Extracto
Nuevas evidencias sugieren células madre del cáncer (CSC) puede iniciar nuevos tumores en el carcinoma anaplásico de tiroides (ATC), uno de los tumores sólidos más agresivos en humanos. Sin embargo, la participación de las células madre cancerosas en la tumorigénesis humana no se ha estudiado previamente en líneas celulares ATC autenticados. Aquí se demuestra un papel funcional de las células madre cancerosas en cuatro nuevas líneas validados humanos ATC celulares (THJ-11T, 16T-THJ, THJ-21T y 29T-THJ). Se identificaron células madre cancerosas y enriquecidos utilizando un ensayo de formación de esferoides. Alrededor del 3 al 9% de las células de cuatro líneas celulares ATC formó thyrospheres. Los thyrospheres expresaron el vástago de marcadores de células NANOG y Oct4 y poseían la capacidad de auto-renovación. La inyección de estos thyrospheres en la tiroides de ratones NOD /SCID
IL2RG - /-
ratones resultó en la formación de los tumores metastásicos que recapitula las características clínicas de ATC humano. Para nuestro conocimiento, este es el primer
in vivo
caracterización de células madre cancerosas de la tiroides usando líneas celulares humanas ATC validados. La disponibilidad de thyrospheres específicos de la enfermedad y nuestros modelos de tumores ortotópico permitirá a la elucidación de los mecanismos de la enfermedad y el nicho ambiental de las células madre cancerosas. También pueden ser útiles para el cribado preclínico y terapéutica para el seguimiento de los efectos de las terapias biológicas en ATC
Visto:. Li W, Reeb AN, Sewell WA, Elhomsy G, Lin RY (2013) Caracterización fenotípica de metastásica anaplásico tiroideas células madre del cáncer. PLoS ONE 8 (5): e65095. doi: 10.1371 /journal.pone.0065095
Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia |
Recibido: 18 Octubre, 2012; Aceptado: 22 de abril de 2013; Publicado: 28 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención R01 DK068057 y el Fondo de Investigación del presidente de la Universidad de Saint Louis (RYL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) es una de las neoplasias humanas más letales. El noventa por ciento de los pacientes con ATC mueren dentro de los seis meses siguientes al diagnóstico. Aunque es relativamente raro - que representa sólo el 2% de todos los casos de cáncer de tiroides - ATC hace que más del 50% de todas las muertes por cáncer de tiroides cada año. Los tratamientos actuales para ATC son agresivos, e incluyen cirugía, quimioterapia y terapia de radiación. Sin embargo, ATC es resistente a todos los tipos de terapia y pronóstico de la enfermedad no ha cambiado durante más de 50 años [1]. Claramente, el ATC es un importante reto diagnóstico y terapéutico
Un subconjunto de las células madre del cáncer (CSC) ha planteado la hipótesis de reconstituir y mantener el crecimiento del tumor en el ATC [2] -. [7]. Células madre cancerosas son células iniciadoras de tumores que poseen propiedades de células madre similares. Se caracterizan por una capacidad de someterse a la división tanto simétrica y asimétrica, así como de diferenciarse en una multitud de tipos de células tumorales. Son en gran parte de reposo, lo que les permite escapar quimioterapias estándar dirigidos a las células que se dividen rápidamente. CSC se pueden aislar de las dos líneas celulares de cáncer de tiroides establecidas y las muestras de tumor. Sin embargo, un grave problema de contaminación de la línea celular ha puesto en duda los resultados de muchos estudios recientes de líneas celulares ATC humanos, incluyendo dos en las que nosotros y otros laboratorios describimos una población CSC CD133-positivo en la línea celular ATC ARO que era a la vez tumorigénico y resistente a la quimioterapia [8], [9]. Esta línea celular ARO ya que se ha demostrado que estar contaminados con la línea celular de cáncer de colon humano HT-29. De hecho, Schweppe
y col Hola, ha encontrado que hasta un 42% de las líneas celulares de cáncer de tiroides se utilizan comúnmente en la investigación de la tiroides durante las últimas dos décadas se identificó erróneamente, redundante o contaminación cruzada [10]. Este descubrimiento alarmante ha llevado a la comunidad de investigación de la tiroides para crear nuevas líneas celulares de cáncer de tiroides validados.
