Extracto
Alto grado de cáncer de ovario seroso (HGSOC) es el tipo histológico más agresivo de cáncer epitelial de ovario, que es que se caracteriza por una alta frecuencia de somáticas
TP53
mutaciones. Se realizaron análisis de exoma de los tumores y tejidos normales emparejados de 34 pacientes japoneses con HGSOC y observamos un número sustancial de pacientes sin
TP53
mutación (24%, 8/34). En combinación con los resultados de los análisis de la variación del número de copias, hemos dividido las 34 pacientes con HGSOC en subtipos designados ST1 y ST2. ST1 mostró vía p53 intacto y se caracteriza por un menor número de mutaciones somáticas y alteraciones del número de copias. Por el contrario, la vía de p53 fue afectada en ST2, que se caracteriza por mutaciones somáticas abundantes y alteraciones del número de copias. Perfiles de expresión génica combinados con análisis utilizando el recurso de ontología de genes indican la implicación de los procesos biológicos específicos (mitosis y la helicasa ADN) que son relevantes para la estabilidad genómica y la etiología del cáncer. En particular, se demuestra la presencia de un nuevo subtipo de pacientes con HGSOC que se caracteriza por una vía p53 intacta, con alteraciones genómicas limitados y los perfiles de expresión de genes específicos
Visto:. Hayano T, Yokota Y, Hosomichi K, Nakaoka H, Yoshihara K, Adachi S, et al. (2014) Caracterización molecular de un subtipo de p53 Camino sin avería en alto grado cáncer de ovario seroso. PLoS ONE 9 (12): e114491. doi: 10.1371 /journal.pone.0114491
Editor: Michael Baudis, Universidad de Zurich, Instituto Suizo de Bioinformática, Suiza |
Recibido: 16 de mayo de 2014; Aceptado: 10 de noviembre de 2014; Publicado: Diciembre 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Hayano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que, por razones aprobadas, algunas restricciones de acceso se aplican a los datos subyacentes a los hallazgos. Los datos contienen información de identificación y no pueden ser puestos a disposición. Un conjunto mínimo de datos sin identificación está disponible en Figshare: http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1235612. se dispone de datos adicionales a petición del Prof. Ituro Inoue (
[email protected])
Financiación: Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B) (concesión no . 23791816) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (http://www.jsps.go.jp/) (KY). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las tasas ajustadas por edad de los cánceres de ovario anejos uterinos y otros en 2002 fueron de 10,6 por 100.000, y un 5,2 por 100.000 personas-año en los EE.UU. y Japón, respectivamente [1]. cáncer epitelial de ovario es una entidad heterogénea que comprende múltiples tipos histológicos como serosa, células de alto grado seroso de bajo grado clara, endometrioide, y los cánceres mucinosos [2], [3]. los cánceres de ovario se dividen en tipo I y tipo II tumores [2], [4]; tumores de tipo I incluyen endometrioide seroso de bajo grado, de bajo grado, de células claras y carcinomas mucinosos. Estos tumores pobremente responden a la terapia basada en platino, albergan una alta frecuencia de mutaciones en genes que codifican componentes de la vía de señalización RAS, y son relativamente estables en la estructura genómica. Los tumores de tipo II incluyen carcinomas endometrioide y seroso de alto grado de alta calidad y son muy agresivos. Un estudio a gran escala de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) por el grupo del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) HGSOC caracteriza como
TP53
-mutation enriquecido (96%) con aberraciones de copia génica somática en todo el genoma números. Este estudio identificado las vías alteradas comúnmente como RB1, PI3K /RAS, Notch, recombinación homóloga, y las vías de FoxM1 [5]. El estado de la mutación de
TP53
se asocia con las etapas, los patrones de expresión de genes, y la supervivencia de pacientes con cáncer de ovario seroso [6].
Se intentó establecer un sistema de clasificación de riesgo de ovario seroso cáncer utilizando perfiles de expresión génica adquiridos a partir de datos de microarrays [7], [8]. Se identificaron 88 genes relacionados con la supervivencia libre de progresión en 110 pacientes japoneses con estadio avanzado de cáncer de ovario seroso [7], así como 126 genes relacionados con la supervivencia global en pacientes japoneses con 260 en estadio avanzado HGSOC [8]. Para proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la patogénesis de estos tipos de cáncer y para desarrollar un sistema de clasificación de riesgo, se realizó perfiles de las mutaciones somáticas presentes en estos tumores
.
