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PLOS ONE: Comparación de los microARN secuenciación profunda de Matched fijado en formol e incluido en parafina y fresco congelado cáncer Tissues

2014/8/23


Extracto

Los microARN regulan varios aspectos de la tumorigénesis y la progresión del cáncer. La mayoría de los tejidos de cáncer se archivan fijado en formol y embebidos en parafina (FFPE). Mientras que los microRNAs son una forma más estable de ARN pensado para soportar FFPE-procesamiento y la degradación sólo hay evidencia limitada de la última hipótesis. Hemos examinado si los perfiles de microARN puede llevar a cabo con éxito el cáncer de los tejidos FFPE utilizando secuenciación basada ligadura sólido. los tiempos de almacenamiento de tejidos (2-9 años) parecían no afecta al número de microRNAs detectados en muestras FFPE en comparación con diferentes muestras congeladas (prueba t pareada p & gt; 0,7). Las correlaciones de los valores de expresión de microARN eran muy altas en todos los microRNAs en una muestra dada (r de Pearson = 0,71-0,95). Mayor varianza de los valores de expresión entre las muestras se asoció con mayores coeficientes de correlación entre FFPE y tejidos congelados. Una de las muestras FFPE en este estudio fue degradado por razones desconocidas con una longitud de leer pico de 17 nucleótidos en comparación con 21 en todas las otras muestras. El número de microRNAs detectados en esta muestra estaba dentro de la gama de microRNAs detectados en todas las otras muestras. basados ​​en microARN ligadura de secuenciación profunda en los tejidos de cáncer FFPE es factible y la degradación del ARN en la medida observada en nuestro estudio parece no afectar al número de micro ARN que pueden ser cuantificadas

Visto:. Meng W, McElroy JP, Volinia S, Palatini J, Warner S, Ayers LW, et al. (2013) Comparación de los microARN secuenciación profunda de Matched fijado en formol e incluido en parafina y Cáncer fresco congelado tejidos. PLoS ONE 8 (5): e64393. doi: 10.1371 /journal.pone.0064393

Editor: Soheil S. Dadras, Universidad de Connecticut Health Center, Estados Unidos de América

Recibido: 2 Enero, 2013; Aceptado: April 13, 2013; Publicado: 16 de mayo de 2013

Derechos de Autor © 2013 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento de Oncología de Radiación y el Centro Integral del cáncer, y, por el Bioestadística Core y por microarrays recurso compartido en la Universidad Estatal de Ohio. El trabajo fue apoyado por número de otorgamiento de subsidio 8UL1TR000090-05 del Centro Nacional para el Avance de Ciencias de transferencia. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial del Centro Nacional para el Avance de Ciencias de transferencia o los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Los microARN son pequeños ARN no codificantes con una longitud de 22 a 26 nucleótidos (nt). MicroARNs dan como resultado la degradación del ARN mensajero complementario en muchas especies. MicroARNs juegan un papel importante en el desarrollo celular, la muerte celular, la proliferación celular [1], la apoptosis [2] y la angiogénesis [3]. El método de perfiles de expresión de microARN de citometría de flujo basado en perlas pionero reveló que los perfiles de microARN reflejan el linaje de desarrollo y diferenciación de los tumores [4]. tejidos y tejidos de cáncer de lo normal se demostró la presencia de perfiles de expresión característicos y perfiles de microARN puede describir vías de microARN impulsada en tumores sólidos [5]

Los métodos actuales para la cuantificación de microARN son:. reversa en tiempo real PCR de transcripción [ ,,,0],6], [7], microarrays [8], Nanostring, y al lado de secuenciación de nueva generación [9] - [11]. Especialmente, las tecnologías de secuenciación de nueva generación recientemente desarrollados tienen el potencial de descubrir nuevos microRNAs y otros ARN pequeños. La mayoría de los tejidos tratados en el ámbito de la atención sanitaria se someterán a formalina fijación y de inclusión en parafina (FFPE). La mayoría de los ensayos clínicos llevados a cabo en los laboratorios de patología están optimizados para los tejidos FFPE. tejidos FFPE se almacenan típicamente a temperatura ambiente. Formalina conserva muestras de tejido mediante la creación de la reticulación entre las proteínas, el ADN y el ARN. ADN extraído a partir de tejido FFPE ha demostrado ser útil para el análisis del número de copias y el análisis de mutaciones en al menos una plataforma en algunos lugares [12]. Sin embargo, la modificación química entre macromoléculas y ARN causada por la fijación con formalina puede acelerar la degradación del RNA [13] [14]. La estabilidad de microRNAs es generalmente mucho más robusto que el ARN mensajero [15]. Análisis de la expresión de microARN basado en la secuenciación de próxima generación se ha desarrollado en varias plataformas, incluyendo Roche /454 plataforma, Genoma Analizador de Illumina y sólida plataforma de ABI [16] [17], y diferentes protocolos comerciales para miARN preparación de la biblioteca han sido desarrollados por las tres empresas [ ,,,0],18]. Actualmente no hay pruebas de que sólo se limita a disposición resultados de la secuenciación microARN son fiables y válidos. Ma et al. demostrado la viabilidad de miARN perfiles basados ​​en secuenciación de Sanger en el tejido archivado 10 años de edad [19]. Por lo que sabemos que sólo hay dos estudios revisados ​​por pares publicados que compararon los resultados de secuenciación de muestras congeladas microARN y FFPE emparejados utilizando la plataforma Illumina [9], [20]. El objetivo de este estudio fue determinar si las muestras FFPE se pueden caracterizar con éxito mediante la secuenciación de los genes miARN profunda. Con este fin se analizaron correspondía con los tejidos congelados y FFPE de diferentes histologías para los cuales se dispone de información detallada procesamiento y almacenamiento.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Humanos muestras de tejidos malignos adquirido durante el período 2003-2009 se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN /NCI), División del Medio Oeste, que está financiado por el Instituto Nacional del cáncer, en base a una junta de revisión interna (IRB) aprobó el protocolo de investigación (sujetos Humanos de la Universidad del Estado de Ohio Protocolo - 2011E0377). Otros investigadores pueden haber recibido las muestras de los mismos temas.