En este estudio se evaluaron cuatro líneas celulares humanas ATC autenticados (THJ-11T, 16T-THJ, THJ-21T y THJ-29T) de la existencia de células madre cancerosas que pueden iniciar el crecimiento neoplásico. Como se detalla en un informe de Marlow
et al
, se establecieron las cuatro líneas celulares ATC humanos de los tumores extirpados de pacientes ATC y se examinaron para la presencia de conocidos cambios tumorigénesis de tiroides, incluyendo mutaciones en
BRAF, KRAS, las ANR
, y
HRAS
; mutaciones en el
RET /PTC1, RET /PTC2
, y /o
RET /PTC3 sobre Fusion-oncogenes; y cualquiera de las variantes conocidas de la
PAX8 /PPAR
fusión-oncogén [11]. mutaciones genéticas únicas y 12 secuencias repetidas de ADN cortas en tándem (STR) fueron utilizados para enlazar las líneas celulares a sus respectivos tumores. - convirtiéndose en el primer conjunto de líneas celulares de cáncer de tiroides que puede ser incontrovertible remontar a su tejido de origen [11]
para examinar si existe una población de CSC en estas líneas celulares, se estableció por primera vez un ensayo de formación de esferoides-fiable para identificar y enriquecer células madre cancerosas de la tiroides. A continuación, probamos el efecto del cisplatino agente de quimioterapia en estas líneas celulares. a continuación, se evaluó la capacidad de estas células para iniciar nuevos tumores durante la serie
in vivo
pases en diluciones limitantes en NOD inmunodeficiente /SCID
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. Por último, hemos explorado el potencial metastásico de thyrospheres ATC en dos modelos de xenotrasplante: el trasplante de tiroides ortotópico para determinar si los thyrospheres son tumorigénicos y capaz de invadir tejidos locales, y un modelo de inyección de cola vena de la metástasis pulmonar inducida experimentalmente para poner a prueba la capacidad de la células de metástasis a sitios distantes.
Resultados
ATC células mantienen su capacidad clonogénico
in vitro
primero se estudió la proliferación de las cuatro líneas celulares humanas ATC : THJ-11T (p67), THJ-16T (p88), THJ-21T (p56) y THJ-29T (p89). Las imágenes de contraste de fase de estas líneas de células cultivadas en medio RPMI como monocapas y la curva de la proliferación de células durante un período de 96 horas se muestran en la Fig. 1A y 1B. En tiempo real el análisis cuantitativo de la transcriptasa inversa-PCR (qRT-PCR) mostró que todas las líneas celulares expresaron emparejados caja gen 8 (
Pax8
), un factor de transcripción-tiroides específico. Una de las líneas celulares, THJ-21T, también expresaron factor de transcripción tiroideo 1 (
TTF1
). Por el contrario, ninguna de las líneas celulares expresaron marcadores de diferenciación para la tiroides como tiroglobulina (
Tg
), sodio /cotransportador de yoduro (
NIS
), peroxidasa tiroidea (
TPO
) o el receptor para la hormona estimulante de la tiroides (
TSHR
) -. confirmando el estado desdiferenciado de estas líneas celulares ATC (Fig. 1C)
(a) imágenes de microscopía de contraste de fase de cuatro líneas celulares ATC cultivaron como monocapas en medio RPMI. curva de proliferación (B) Crecimiento más de 96 horas demuestra el potencial de proliferación de estas líneas celulares ATC. (C) Análisis QRT-PCT de factores de transcripción tiroideo fue
Pax8
y
TTF1 Opiniones y marcadores de diferenciación de tiroides
TSHR
,
TG
,
NIS
, y
TPO
. GAPDH humano se utilizó como gen de mantenimiento durante las amplificaciones.