Hemos recopilado la información genómica para los pacientes con HGSOC mediante la secuenciación del exoma y la variación del número de copias (CNV) analiza. De acuerdo con los perfiles de variantes somáticas de nucleótido único (SNVS), pequeñas inserciones y deleciones (indeles), y VNC, clasificamos HGSOC en subtipos designados ST1 y ST2 que se caracterizan por las vías de señalización de p53 intactos o deficientes, respectivamente. Nos caracteriza más los dos subtipos mediante la comparación de sus perfiles de expresión de genes. la ontología de genes (GO) el análisis mostró que los genes expresados diferencialmente se enriquecieron significativamente en los grupos helicasa GO mitosis y de ADN que pueden estar implicados en la inestabilidad genómica y la tumorigénesis de HGSOC. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre las características moleculares y procesos biológicos novedosos que contribuyen a la patogénesis de HGSOC, especialmente en pacientes con una vía p53 intacta.
Materiales y Métodos
Ética declaración
los comités de ética de la Universidad de Niigata (IRB Nº 239, 428, y 455) y el Instituto Nacional de Genética (IRB Nº 23-11) aprobaron los protocolos de estudio, y cada participante proporcionado consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y los análisis posteriores.
Las muestras clínicas
Las muestras frescas congeladas se obtuvieron a partir de tejidos tumorales primarias antes de la administración de la quimioterapia. Dos patólogos evaluaron las características histológicas de las secciones fijadas en formalina y hematoxilina incluido en parafina y eosina. Debido a que la caracterización histológica definitiva era un componente crítico del estudio, una revisión patológica central fue realizada por dos patólogos independientes ginecológicos (HT y TM) sin conocimiento del estado clínico de los pacientes. tipos histológicos y grado de diferenciación histológica se determinaron de acuerdo con la clasificación de la OMS de los tumores ováricos y la clasificación Silverberg, respectivamente [8]. Los datos clínicos (PT- y FIGO etapa) se muestran en la Tabla S1. Se utilizó sangre periférica como el tejido normal correspondiente.
secuenciación Exoma
ADN genómico se aisló de los tejidos tumorales utilizando un método de fenol-cloroformo y de la sangre periférica usando el kit de ADN QIAamp Blood Maxi (QIAGEN ) [8]. El ADN genómico se hibrida con SureSelect Human All Exon Kits (Agilent) para preparar bibliotecas genómicas, y las bibliotecas fueron secuenciados utilizando el Illumina HiSeq 2000 (Illumina) con 90 o 100 módulos extremos bases apareadas. Secuencia lee fueron alineados a un genoma de referencia (UCSC hg19) usando BWA [9] y SAMtools [10]. Picard (http://picard.sourceforge.net) se utilizó para la eliminación de lecturas duplicadas. realineación Local de lecturas indeles y recalibración de la calidad de base alrededor conocidos se realizaron con GATK [11]. La persona que llama mutación somática heurística, VarScan 2 [12], se utilizó para realizar llamadas de mutación somática. criterios de umbral para la detección de mutaciones somáticas fueron los siguientes: frecuencia de la variante normal del 0% y el valor de la prueba exacta de Fisher p & lt; 0,00001. información funcional de las mutaciones somáticas fue anotado utilizando ANNOVAR [13] y Oncotator (http://www.broadinstitute.org/oncotator/).
predicción de los efectos funcionales de sentido erróneo de un solo nucleótido variantes
efectos funcionales de las mutaciones de sentido erróneo somáticas identificadas se evaluaron usando MutationAssessor 2 [14], que predice el efecto de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con un patrón de conservación evolutiva sobre la base de alineamientos de secuencias múltiples de una familia de proteínas. mutaciones sin sentido con una puntuación de impacto funcional (FIS) de & gt; 2.0 se definieron como nocivo
Detección de cáncer de genes Conductores
Para detectar posibles genes del cáncer de controladores basados en las mutaciones somáticas identificadas, nosotros también. usado OncodriveFM [15], que evalúa la acumulación de mutaciones con impacto funcional de alta dentro de un gen, en el supuesto de que los genes de controlador cáncer son altamente mutadas y ejercen efectos funcionales sustanciales. Sin embargo, las consecuencias de las mutaciones en genes de pasajeros son en su mayoría benigna. OncodriveFM deriva de la FIS MutationAssessor 2 para evaluar si los genes mutados son conductores o pasajeros.
