático maligno se visualizan en negrita y enzimas con niveles significativamente más bajos observados en las metástasis óseas se muestran en
cursiva
. Los esteroides secretadas por la glándula suprarrenal se resaltan en gris.

Ninguna de las enzimas analizadas en la vía de la esteroidogénesis (Figura 1 y 2) mostraron significativamente diferentes niveles de expresión de ARNm entre HN y metástasis óseas CRPC (por comparación entre metástasis y tejido de la próstata ver abajo). La variabilidad entre los diferentes metástasis CRPC fue por muy grande y no se observaron individuos con expresión particularmente alta de las enzimas androgénica específicos en el grupo CRPC (Figura 2).

Todos los niveles de mRNA fueron corregidos por los niveles de ARNm del gen de mantenimiento y RPL13A normalizada al valor mediano de las muestras de tumor primario. * P & lt; 0,05. ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001. círculos abiertos indican valores atípicos y extremos. X indica niveles extremos fuera de la escala.

metástasis óseas del cáncer de próstata pueden convertir la debilidad de los andrógenos circulantes en otros más potentes, pero probablemente tienen una baja capacidad general para la esteroidogénesis de novo

Los niveles de transcripción de enzimas en los primeros pasos de la esteroidogénesis se redujeron en metástasis óseas HN y CRPC en comparación con el tejido prostático no maligno (Figura 2); CYP11A1 mediana, los niveles de CYP17A1 y HSD3B2 mRNA fueron de 0,15, 0,29 y 0,32 veces en HN y 0,14, 0,32 y 0,31 veces en las metástasis óseas CRPC en comparación con los niveles en tejido de la próstata no maligno (P = 0,004, 0,025 y 0,071, y P = 0,00004, 0,019 y 0,01, respectivamente). La mediana del nivel de ARNm CYP11A1 en las metástasis CRPC fue de 0,41 veces en comparación con el nivel en el tejido del tumor primario (P = 0,011, figura 2), mientras que el CYP17A1 y los niveles de HSD3B2 de ARNm en las metástasis óseas CRPC no fueron significativamente diferentes de los niveles en la primaria tejido tumoral. Sin embargo, los niveles de CYP11A1 de ARNm se correlacionaron con la CYP17A1 correspondiente, los niveles de HSD3B2, SRD5A1 y ARNm SRD5A2 en las metástasis CRPC (Rs = 0,80, P & lt; 0,000001, Rs = 0,740, P & lt; 0,000001, Rs = 0,53, P & lt; 0,0002, y Rs = 0,70, P & lt;. 0,000001), lo que indica que los primeros pasos de la esteroidogénesis pueden ser activos en las metástasis individuales

niveles de transcripción de muchas enzimas implicadas en los pasos posteriores de la síntesis de andrógenos se incrementaron en las metástasis en comparación con no maligno de próstata y el tejido del tumor primario (Figura 2). El AKR1C3 mediana y los niveles de AKR1C2 de mRNA fueron 5.5 y 5.4 veces mayor en HN (P = 0,03, P = 0,007) y 3,7 y 5,8 veces mayor en las metástasis óseas CRPC (P = 0,0006, P = 0,00008), respectivamente, en comparación con primaria tumores de próstata. Se observó un cambio de SRD5A2 a la expresión mRNA SRD5A1 con la progresión de la próstata no maligno a PC y PC metástasis (Figura 2), que está de acuerdo con los resultados en estudios previos [14], [15], [19]. Un cambio similar de la expresión principalmente HSD17B6 en el tejido tumoral de próstata no malignos y primaria a principalmente expresión HSD17B10 en las metástasis de PC Se observó, además, (Figura 2). Los niveles de ARNm AKR1C3 se correlacionó significativamente con la AKR1C2 y los niveles de ARNm UGT2B15 (R = 0.39, P = 0,008 y r = 0,49, p = 0,001).

En su conjunto estos resultados indican que las metástasis óseas en pacientes de PC puede tienen la capacidad de convertir andrógenos inducida con baja afinidad AR en andrógenos más potentes, mientras que
es menos probable de novo
síntesis de andrógenos a partir del colesterol.

Algunas metástasis óseas expresan niveles muy altos de AKR1C3

a pesar de que ninguna de las enzimas androgénica examinados observó una elevación significativa en los niveles de expresión CRPC en comparación con metástasis óseas HN, se observaron metástasis CRPC individuales para expresar niveles muy altos de transcripción (Figura 2). Una enzima que muestra los niveles particularmente altos de ARNm en un subgrupo de metástasis CRPC era AKR1C3. Como esta enzima tiene la capacidad de convertir circulantes de DHEA y androstenodiona (sintetizada en las glándulas suprarrenales) en 5-androstenodiol y la testosterona, se considera que es de particular interés.