Para la caracterización de células madre cancerosas en estas líneas celulares, se evaluó su capacidad de formar colonias y thyrospheres
in vitro
. Higo. 2A muestra que todas las líneas celulares formaron colonias en medios basados en metilcelulosa después de siete días en cultivo. También formaron thyrospheres que flotan libremente cuando se siembran en condiciones de tallos de cultivos celulares en las placas de fijación ultra-bajas. Análisis de dilución limitante indicó que el porcentaje medio de thyrospheres formado fue 9,4 ± 0,8% en las células THJ-11T, 4,5 ± 0,9% en las células THJ-16T, 3,1 ± 0,6% en las células THJ-21T y 8,8 ± 1,0% en THJ-29T las células (Fig. 2B). El diámetro de thyrospheres primarios varió de 100 a 150 micras. Estos thyrospheres pueden expandirse después de varios pasajes. El porcentaje medio de thyrospheres secundarios se redujo en todas las líneas celulares: 5,5 ± 0,4% en las células THJ-11T, 3,3 ± 0,5% en las células THJ-16T, 1,2 ± 0,5% en las células THJ-21T, y 4,9 ± 0,2% en THJ células -29T (Fig. 2B). Esta reducción puede ser el resultado de una fase inicial de la expansión simétrica de las células madre de la tiroides cabezas de serie, seguido por la división asimétrica que da lugar a la progenie diferenciada que constituyen la mayor parte de las células thyrosphere. El próximo evaluó por inmunofluorescencia indirecta de la expresión de los marcadores de pluripotencia Nanog y Oct4 en thyrospheres generados a partir de las cuatro líneas celulares ATC. Imágenes de microscopía confocal representativas de thyrospheres THJ-21T indicaron expresión de Nanog y Oct4 (Fig. 2C). imágenes de contraste de fase representativos de células en monocapa parental THJ-21T indicaron que la expresión de estos marcadores de células madre es única para thyrospheres, y como se señaló anteriormente, no se ve en la monocapa de células parentales. Estas observaciones sugieren que todas las líneas celulares ATC tienen la capacidad de auto-renovación
in vitro
. Por otra parte, existe una clara evidencia de la expresión de genes asociados con células madre en los thyrospheres.
(A) Representante análisis de microscopía de contraste de fase de colonias (izquierda) y thyrospheres (derecha) después de siete días de cultivo. Barra de escala, 100 micras. (B) Porcentaje de thyrospheres primaria y secundaria en las cuatro líneas celulares ATC. (C) Imágenes de microscopía confocal representativos de thyrospheres THJ-21T indicaron la expresión de Nanog (rojo), Oct4 (verde) y DAPI (azul). Barra de escala, 10 micras (panel superior). imágenes de contraste de fase representativos de células en monocapa padres THJ-21T indicaron la expresión de Nanog y Oct4 es única para thyrospheres y no se ve en la monocapa de células parentales (panel inferior).
El efecto de la quimioterapia agente cisplatino en las células ATC
se examinó el efecto del cisplatino como agente quimioterapéutico, que actualmente está siendo probado en un ensayo de fase I /II de ensayos clínicos en pacientes con ATC, en nuestras líneas de células ATC. Higo. 3A muestra imágenes de microscopía de contraste de fase de células representante THJ-11T expuestos a la dosis indicada de cisplatino durante 48 horas. Nuestros resultados demuestran una inhibición dosis-respuesta de cisplatino del crecimiento celular y establecieron un IC
50 para cada línea celular (Fig. 3B). Se determinó, además, si los thyrospheres exhiben quimiorresistencia cisplatino mediante la comparación de la sensibilidad de thyrospheres derivados de THJ-11T y células THJ-16T con la de la monocapa de células parentales (Fig. 3C). Después de 24 horas en presencia de 10 mM de cisplatino, la tasa de supervivencia de thyrospheres THJ-11T era ~1.7 veces mayor que la de las células en monocapa THJ-11T (52,5 ± 3,5
vs.
30,0 ± 1,4,
P Hotel & lt; 0,05). En contraste, la tasa de supervivencia de thyrospheres THJ-16T en condiciones idénticas fue similar a la de las células en monocapa THJ-16T ((49,7 ± 2,7
vs.
48,6 ± 1,5,
P = 0,73
) (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que una subpoblación de células formadoras de esferoides en las células THJ-11T, pero no en células THJ-16, son resistentes al tratamiento con cisplatino.