Los análisis de la CNV y la pureza del tumor
polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) serie de experimentos utilizando Genoma Humano-ancha SNP 6.0 (Affymetrix) se llevaron a cabo previamente para 30 de 34 muestras HGSOC [8], [16]. Debido a las dificultades técnicas y cantidades limitadas de ADN, no pudimos obtener datos SNP serie de cuatro muestras restantes. Affymetrix CEL archivos de SNP serie de experimentos utilizando 30 muestras se procesaron mediante el paquete de software de detección de la CNV PennCNV [17]. VNC se llaman por medio de un modelo de Markov oculto de acuerdo con los cálculos de la relación de registro R y B los valores de frecuencia de alelo. Se evaluó la frecuencia CNV entre el tumor y las muestras normales para cada SNP usando la prueba exacta de Fisher en el algoritmo de ParseCNV [18]. criterios de umbral de los recurrentes regiones de la CNV (CNVRs) fueron los siguientes: el valor de la prueba exacta de Fisher p & lt; 0,0005 y sin superposición con variaciones estructurales en muestras procedentes de sujetos sanos [19]. Además, los archivos CEL fueron utilizados para estimar la pureza tumor. Se utilizó el ASCAT (alelo-específica número de copia Análisis de tumores) algoritmo [20], en la versión de software 6.0 NEXUS número de copias (BioDiscovery) [21] para estimar el grado de contaminación de las células normales en muestras de tumores. Los SNP serie de datos MIAME compatible fueron depositados a la Expresión Génica Omnibus repositorio de datos (número de acceso GSE61237).
Experimentos de microarrays y procesamiento de datos
La extracción de ARN, el etiquetado Cy3, microarrays de hibridación, la señal escaneo, y la extracción de características se realizaron en estudios previos [7], [8]. La normalización de datos se realizó mediante el ajuste GeneSpringGX11 (Agilent) del umbral de la señal en bruto de 1,0 y la normalización de la 75
percentil.
La expresión génica análisis
La importancia de las diferencias en la expresión génica entre los dos subtipos se evaluó utilizando el
t-test
. Después de la evaluación, las pruebas múltiples se corrigió por la tasa de falso descubrimiento (FDR) utilizando el procedimiento Benjamini-Hochberg [FDR (BH)]. Hemos establecido FDR (BH) a & lt; 0,1 como umbral significativo. Estos análisis se realizaron utilizando el módulo de ComparativeMarkerSelection GenePattern [22].
GO análisis
GO análisis se realizó utilizando la herramienta de anotación agrupación funcional incluido en el recurso bioinformática DAVID [23]. Esta herramienta evalúa la similitud de los términos de anotación usando estadísticas kappa y grupos de fuerzas para compartir perfiles de anotación similares usando una heurística partición múltiple vinculación difusa [24]. Los ajustes fueron de la siguiente manera: ocho categorías de anotación (OMIM_Disease, COG_Ontology, SP_PIR_Keywords, GOterm_BP_FAT, GOterm_MF_FAT, BBID, BioCarta, y KEGG_Pathway), la superposición similitud plazo de ≧ 3, kappa umbral estadístico de 1, pertenencia a un grupo de ≧ 3, y la difusa múltiple umbral partición varillaje de 1, respectivamente. puntajes de enriquecimiento se calcularon utilizando la media geométrica de los valores de p de la prueba exacta de Fisher modificada (escala log) para el enriquecimiento de genes de cada término GO GO en cada grupo y una puntuación de enriquecimiento de & gt; 1,3 se considera significativa [23]
.
visualización de datos
Los datos de mutaciones somáticas se muestran utilizando Gitools (versión 1.8.4) [25]. los datos de número de copias se muestran utilizando Integrativa Genómica Visor (IGV, versión 2.3.25) [26]. enjambre de abejas y los diagramas de caja fueron creados usando el paquete beeswarm en el repositorio CRAN (http://cran.r-project.org/). vistas de los mapas de calor de los datos de expresión génica se muestran utilizando el módulo HeatMapViewer en GenePattern [22].