Para determinar si los niveles de mRNA en AKR1C3 las metástasis se reflejaron en los correspondientes niveles de proteína, se evaluó la expresión de la proteína AKR1C3 por inmunohistoquímica y mediante el uso de un sistema de puntuación que tuvo tanto en intensidad y distribución de tinción en cuenta (Figura 3). Citoplasmática inmunotinción AKR1C3 se demostró en la mayoría de las células epiteliales del tumor mientras que la tinción nuclear era heterogénea observada y no anotó. Todas las metástasis mostraron una fuerte tinción positiva en las células endoteliales, mientras que se observó tinción variable en fibroblastos y las células hematopoyéticas en la médula ósea. La inmunotinción AKR1C3 puntuación total fue altamente correlacionado con los niveles de ARNm AKR1C3 en las metástasis correspondientes (R = 0,73, P & lt; 0,000001, n = 51). La expresión de alto AKR1C3 no fue debido a la amplificación del gen AKR1C3, según AKR1C3 análisis del número de copias del gen de 6 muestras de metástasis (3 muestras con niveles extremos AKR1C3 de ARNm y las puntuaciones totales de inmunotinción 12 y 3 muestras con baja expresión AKR1C3) en relación con la no 2 muestras de próstata malignos (datos no mostrados).

Una puntuación total (que van desde 0-12) se obtiene multiplicando la puntuación de intensidad de la tinción (0-3) en el tumor de células epiteliales con el marcador fracción positiva (1 -4). (A) Histograma de acuerdo con la puntuación total tinción AKR1C3 en las metástasis (negro) de hueso de la hormona-naïve (gris) y resistente a la castración. (B) sección Representante de la metástasis ósea con AKR1C3 total de la puntuación 0. (c) sección Representante de las metástasis óseas con la puntuación total AKR1C3 12. La barra indica 100 mM.

En las metástasis óseas CRPC, el AKR1C3 puntuación total tinción se correlaciona con los niveles de ARNm UGT2B15 (Rs = 0,39, p = 0,009, n = 43), lo que podría indicar la producción de DHT en las metástasis con la expresión de proteínas de alta AKR1C3. Sin embargo, era evidente que la expresión de proteínas de alta AKR1C3 no estaba directamente relacionado con la actividad de alto AR en las metástasis CRPC; 14 de 18 (78%) muestras de tinción con puntajes altos AKR1C3, definida como un AKR1C3 inmunotinción puntuación por encima de la mediana (6) y 15/25 (60%) muestras de tinción con puntajes bajos AKR1C3 (≤6) mostraron alta tinción nuclear de AR puntuaciones (= 8, por encima de la mediana, como se define en [5], P = 0,22). De acuerdo con los resultados anteriores [5], alta inmunotinción AR en las metástasis se asoció con la supervivencia específica del cáncer más corto después de la cirugía de metástasis (log-rank = 8,1; p = 0,004, n = 45). En contraste con esto, no había correlación encontrada entre la inmunotinción AKR1C3 y la supervivencia específica del cáncer de los pacientes después de la cirugía CRPC metástasis (datos no mostrados). Tampoco hubo asociación observada entre la inmunotinción puntuación AKR1C3 y la puntuación de tinción de PSA (datos no mostrados) o el índice de proliferación de células tumorales (puntuación de tinción Ki67, los datos no presentados).

La expresión de las enzimas androgénica, en relación con los niveles de andrógenos variantes de corte y empalme del receptor

El AR niveles de proteína se estudiaron mediante análisis de inmunotransferencia de 29 metástasis óseas CRPC seleccionados en base a los resultados de inmunohistoquímica para incluir AR AR baja a AR metástasis de puntuación más alta, y donde permaneció tisular adecuada para permitir inmunoblot análisis. Se detectó la AR longitud completa de aproximadamente 110 kDa en la mayoría de los casos, mientras truncada AR-Vs de aproximadamente 80 kDa, la hipótesis para representar empalme AR variantes que carece del dominio LBD C-terminal, se detectaron en algunos casos (Figura 4). La intensidad de la banda kDa-80 se correlacionó fuertemente a nivel correspondiente de AR-V7 mRNA (Rs = 0,76, P & lt; 0,000002, datos no mostrados), de acuerdo con los propios resultados anteriores [8]. En hornberg et al [8] Los pacientes con niveles altos de metástasis de AR-V7 ARNm, que se define a tener niveles de mRNA en el cuartil superior, se encontró que tienen muy mal pronóstico. Sobre la base de este conocimiento, y el uso de un enfoque similar, se definieron 7 muestras analizadas por inmunotransferencia para expresar altos niveles de AR-V como la relación entre las intensidades de los 80 y los 110 kDa bandas fueron encontrados dentro de la 75
percentil de los datos (≥0.5).

el análisis se realizó usando un anticuerpo dirigido el dominio N-terminal de la AR. El extracto de células 22Rv1 se incluyó como control positivo.