(a) Representante de contraste de fase imágenes de microscopía de monocapa de células derivadas de los padres THJ-11T expuestas a la dosis indicada de cisplatino durante 48 horas. (B) la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento en todas las líneas celulares del ATC. IC
50 valores son como se muestra para cada línea celular . (C) Comparación de
in vitro
resistencia a cisplatino de la monocapa de células parentales y células formadoras de esferoide. El THJ-11T y 16T THJ-parental monocapa de células derivadas de células y thyrosphere derivados fueron tratados con 10 M de cisplatino y la fracción de células en proliferación permaneciendo posteriormente fue estimado en base al ensayo de proliferación celular Alamar Blue. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. ****,
P Hotel & lt; 0,0001; ***,
P Hotel & lt; 0,001; **,
P
. & Lt; 0,05
células ATC iniciado tumores en ratones inmunodeficientes trasplantados en serie
Para probar nuestra hipótesis de que sólo una pequeña población de células madre cancerosas es responsable de la formación de tumores, se trasplantan cada una de las cuatro líneas de células de ATC en grupos de NOD /SCID
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- una cepa altamente inmunocomprometido que carece de células T, células B, y células NK [12] . La Tabla 1 muestra que la inyección subcutánea de cualquiera de las líneas celulares causó la formación de tumores en los ratones. Sin embargo, la longitud del tiempo de inyección para la formación de tumores, o de la latencia de las líneas celulares, variada: 28 días para THJ-11T, 28 a 70 días para THJ-16T, 56 a 77 días para THJ-21T, y 56 a 91 días para THJ-29T. Estas observaciones sugieren que las células THJ-11T inician el crecimiento del tumor de manera más eficiente que las otras líneas celulares ATC
A continuación trasplantaron en serie estos xenoinjertos primarios en otra NOD /SCID
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ratones para determinar el largo plazo potencial tumorigénico de estas células. La limitación de los experimentos de trasplante de dilución indicaron que la tasa de crecimiento del tumor aumentó con xenoinjerto de serie. Por ejemplo, la latencia de xenoinjertos secundarios de 5 × 10
5 células ATC (independientemente de la línea celular) fue de 14 a 28 días, mientras que la de un número equivalente de células de xenoinjertos terciarias fue de 7 a 14 días (Tabla 1) . También se observó que el tamaño de los tumores subcutáneos refleja el número de células inyectadas (Fig3. 4 A y B). Los tumores derivados de xenoinjertos secundario y terciario de células THJ-11T reproducen consistentemente los tumores primarios a nivel histológico, y transferencia Western y análisis de inmunohistoquímica confirmaron la expresión de marcadores tumorales ALDH, CD44 y CXCR4 en los xenoinjertos (Fig. 4 C-E). Tenga en cuenta que los xenoinjertos de ratones no expresan CD133, en consonancia con la declaración previa en cultivos primarios generados a partir de muestras quirúrgicas de ATC humano [5]. En conjunto, estos resultados sugieren que los cuatro de estas líneas celulares ATC tienen potencial tumorigénico a largo plazo y que nuestros modelos de xenoinjertos cuantitativa y cualitativamente recapitular la tumorigénesis
in vivo
. El hallazgo de que cada línea celular se puede propagar por tres pasajes demuestra su potencial de auto-renovación
in vivo
. En particular, se requieren 42 a 77 días para la formación de tumor después de la inyección subcutánea de 10.000 células thyrosphere derivados THJ-11T (Tabla 1). Este aumento en la latencia sugiere que el espacio subcutáneo puede no proporcionar el microambiente apropiado para células thyrosphere derivados. Curva
(A) El crecimiento del tumor generado por la inyección subcutánea de células de la monocapa derivado parentales THJ-11T. El número de células inyectadas se indica. (B) un tumor subcutáneo representante retirado de un xenoinjerto de ratón. (C) Análisis de transferencia de Western que muestra la expresión de ALDH, CD44, y CXCR4 en células derivadas de xenoinjertos primarios, secundarios y terciarios. (D) H & amp; E tinción mostró que los tumores procedentes de xenoinjertos primarios, secundarios y terciarios se componen de una población muy heterogénea de células con una gran relación de núcleo a citoplasma. (E) El análisis inmunohistoquímico de los niveles de ALDH, CD44, CD133 y CXCR4 en xenoinjertos de ratones generados a partir de xenoinjertos primarios de THJ-11T y 16T-THJ. Tenga en cuenta que los xenoinjertos de ratones no expresan CD133.