Resultados
genómicas de alteración de perfiles
Las mutaciones somáticas identificadas en muestras adquiridas a 34 japoneses pacientes con HGSOC fueron catalogados de acuerdo con el análisis de los datos de secuenciación del exoma. La profundidad de lectura promedio fue de 91 × 84 × y para muestras tumorales y normales, respectivamente. La cobertura de ≧ 10 × se logró el 89% y el 88% de bases de muestras tumorales y normales, respectivamente (Tabla S2) de codificación. Se identificaron 1.399 nonsynonymous (sin sentido y sin sentido) y el empalme sitio mutaciones somáticas (41 mutaciones por muestra) utilizando VarScan 2 [12] con los criterios predefinidos descritos en los Materiales y Métodos. De estas variantes somáticas, 158 fueron seleccionados al azar y se sometieron a secuenciación de Sanger, y 143 variantes fueron validados con éxito (143/158, 91%). Todos los
TP53
somáticas sitio mutaciones no sinónimas y empalme fueron llamados y validado utilizando VarScan 2 y secuenciación de Sanger, respectivamente. Durante nueve pacientes sin
TP53
somáticas sitio mutaciones no sinónimas y empalme, hemos realizado más secuenciación de Sanger para todos los diez
TP53
exones de codificación, porque falso negativo podría esperarse debido a la actual baja profundidad lee . Se detectó una deleción de cambio de marco en el exón 3 para S022 (Tabla S3). SNVS somáticas y indeles fueron anotados a 1.405 en 1.159 genes.
TP53
fue el más frecuentemente mutado (76%, 26/34) (Figura 1A), sin embargo, la frecuencia de mutación era más bajo que los informes anteriores [5], [27]. Había 24 distinta y diversa
TP53
mutaciones (Tabla S4). Dos pacientes (S066 y S271) comparten la misma variante de cambio de sentido (R273H) y los otros dos pacientes (S009 y S017) para compartir la misma variante sin sentido (R196 *). De los 22
TP53
variantes restantes, cinco eran supresiones marco de la jornada (A86fs para S020, S022 para P27fs, F113fs para S119, S006 para S241fs, y E286fs para S118), uno era una variante sin sentido (Q52 * para S015), dos eran variantes de empalme de sitio (Y126splice para S188 y S008 para S261splice), y el 14 fueron missense restante (Tabla S4). FIS para el
TP53 15
variantes missense fue & gt; 2,0 según MutationAssessor 2 [14] análisis y fueron designados como nocivo (Tabla S4)
(A) somática paisaje mutacional de 34 pacientes. con HGSOC. se muestran mutaciones somáticas identificadas en más de o igual a tres pacientes. Los pacientes con mutaciones del mismo gen se muestran en rojo. paisaje (B) Copia número de alteración de los 30 pacientes con HGSOC. el número de copias (CN) alteraciones se indican como sigue: CN = 0, azul oscuro; CN = 1, azul claro; CN = 3, rosa; y CN = q 4, rojo). línea azul en la pista de eliminación y la línea roja en la frecuencia del número de copia alteración espectáculo pista de amplificación. líneas grises en las vías de eliminación y amplificación muestran los valores de p--log transformado prueba exacta de Fisher de 0,0005.
La segunda genes mutados con mayor frecuencia fueron
BCLAF1
,
CLCNKA
, y
MAGEC1 gratis (29%, 10/34 para cada gen). De acuerdo a FIS determinó a través de MutationAssessor 2, todas las mutaciones a excepción de K911fs
BCLAF1
fueron evaluados como benignos y se consideraron las mutaciones de pasajeros. El noventa y dos por ciento (1,063 /1,159) de los genes fueron mutados en un paciente. Para estudiar más genes mutados conductor cáncer de candidatos en al menos dos pacientes, se aplicó OncodriveFM como se describe en la sección Materiales y Métodos. Sólo
TP53
fue detectado como un gen controlador cáncer con alta acumulación de mutaciones deletéreas en nuestras muestras HGSOC (datos no mostrados).