Curiosamente, sólo uno de cada 13 (7,8%) con metástasis CRPC expresión de alto AKR1C3 (inmunotinción puntuación por encima de la mediana) también mostraron proteínas de alta AR-V los niveles. Esta fue una fracción significativamente menor que el encontrado entre metástasis con niveles AKR1C3 bajas (6/15, 40%, P = 0,049). Además, la hipótesis de que la expresión de células tumorales de AKR1C3 y variantes AR constitutivamente activo podría ser de relevancia para la respuesta tumoral individual a 2
nd ADT línea y la progresión clínica [8], y los 28 metástasis óseas evaluados tanto para AKR1C3 y AR-V por lo tanto, la expresión se dividieron de acuerdo con su AR-V y AKR1C3 niveles de expresión de proteínas, como se muestra en la Figura 5, a fin de demostrar subgrupos de posible relevancia clínica.

Los niveles altos de AKR1C3 se encontraron básicamente en las metástasis con baja niveles de AR-V y viceversa (P = 0,049, según la prueba de Chi-cuadrado).

Cabe destacar que ninguno de las metástasis con tinción homogénea AKR1C3, es decir, la fracción de células teñidas positivamente por encima del 75% , mostraron altos niveles de AR-V en comparación con 7/15 metástasis con & lt; 75% de células teñidas positivamente (P = 0,004). Esta observación merece ser examinado más a fondo, ya que podría indicar que los altos niveles de AR-V se inducen preferible en células tumorales sin esteroidogénesis endógeno. Por desgracia, no hemos podido estudiar esta hipótesis de heterogeneidad entre las células tumorales como anticuerpos para la evaluación inmunohistoquímica de AR-Vs no estaban disponibles.

Discusión

síntesis intra-tumoral de la testosterona y DHT ha sido sugerido para contribuir al crecimiento CRPC. En este estudio se compararon los niveles de expresión de enzimas esteroidogénicas en metástasis óseas CRPC con niveles en las metástasis obtenidas de pacientes un-tratado y, sorprendentemente, encontró ninguna inducción de las enzimas examinadas en CRPC en comparación con metástasis HN. Sin embargo se encontraron altos niveles de expresión de ciertas enzimas androgénica; SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, y HSD17B10, en las metástasis óseas cuando se comparan con la próstata no maligno de la próstata y el tejido del tumor primario. Por otra parte, hemos sido capaces de mostrar claras diferencias en los niveles de expresión de AKR1C3 y niveles de variantes de empalme AR en los casos individuales de las metástasis óseas CRPC, que planteamos la hipótesis de que podría ser de relevancia para la respuesta del paciente al 2
nd terapias de línea.

andrógenos de tejidos pueden ser derivados por
de novo
síntesis de colesterol [20], [21] o por la conversión de precursores suprarrenales en esteroides más potentes [22]. Nuestros resultados muestran generalmente altos niveles de AKR1C3 y SRD5A1 en las metástasis están en consonancia con los informes anteriores [14], [15], [16] y puede indicar la síntesis de testosterona y DHT en una y dos etapas, respectivamente, de la androstenediona suprarrenal derivados . Por la actividad de SRD5A1, DHT también podría ser sintetizado a través de 5α-reducción de la androstenediona a androstanodiona y luego por una mayor reducción de androstanodiona a DHT por AKR1C3. Esta ruta para la síntesis de DHT, que no pasa por la testosterona, se demostró recientemente por Chang y compañeros de trabajo a dominar en líneas celulares CRPC, así como en las metástasis muestras de los pacientes se estimularon con androstenediona [23]. Además, los altos niveles de AKR1C2 y HSD17B10 hacen la síntesis de DHT a través de la androsterona y androstanodiol posible en casos individuales, similar a lo que se ha observado en líneas celulares de PC, así como en los xenoinjertos CWR22R resistentes a la castración en ratones [24]. síntesis intra-tumoral de androsterona y androstanodiol podría estimular el crecimiento del tumor no sólo como esteroides intermedios en la síntesis de DHT, sino también activadores de AR como potentes en los casos con ARS mutadas [25]. Asimismo podría androstenediol, produjo presumingly de DHEA en las metástasis con actividad AKR1C3, activar ARs con mutaciones específicas [26]. En contraste con los primeros informes [14], [15], pero en línea con Hofland y compañeros de trabajo [16], encontramos bajos niveles de expresión de CYP11A1, CYP17A1 y HSD3B2 en ambas metástasis no tratadas y CRPC. Los altos niveles de CYP11A1, CYP17A1 y ARNm HSD3B2 en cambio se encuentran en el tejido de la próstata no maligno, probablemente debido a la alta síntesis de las enzimas en las células normales del estroma de la próstata, y el mismo fue cierto para SRD5A2 y HSD17B6 [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. A partir de este nos gustaría concluir que los andrógenos suprarrenales derivado probablemente contribuyen al crecimiento de las metástasis óseas CRPC por su conversión intra-metastásico en andrógenos más potentes, mientras que
es menos probable de novo
síntesis de andrógenos a partir del colesterol dentro de las metástasis , excepto quizás en casos individuales con correlación de expresión de CYP11A1, CYP17A1 y HSD3B2.