ATC células thyrosphere derivados son tumorigénicos y hacen metástasis a la tiroides y otros tejidos circundantes más agresivamente que monocapa de células derivadas de los padres en un modelo ortotópico murino de carcinoma de tiroides
Para estudiar más a fondo ATC metástasis en un entorno biológico que imita el proceso de la enfermedad en los seres humanos, establecimos un modelo ortotópico murino de carcinoma de tiroides mediante la inyección directa de células ATC en la glándula tiroides (Fig. 5A). Los tumores ortotópico establecidos por este método invadieron la tráquea y el esófago muscular cerca de dos semanas después de la inyección. Después de cuatro semanas, los tumores muestran muchas características clínicas de la ATC - una neoplasia maligna de alto grado que se caracteriza por un alto índice mitótico, atipia nuclear, pleomorfismo celular y necrosis. Cinco de cinco ratones inyectados en la tiroides con 10.000 células thyrosphere derivados de tumores desarrollados. Cinco de cinco ratones inyectados con 500.000 células THJ-11T (un aumento de 50 veces en el número de células) cultivadas en monocapa tumores también desarrollados. Sin embargo, los tumores thyrosphere derivados crecieron más rápido y eran más grandes cuatro semanas después de la inyección de los tumores fueron derivados de la inyección ortotópica de los mucho mayores números de células en monocapa derivado parentales (Fig. 5). Los volúmenes de los tumores thyrosphere derivados también fueron sustancialmente mayores que los de los tumores monocapa derivado de (60 ± 30 mm
3
VS
40 ± 20 mm
3;.
P
= 0,25) (Figura 5C). El análisis histológico de los tumores ortotópico derivados de ambas células thyrosphere y monocapa reveló extensión extratiroidea alrededor de la tráquea, y la invasión de la tráquea en el músculo liso y el esófago (Fig. 5B). Aunque el análisis de inmunohistoquímica confirmó la expresión de ALDH, CD44 y CXCR4 en los tumores derivados de cada tipo de células (Figura 5D) - un resultado consistente con los hallazgos del modelo subcutánea (Fig 4E.) - Un porcentaje significativamente mayor de células en thyrosphere derivados de tumores expresan estos marcadores (Fig. 5D). En conjunto, estas observaciones validan la potencial metastásico local de células thyrosphere derivado a la tiroides y otros tejidos vecinos.
(A) Un experimento representativo que muestra la ubicación de la glándula tiroides y tráquea. (B) ortotópico tumores generados con 500.000 células en monocapa derivado de los padres y 10.000 células thyrosphere derivados. H & amp; E tinción reveló la invasión de tumores anaplásicos en la glándula tiroides, la tráquea, el músculo liso y el esófago. F, folículos normales de la tiroides; S, el músculo liso; asterisco, tumores de la tiroides; E, esófago. (C) ortotópico tumores derivados de las células derivadas de thyrosphere tenían un volumen tumoral más grande que lo hicieron las derivadas de la monocapa de células derivadas de los padres (60 ± 30 mm
3
frente
40 ± 20 mm
3 ;
P
= 0,25). (D) La tinción inmunohistoquímica de ALDH, CD44, CD133 y CXCR4 en los tumores ortotópico generadas a partir de células monolayer- y thyrosphere derivados. Nótese la intensa inmunorreactividad de ALDH, CD44 y CXCR4 en los tumores derivados de thyrosphere cuatro semanas después de la inyección. (E) Representación esquemática del ensayo de colonización de pulmón en un modelo de inyección de cola vena. histología imágenes representativas de los ratones con metástasis pulmonar inducida por las células en monocapa THJ-11T. Tenga en cuenta que los ratones inyectados con células thyrosphere derivados no desarrollaron metástasis pulmonar. Barra de escala, 100 micras.
ATC thyrosphere derivados de células no inducir metástasis de pulmón
A medida que el modelo de trasplante ortotópico no siempre puede producir metástasis a distancia en el pulmón (una causa importante de muerte en el ATC), se inyecta 10.000 células derivadas de thyrosphere o 500.000 células THJ-11T cultivadas en monocapa en las venas de la cola de ratones NOD /SCID
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para inducir experimentalmente la metástasis de pulmón. Los ratones fueron sacrificados y secciones de pulmón se analizaron después de seis semanas. se observaron numerosos nódulos metastásicos en los pulmones de ratones inyectados con células THJ-11T cultivadas en monocapa, pero ninguno se encontraron en los pulmones de ratones inyectados con células thyrosphere derivados (Fig. 5E). Estas observaciones sugieren que las células derivadas de thyrosphere no promueven el desarrollo de metástasis pulmonares en este modelo de metástasis pulmonar inducida experimentalmente.