CNV de perfiles de 30 de las muestras HGSOC 34 se muestra en la figura 1B y del archivo S1. se alteraron los números de copias en todo el genoma de 30 muestras HGSOC. ParseCNV identificado nueve suprimen varias veces CNVRs (1p36.11, 4q24, 5q13.1, 5q13.2, 6q22.33-23.1, 15q24.2-24.3, 17q12, 18q21.31 y 22q12.3) y cuatro amplificada CNVRs (1p34 0,1-33, 3q27.2, 6p24.2, y 10p12.31-12.2) con los genes identificados, respectivamente (Tablas S5 y S6).
la exclusión de los pacientes con problemas de la vía de p53 mutado de TP53 HGSOC
El
TP53
frecuencia de mutación fue significativamente menor en las muestras en comparación con los reportados en estudios anteriores de la siguiente manera: 26/34 vs 301/316; valor de la prueba exacta de Fisher p de 0,0060 [5] y 26/34 vs 118/126; valor de la prueba exacta de Fisher p de 0,0069 [27]. Entre las ocho muestras con no mutado
TP53 gratis (Figura 2A), el análisis CNV mostró pérdida de número de copias de heterocigotos
TP53
para la muestra S004 (Figura 2B). MDM2 es una proteína ligasa de ubiquitina E3 que se dirige a p53 para la degradación proteasomal y se considera un efector negativo de p53 [28]. Existe una asociación entre la amplificación de
MDM2
y pérdida de función de p53 en ciertos tumores [27]. Para las ocho muestras con intacta
TP53
, sin
se observó MDM2
la amplificación del número de copias (Figura 2A). Para investigar más a fondo si representa un mecanismo alternativo para la disfunción p53, se evaluó una lista de genes diana de p53 directa (Tabla S7) obtenidos a partir de la base de datos Camino Interacción (PID) [29]. Se identificaron un
IRF5 gratis (interferón factor regulador 5) mutación del sitio de empalme (W181splice) de la muestra S018. En general, se identificaron seis pacientes p53 vía intactos de los ocho pacientes con HGSOC con no mutado
TP53 gratis (Figura 2A). Se asignó a los pacientes a seis ST1 y ST2 a los restantes.
(A) Resumen de los pacientes con
TP53
mutaciones se muestran en color rosa en el
TP53
pista _mut.
TP53
número de copias heterocigotos supresiones aparecen en azul en la pista
TP53
_Del.
MDM2
la amplificación del número de copias se muestra en rojo en la
MDM2
pista _amp. Las mutaciones en los genes que son blancos directos de p53 se muestran en verde en la pista p53_Target_mut. (B) del gráfico de puntos de tasas de registro R (LRR) de Chr17 para la muestra S004. Los puntos azules indican los valores LRR. La posición de la línea de LRR = 0 se indica como 0 a la derecha de cada gráfica.
TP53 gratis (17p13.1) está indicado por el asterisco azul en la línea vertical.
Las alteraciones genómicas en ST1 y ST2
no detectamos mutaciones en genes específicos para el tipo seroso de bajo grado, como
BRAF
,
CTNNB1
,
KRAS
, y
PIK3CA
[27], entre el 1.159 genes mutados en las muestras HGSOC 34 (datos no mostrados).
Para caracterizar las diferencias en las alteraciones genómicas entre ST1 y ST2, se comparó el número de mutaciones nonsynonymous y empalme sitio somáticas y encontramos que el número de mutaciones somáticas fue ST1 significativamente menor en comparación con ST2 (suma de rangos de valor de la prueba de Wilcoxon p de 0,00070) (Figura 3A).
(A) Comparación del número de mutaciones del sitio de empalme no sinónimas y somáticas. (B) Comparación del número de segmentos de la CNV (panel superior) y los perfiles de la CNV (panel inferior) en los cromosomas 17 y 12 entre ST1 y ST2. alteraciones del número de copias son los siguientes: CN = 0, azul oscuro; CN = 1, azul claro; CN = 3, rosa; y CN = q 4, rojo). ST1 está encerrado por el rectángulo verde. (C) purezas tumorales de ST1 y ST2.