Se han encontrado altos niveles de expresión de AKR1C3 en un subgrupo de las metástasis óseas de PC, que confirman los resultados ya se ha informado en la primaria resistente a la castración los tumores de próstata [16], [31] y el tejido CRPC de diferente origen metastásico [14], [15], [32]. Un aumento en la actividad AKR1C3 podría obviamente contribuir a la conversión de los esteroides adrenales derivados de ligandos en AR más potentes, como se discutió anteriormente, y a AR activación en CRPC. Del mismo modo, Hamid y colaboradores demostraron la síntesis dependiente AKR1C3 de la testosterona en las células estimuladas con CRPC DHEA [31]. Los efectos beneficiosos de los niveles altos AKR1C3 en metástasis HN o en metástasis de baja inmunotinción AR nuclear, como se ha demostrado en algunos casos en este estudio, son menos claras, pero pueden depender de otras reacciones impulsadas por esta enzima. Además de 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (17β-HSD) la actividad AKR1C3 posee también prostaglandina F (PGF) la actividad sintasa que daría lugar a la proliferación en las células PC independientes de andrógenos y el estado de AR debido a la formación de epímeros PGF y la activación del receptor FP y también por la prevención de la formación PGJ2 y sus pro-diferenciadores y anti-proliferativa efectos [33].

en conclusión, queremos hacer hincapié en que el aumento de la expresión tumoral de las enzimas androgénica en pacientes individuales no está claramente asociada con CRPC sino simplemente asociada con el estadio del tumor avanzado, como se puede observar no sólo en el tejido CRPC de origen diferente [14], [15], [16], [31], [32] sino también en previamente tratados con un, HN, metástasis óseas (este estudio). Además, este estudio, junto con estudios anteriores indican que los tumores CRPC se pueden clasificar según distintos patrones de expresión de enzimas esteroidogénicas, y por lo tanto probablemente diferentes mecanismos detrás de la castración resistencia (este estudio y [16], [32], [34]). además, mostramos que el subgrupo de las metástasis óseas CRPC que expresan altos niveles de AKR1C3 es en gran parte distinta del subgrupo que expresan altos niveles de LBD truncado, constitutivamente activa AR-Vs. La posible relevancia clínica de esto es que los pacientes con una expresión de alto AKR1C3 y baja expresión de AR-V podrían ser los pacientes que muestran una buena respuesta al tratamiento con acetato de abiraterona (inhibición CYP17, [35]) y /o se beneficiarían de fármacos que se dirigen AKR1C3 [36] , mientras que los pacientes con alta expresión de constitutivamente activa AR-Vs probablemente no responderán a acetato de abiraterona o para cualquier terapia de orientación síntesis de andrógenos o el LBD de la AR.

Una limitación de este trabajo es el número limitado de hueso metástasis, y por otra parte la muestra metástasis única examinada desde cada uno de los pacientes, lo que obviamente hacen conclusiones con respecto a esta enfermedad heterogénea y el estado general del paciente incierto. También somos conscientes de que los niveles de expresión no necesariamente reflejan las actividades biológicas y nuestra hipótesis de que el patrón de expresión tumoral de AKR1C3 androgénica y variantes AR constitutivamente activos sería predecir la respuesta al 2
nd terapias línea de CRPC tiene que ser probado por adelantado en los estudios clínicos.

Apoyo a la Información sobre Table S1.
Primer secuencias utilizadas para el análisis en tiempo real de RT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077407.s001 gratis (DOC)

Reconocimientos

hábil técnica la asistencia fue proporcionada por la Sra Pernilla Andersson, Elisabeth Dahlberg, Birgitta Ekblom, e Inger Lindström.

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