Discusión
ATC es el subtipo más agresivo de cáncer de tiroides. Debido a su resistencia a todos los tipos de terapia del cáncer, la supervivencia media de ATC es de sólo seis meses. Sin embargo, el desarrollo de terapias más eficaces se ha visto obstaculizada por la falta de líneas celulares de cáncer de tiroides validados para la detección de drogas a gran escala. Después de un informe en 2008 de temas línea celular de cáncer de tiroides contaminación cruzada graves [10], se hizo necesario para generar nuevas líneas de células validadas con una caracterización detallada de la integridad de la línea celular y los perfiles de STR que genéticamente enlazan las líneas de su tejido de origen. Las cuatro líneas de células ATC utilizadas en este estudio representan el primer panel de líneas celulares de cáncer de tiroides que cumpla con estos nuevos estándares estrictos. Nuestros resultados mostraron que las cuatro líneas celulares ATC contienen una pequeña población de células madre cancerosas con potencial de auto-renovación. Hemos desarrollado una manera simple y robusto para generar ATC metastásica en un modelo de ratón ortotópico usando thyrospheres humanos derivados de estas líneas celulares. La inyección de las células derivadas de thyrosphere en la tiroides de ratones NOD /SCID
IL2Rg - /- ratones
dio lugar a la formación de tumores metastásicos que recapitula las características clínicas de la ATC humana
tiroides son células madre cancerosas. raro, y la ausencia de marcadores de la superficie celular específicos hace que su aislamiento desafiante. Varios marcadores, incluyendo CD44, ALDH y CD133, se han utilizado con éxito para aislar células madre cancerosas de mama, de próstata, colorrectal, glioblastoma, y cánceres de páncreas [13] - [17], y CD133 ha sido previamente identificado como un marcador CSC putativo para ATC . Sin embargo, publicaciones de informes de estas observaciones han sido criticados por su uso de una línea celular de cáncer de colon contaminados [8], [9]. En el presente estudio, ninguna de las líneas celulares ATC expresa CD133, en consonancia con la declaración previa en cultivos primarios generados a partir de muestras quirúrgicas de ATC humano [5].
Las ventajas de líneas celulares ATC incluyen la capacidad de la cultura ellos durante largos períodos de tiempo y para crecer en grandes cantidades para aplicaciones de detección de drogas de alto rendimiento. A pesar de estas ventajas, es necesario para confirmar nuestros hallazgos en las células de ATC primarias porque las líneas celulares no siempre recapitulan todos los aspectos de los tumores primarios. Sin embargo, la rareza y la naturaleza rápidamente fatal de esta malignidad ha hecho de este difícil de conseguir en el laboratorio.
CSC se pueden aislar a través de una variedad de técnicas, incluyendo la citometría de flujo basado en la expresión de marcadores de superficie celular específicos como los discutidos anteriormente [18] - [21]. La clasificación de las poblaciones secundarios de las células cancerosas a través de Hoechst 33342 exclusión del colorante es un enfoque alternativo [22]. Estudios recientes también han demostrado que el ensayo y la cultura que forma esferoide-es un método igualmente eficaz de separar las CSC de muchos tumores sólidos o líneas celulares de cáncer [23], particularmente cuando - como es el caso con ATC - un CSC marcador de la superficie celular fiable aún no ha sido identificado.
el ensayo thyrosphere es un bien estudiado
in vitro
derivan ensayo de células para determinar la clonalidad múltiple y capacidad de potenciales células madre de la tiroides [2]. Disociar thyrospheres en células individuales, placas a dilución limitante y después someterlos a pases seriados en cultivo puede evaluar aún más el potencial de proliferación a largo plazo de estas células. Nuestros datos muestran que las cuatro líneas celulares ATC pueden ser cultivadas como thyrospheres y volverse a inocular varias veces, lo que confirma su potencial de auto-renovación
in vitro
. Nuestros estudios de citotoxicidad mostraron que una pequeña población de thyrospheres de la línea celular THJ-11T era resistente al tratamiento con cisplatino. Sin embargo, bajo las mismas condiciones, thyrospheres y células en monocapa se derivan de células THJ-16T eran igualmente sensibles a cisplatino. Estas diferencias podrían deberse a las diferencias moleculares y genéticas entre las dos líneas celulares ATC y pueden justificar una mayor investigación.