Además, se compararon ST1 y ST2 en relación con el número de segmentos identificados por la CNV PennCNV [17] en cada cromosoma autosómico (Tabla S8). Los resultados de la prueba de Wilcoxon de suma de rangos y corrección de pruebas múltiples de 22 cromosomas autosómicos de acuerdo con la tasa de falso descubrimiento (FDR) [30] mostraron significativamente menos segmentos de la CNV en los cromosomas 17 y 12 (valor q FDR de 0,040 y 0,047, respectivamente) para ST1 (Figura 3B). Estos resultados indican que ST1 mantuvo el cariotipo normal y ST2 albergaba alteraciones del número de copias en todo el genoma particularmente enriquecidas en los cromosomas 17 y 12 (Figura 3B).
Para excluir la posibilidad de que el bajo número de mutaciones y algunos segmentos de la CNV de ST1 eran debido a un alto grado de contaminación con células normales, se evaluó la pureza del tumor como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las purezas promedio de tumor eran 79% y 73% para ST1 y ST2, respectivamente, y no hubo diferencia significativa en la pureza del tumor entre los subtipos (Wilcoxon de suma de rangos de valor de prueba p de 0,48) (Figura 3C y la Tabla S9).
La expresión de genes para caracterizar funcionalmente ST1 y ST2
Los perfiles de expresión génica de ST1 y ST2 fueron determinados utilizando un microarray de ARNm [7], [8]. Ochenta y nueve sondas que representan 70 genes revelaron diferencias en los niveles de expresión entre ST1 y ST2 en un FDR (BH) de & lt; 0,1 (Tablas S10 y S11). Los niveles de expresión de 33 y 37 genes fueron más altos (Tabla S10) e inferior (Tabla S11), respectivamente, para ST1 comparación con el de ST2. Los 70 genes mostraron expresiones relativamente homogéneos y heterogéneos en ST1 y ST2, respectivamente (Figura 4)
Setenta genes (89 sondas) que muestran diferencias en el FDR (BH) de & lt;. 0.1 se muestran. ST1 está encerrado por el rectángulo verde. Alta y Baja indican los niveles de expresión de ST1 ST2 en comparación con.
Para evaluar las consecuencias biológicas y funcionales de la expresión de estos 70 genes, GO análisis se aplicó utilizando DAVID. Treinta y cinco genes se clasifican en 18 grupos que comparten GO GO términos similares (Tabla S12). Dos de los grupos 18 GO (mitosis y ADN helicasa) mostraron un enriquecimiento significativo de genes (puntuación de enriquecimiento de & gt; 1,3) (Figura 5 y Tabla S12).
NEK1
y
NEK9
en el grupo de la mitosis se upregulated y
ASPM
,
BIRC5
,
CDCA2
, y
SKA3
fueron downregulated en ST1 comparación con la de ST2.
BLM
,
PIF1
, y
RECQL4
, que codifican helicasas de ADN, se expresaron en niveles relativamente bajos en ST1. Las diferencias en la expresión de estos genes mitosis y la helicasa de ADN se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, prueba F, y
t-test
con R versión 3.0.2 (Figura 6 y Tabla S13).
vista térmico y del mapa de grupos de genes ontología (GO). Dos grupos de GO (mitosis y la helicasa ADN) con un peso significativo enriquecimiento de genes se indican como GO grupos 1 y 2, respectivamente. ST1 está encerrado por el rectángulo verde.
abeja enjambre y los diagramas de caja muestran el patrón de expresión génica de los pacientes ST1 y ST2. eje Y indica normalizados señales de expresión de genes transformados por GeneSpring. Los asteriscos (*) o el signo más (+) indican
t
valores de p alltests de la siguiente manera: * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y ***
(+++) p & lt; 0.001.
Discusión
Los análisis de mutaciones somáticas de HGSOC mostraron enriquecimiento de
TP53
mutaciones (Figura 1A). El análisis CNV reveló un perfil alterado de el número de copias de todo el genoma (Figura 1B). Estos resultados son consistentes con los de un estudio anterior [5]. Sin embargo, se detectó una diferencia significativa en la frecuencia de
TP53
mutaciones en comparación con lo reportado en los informes anteriores [5], [27]. En concreto, ocho muestras HGSOC no albergaba
TP53
mutaciones, y la mutación de un gen diana de p53
IRF5
fue identificado en una muestra. Además, uno tenía
TP53
número de copias de su eliminación. Tomados en conjunto, se asignó seis muestras HGSOC como ST1 y las 28 muestras restantes como ST2.
Todos los pacientes con HGSOC en este estudio eran japoneses, mientras que los pacientes en los estudios anteriores [5], [27] eran provienen principalmente de las poblaciones de ascendencia europea. La discrepancia de
TP53
frecuencias de mutación puede provenir de las diferencias poblacionales como se observa en el caso del receptor del factor de crecimiento epidérmico (
EGFR)
mutaciones para los cánceres de pulmón no microcítico de células [31], [ ,,,0],32].
EGFR
tasas de mutación fueron los siguientes: el 11% y el 32% de los pacientes y del Este, Asia y Europa Occidental, respectivamente [31], y el 2% y el 26% de los pacientes en EE.UU. y Japón, respectivamente [32] . El bajo número de pacientes en el estudio actual en comparación con los datos del TCGA establecidos [5] puede que no lo suficiente como para proporcionar una conclusión sólida del TP53
frecuencia de mutación. Evidentemente, se necesita un estudio mucho mayor escala que incluye pacientes asiáticos japoneses y otros con HGSOC. La otra posibilidad es la existencia de pequeña fracción de
TP53 mutado
células tumorales debido a la heterogeneidad del tumor en los
TP53
pacientes no mutadas. Es ampliamente aceptado que las mutaciones somáticas conductor tales como mutaciones de
TP53
se producen en un evento temprano de cáncer de a continuación, se deben observar relativamente alta frecuencia de la mutación. En el presente estudio, se observó de hecho al menos el 20% de las frecuencias variantes tumorales para
TP53
. Por lo tanto, presumiblemente no pasó por alto mutaciones del conductor de
TP53 fotos: por la secuenciación del exoma (Figura 1).
El bajo número de mutaciones somáticas y segmentos de la CNV observados en ST1 probablemente reflejan una p53 funcionalmente intacta camino. ST2 fue enriquecido por
TP53
mutaciones, y los perfiles de número de copias en todo el genoma eran similares a las de los tumores de tipo II. Por el contrario,
TP53
fue mutado en ST1 y mostraron un cariotipo normal similar a la de los tumores de tipo I tal como se propone en un comentario anterior [2]. Sin embargo, no se detectaron mutaciones en los genes que codifican componentes de la vía de señalización RAS en ST1 (datos no mostrados). En el conjunto de datos más grande del TCGA [5], 15 de 316 muestras de pacientes con HGSOC albergaban no mutado
TP53
. Cuando se realizaron búsquedas de
TP53
supresiones,
MDM2
amplificación, o mutaciones meta-gen p53 en las 15 muestras, sólo uno (TCGA-25-1328) fue clasificado como ST1 (Figura S1) . La agrupación jerárquica utilizando 45 superposición de genes entre los 70 genes expresados diferencialmente asignados TCGA-25-1328 para ST1 (Figura S1, abajo). Estos resultados implican que ST1 es un nuevo subtipo HGSOC basado en perfiles de mutación y de la CNV.
Para caracterizar mejor las características funcionales de ST1 y ST2, se compararon sus perfiles de expresión génica (Figura 4). El uso de un umbral de significación [FDR (BH) & lt; 0,1], se identificaron 70 genes que se expresan de manera homogénea en el microarray ST1 y heterogéneamente expresan en el microarray ST2 (Figura 4). La expresión génica heterogéneo de ST2 puede indicar la diversificación de los subtipos moleculares como eventos secundarios como se propone en la revisión antes citada [2], y la expresión génica homogénea de ST1 puede reflejar un evento temprano de la oncogénesis antes de que ocurra la inestabilidad de la cromatina.