células madre cancerosas son capaces de reproducir la heterogeneidad completa del tumor padres y crecer de forma continua incluso después de varios pasajes. Por lo tanto, de una manera definitiva para confirmar el potencial de auto-renovación y multipotencia de un CSC
in vivo se
para regenerar el tumor en animales inmunodeficientes. Se encontró que los tumores de cada una de las cuatro líneas celulares ATC no sólo recapitulan la histología y la estructura de los tumores de los padres, sino también para propagar
in vivo Opiniones de tres pasajes. Estos resultados apoyan nuestra hipótesis principal que algunas células ATC exhiben propiedades de células madre
in vivo
. Encontramos además que xenoinjertos terciarios de las cuatro líneas celulares ATC crecieron más rápidamente en ratones NOD /SCID
IL2Rg - /- ratones que hizo
xenoinjertos primarios. Aunque estos resultados no indican necesariamente el enriquecimiento de células madre, que podrían indicar que algunas células cancerosas en los xenoinjertos terciarios son altamente proliferativas. Se necesita más investigación para explicar los xenoinjertos tumorales terciarias más agresivos en el ATC y para determinar las consecuencias, en su caso, para los tumores recurrentes en pacientes humanos.
En este estudio, hemos utilizado ratones NOD /SCID
IL2Rg - /- ratones
para poner a prueba las líneas celulares ATC para el crecimiento de xenoinjertos. Esta cepa de ratón carece de células T y B maduros y es deficiente para varios receptores de citoquina de alta afinidad - incluyendo IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 y IL21 - necesaria para el desarrollo de las células NK y las respuestas de inmunidad innata. Como resultado, el sistema inmunitario de esta cepa está más severamente afectada que la de los ratones NOD /SCID estándar. Por ejemplo, se ha informado de que uno de cada cuatro células individuales seleccionados al azar de una muestra de melanoma humano podría formar un tumor en este modelo de ratón, que es varios órdenes de magnitud mayor que las células de una en un millón sugeridas por los estudios in NOD /SCID estándar [12]. Es evidente que la selección de modelos de ratones genéticamente modificados para estudios de xenoinjertos de células madre cancerosas putativas puede afectar significativamente la sensibilidad del ensayo y debe ser considerado cuidadosamente la hora de interpretar los datos. Este NOD /SCID
IL2Rg - /-.
Cepa de ratón se ha convertido en el estándar de oro para probar el modelo CSC debido a su capacidad de xenoinjertos superiores
Hemos utilizado tres enfoques diferentes de trasplante para estudiar el tumorigénico y potencial metastásico de células thyrosphere derivados. De los tres sitios de trasplante hemos demostrado en este informe - subcutánea, la tiroides y la vena de la cola - sólo el modelo de trasplante ortotópico de tiroides genera tumores agresivos y metastáticos dos semanas después de la inyección. En comparación, el modelo subcutáneo, aunque capaz de soportar la iniciación del tumor, requiere más de 40 días para generar tumores detectables a partir del mismo número de células. Por último, el modelo de la cola de inyección venosa no puede iniciar tumores después de incluso seis semanas. Estas observaciones sugieren la existencia de un nicho en la tiroides que participa directamente en la regulación de las células thyrosphere derivados. ATC metástasis es un proceso complejo y altamente regulado mediada por diversos factores derivados del tumor. La comprensión de cómo thyrosphere derivados de células promueven local, pero no de pulmón, metástasis pueden ser cruciales para el desarrollo de terapias más eficaces para metastásico ATC
.
En resumen, la disponibilidad de células específicas ATC-thyrosphere derivados y los modelos de tumores ortotópico que recapitular el cáncer metastásico de manera mortal para los pacientes humanos con cáncer de tiroides da a los investigadores un panel de instrumentos clínicos sin precedentes. Nuestros hallazgos podrían resultar útiles en la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la diseminación de células madre cancerosas metastásicas y la exploración de estrategias terapéuticas que se dirigen directamente células madre cancerosas de la tiroides.