GO análisis identificó 18 GO grupos que comparten términos biológicos muy similares, y dos grupos fueron significativamente enriquecido para los genes implicados en la mitosis y los que codifican helicasas de ADN (Figuras 5 y 6). Los defectos en la mitosis conducen a números de cromosomas anormales que se asocian con la oncogénesis [33]. Dos genes que codifican las quinasas mitóticas NEK1 y NEK9 fueron altamente expresado en ST1, y la regulación positiva de estas quinasas se asocia con la estabilidad genómica y la tumorigénesis [34] - [37]. Por otra parte, otros genes mitótico (
ASPM
,
BIRC5
,
CDCA2
, y
SKA3
) fueron altamente expresado en ST2, y la activación aberrante de la expresión de estos genes se asocia con la oncogénesis [5], [38] - [42]
DNA helicases mantener la estabilidad del genoma a través de la reparación del ADN, la recombinación y la replicación.. Las helicasas, BML y RECQL4, se inactivan en los trastornos genéticos propensas cáncer como Bloom y síndromes de Rothmund-Thomson [43], [44]. La regulación positiva de la expresión de ADN helicasa ocurre comúnmente en varios tipos de cáncer (por ejemplo, hematopoyético, de próstata, y hepatocelulares) [43] - [48]. elevada expresión de los genes de ADN helicasa
BLM
,
PIF1
, y
RECQL4
que se observa generalmente en los cánceres puede explicar una función de recuperación de la inestabilidad de la cromatina en ST2. Por el contrario, la disminución de la expresión de genes que codifican helicasas de ADN que caracteriza ST1 indica que la inestabilidad de la cromatina no se produce en ST1. Se requieren más investigaciones para aclarar la relación entre la expresión de estos genes y la patogénesis de la HGSOC.
No se detectan diferencias en la supervivencia global o libre de progresión de pacientes clasificados como sea ST1 o ST2 (Figura S2). Todas las muestras fueron diagnosticados como cáncer de alto grado por los patólogos, y las muestras clasificadas como ST1 se examinaron de forma retrospectiva; sin embargo, carecían de características patológicas únicas. ST1 se caracterizó por una vía p53 intacta; Sin embargo, no hubo diferencias en los hallazgos patológicos del paciente o las consecuencias clínicas. Estos resultados sugieren la presencia de procesos biológicos no identificados implicados en el fenotipo ST1, lo que indica que una terapia más eficaz debe ser desarrollado para estos pacientes.
En resumen, se describe la identificación de un nuevo subtipo de vía de p53 intacta en japonés pacientes con HGSOC. Nuestros hallazgos prometen mejorar nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la oncogénesis y deben facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas que se dirigen no mutado
TP53 Hoteles en pacientes con HGSOC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
ST1 en los datos del TCGA. (Panel superior) Resumen de las mutaciones de
TP53
y vía de p53 genes para 15
TP53
pacientes no mutados con HGSOC en los datos del TCGA.
TP53
deleción homocigótica se muestra en las supresiones número de copias azules y heterocigotos oscuras aparecen en azul en la luz
TP53
_Del pista.
MDM2
la amplificación del número de copias se muestra en rojo en la
MDM2
pista _amp. Las mutaciones en los genes que son blancos directos de p53 se muestran en verde en la pista p53_Target_mut. (Panel inferior) La agrupación jerárquica de TCGA-25 hasta 1328 y el 33 HGSOC usando 45 genes superpuestos entre los 70 genes expresados diferencialmente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s001 gratis (PDF)
figura S2.
análisis de supervivencia. (Panel izquierdo) curvas de supervivencia general para ST1 y ST2. (Panel derecho) curvas de supervivencia libre de progresión para ST1 y ST2. Estas curvas de supervivencia fueron representados por el método de Kaplan-Meier. valores p corresponden a la prueba Logrank comparar las curvas de supervivencia
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s002 gratis (PDF) sobre Table S1.
datos clínicos. pT- y FIGO-etapas. Dos subtipos (ST1 y ST2) se muestran en la columna Subtipo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s003 gratis (XLSX)
Tabla S2.
profundidad y cobertura de la secuenciación del exoma. La profundidad y la cobertura se calcularon utilizando el módulo de DepthOfCoverage GATK
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s004 gratis (XLS) sobre Table S3.
Profundidad de los exones de codificación de
TP53
profundidad de diez exones de codificación de
TP53 gratis (NM_001126112.2) se calcularon utilizando SAMtools
doi:.. 10.1371 /journal.pone. 0114491.s005 gratis (XLSX) sobre Table S4.
somática
TP53
mutaciones. impactos funcionales de missense variantes de nucleótido único que se evaluaron utilizando MutationAssessor 2 se muestran en la columna de la FIS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s006 gratis (XLS) sobre Table S5. número
Copia regiones eliminado. regiones suprimidas número de copias que se repite se muestran en la columna CNVR (hg18). columna génica muestra los genes que se encuentran en estos CNVRs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s007 gratis (PDF) sobre Table S6. número
Copia regiones amplificado.