Materiales y Métodos
ATC cultivo celular humano, ensayo de formación de colonias, y thyrosphere ensayo
El ATC líneas celulares humanas THJ-11T, 16T-THJ, THJ-21T y 29T-THJ [11] fueron proporcionados por el Dr. John A. Copland (Clínica Mayo). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Cellgro, Manassas, VA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, y penicilina-estreptomicina-anfotericina B. Los cultivos se mantuvieron en una cámara humidificada en una 5% de CO
2 mezcla /aire a 37 ° C. Para el ensayo de colonias de formación, las células se cultivaron en el MethoCult medios basados en metilcelulosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá). Para el ensayo de formación de esferoidal, las células individuales en placas a 5000 células /pocillo en el ultra-bajo de fijación placas de seis pocillos (Fisher Scientific Co., Hampton, Nueva Hampshire). Las esferas fueron contados después de siete días. El porcentaje de células que forman thyrospheres se calcula a partir del número total de células sembradas. El numerador es el número de thyrospheres formados por pozo, y el denominador es 5.000.
En
in vitro
pasos en serie, thyrospheres se recogieron por centrifugación suave a 800 rpm durante 5 min y se disociaron enzimáticamente con 0,05% de tripsina /EDTA. se pasaron las células disociadas a través de filtros de malla de 40 micras (BD Falcon célula colador, Franklin Lakes, NJ) para eliminar dobletes o tripletes. Única células se sembraron a 5.000 células /pocillo en el ultra-bajo de fijación placas de seis pocillos para generar thyrospheres secundarias. Se realizaron tres rondas de este tipo de paso en serie. En algunos experimentos, se recogieron las esferas después de siete días, se trataron con tripsina en suspensiones de una sola célula y después se mezclan con Matrigel /RPMI en una dilución de 1:01 para la inyección en ratones.
aislamiento de ARN y QRT-PCR
ARN total fue aislado de 1 × 10
6 células con el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) y se trató con DNasa libre de RNasa (Qiagen). Dos microgramos de ARN total fueron transcritas invertir en cDNA utilizando el primer sistema Thermoscript capítulo de síntesis (Invitrogen, Grand Island, NY). Las secuencias de ADN de los cebadores (
Pax8
,
TTF1
,
TSHR
,
TG
,
NIS Opiniones y
TPO
) han sido publicados en otra parte [24], [25]. Los niveles de mRNA se cuantificaron por triplicado de QRT-PCR en un sistema de PCR ViiA7 (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR se realizó con una mezcla maestra de SYBR Green PCR. GAPDH humano se utilizó como gen de mantenimiento durante las amplificaciones.
En vivo
tumorigenicidad experimentos
Ocho semanas de edad, hembra NOD /SCID
IL2Rg
- /- ratones
se obtuvieron de Taconic Farms Inc. y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos con la aprobación del Comité de Cuidado y uso de Animales institucional de San Escuela de Medicina de la Universidad Louis. Para el transplante subcutáneo, las células individuales se resuspendieron en 100 l de Matrigel /RPMI en dilución 1:01 y se inyectaron por vía subcutánea en ratones NOD /SCID
IL2RG
- /-
ratones. La carga tumoral se midió dos veces a la semana por palpación y calibradores, y se calcularon los volúmenes tumorales por la siguiente fórmula: (π /6) x diámetro grande x (diámetro pequeño)
2. Los ratones fueron controlados durante tres a cinco meses de la aparición y el desarrollo de tumores. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 1,5 cm
3.
En el paso en serie, los tumores se recolectaron, picada, colagenasa-digerida y pasa a través de filtros de malla de 40 micras para obtener una suspensión de una sola célula. La población de células resultante se denomina "paso secundario" y se cultivó durante tres a siete días en medio RPMI /FBS al 10% y luego re-inoculadas en ratones NOD /SCID
IL2Rg
- /- ratones
. tumores posteriores se utilizan para repetidas rondas de aislamiento de células ATC y la generación de células de ATC a pases en serie adicionales hasta tres pasajes. También se agradece a los Dres.