Las muestras de tejido

se recibieron ocho muestras de tejidos malignos humanos pareadas. tejidos quirúrgicos remanentes se tomaron después muestras de diagnóstico fueron aseguradas de los pacientes (cinco machos y cuatro hembras, edad media 58 años, rango 39-78 años) con carcinoma ductal infiltrante de mama (2), el carcinoma renal de células claras (2), adenocarcinoma de pulmón ( 1), adenocarcinoma de próstata (1), melanoma metastásico (1), y el sarcoma de muslo (1). Las muestras quirúrgicas fueron transportados desde las salas de operaciones, la obtención de tejidos examinados bajo la supervisión de un patólogo y conservados dentro de 5 a 57 minutas. muestras de tejidos emparejados seleccionados para la investigación, ya sea inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se colocan en un congelador -80 ° C para el almacenamiento supervisado o fijados en formalina al 10% durante 24 horas y luego se procesan en un bloque de parafina embebido y se almacenan en la sala temperatura. Cuando se recibieron las muestras de investigación de CHTN, las muestras codificadas fueron acompañados por un informe de anatomía patológica definitiva codificado y un informe de evaluación de la calidad de verificar la acumulación de tejido tumoral. Las muestras han sido revisados ​​por un patólogo y 4 casos de tumores% tenía 100, 3 casos 90-95% y 50-60% 1 caso de tumores, y FFPE emparejado y muestras congeladas fueron generalmente comparables en contenido y tamaño del tumor. Las características clínico-patológicas de los casos utilizados para microARN secuenciación y análisis de expresión se enumeran en la tabla 1.

Aislamiento de RNA, cuantificación y evaluación de la calidad

ARN de las muestras FFPE fueron extraídos utilizando Recuperar Todo kit de aislamiento de ácido nucleico total (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Brevemente, muestras de 5-10 mg se cortaron a partir de bloques de parafina y deparaffinizated por xileno a 50 ° C, seguido de lavado con etanol 100%. Las muestras de tejido de secado al aire se digirieron por proteinasa K durante 24 horas en un incubador de agitación microtubo fijado en 50 ° C. Las muestras digeridas se mezclaron con un volumen adecuado de aditivo aislamiento y 100% de etanol. Después de pasar la mezcla a través del cartucho de filtro, el ADN y el ARN fueron retenidas en el filtro. El ADN se eliminó mediante el filtro de la digestión con DNasa. El ARN se purificó por tampón de lavado y se eluyó con agua libre de nucleasa.

Las muestras de microARN de las muestras congeladas frescas se obtuvieron mediante PureLink ™ miARN Kit de aislamiento (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Brevemente, 5 mg frescas muestras de tejido congeladas se mezclaron con 300 l de tampón de unión (L3) y se homogeneizaron usando homogeneizador de tejidos. Las muestras homogeneizadas se centrifugaron, y el sobrenadante se mezclaron con 300 l 70% de etanol. La solución que contiene el ARN se purificó mediante dos rondas de columnas de centrifugación de limpieza. El ARN se eluyó con 50 a 100 l de agua estéril libre de RNasa

MicroARN secuenciación

pequeños RNAs de FFPE y muestras congeladas frescas se prepararon para la secuenciación sólida como sigue:. Las muestras de ARN total fueron procesada por el fraccionador flashPAGE (Ambion) y flashPAGE Clean-Up Kit (Ambion). El ARN pequeño enriquecido se procesó de acuerdo con el protocolo del kit de RNA de expresión a pequeña sólido (Applied Biosystems). Los pequeños RNAs purificados se ligaron con 5 'y 3' de la mezcla adaptador utilizando ARN ligasa. Los productos ligados (40-60 bases de longitud) fueron transcritas inversa y se purificó en gel Novex 10% TBE-urea. Posteriormente, 15-18 ciclos de PCR se llevaron a cabo mediante la amplificación del ADNc purificado con código de barras conjuntos de cebadores de PCR proporcionados en el kit, que difiere por una secuencia de 6 nucleótidos única. Los productos amplificados se cargaron en gel Novex 6% TBE (Invitrogen) y las bandas de gel que contienen 110 a 130 bp fragmentos fueron extirpados. Los productos amplificados se una vez purificada de la banda de gel escindido, amplificado por PCR en emulsión, a continuación, cargado en el sistema de secuenciación de Applied Biosystems SóLIdAS 4 siguiente generación de alto rendimiento para la adquisición de datos. La calidad de las muestras y las bibliotecas se verificaron en la Agilent Bioanalyzer [21], [22]. Los datos de secuenciación SOLiD primas se han subido a Gene Expression Omnibus del NCBI y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE45740 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45740).

RT-qPCR para la validación de microARN

El ARN de tejidos congelados y frescos FFPE fueron validados por el tiempo real (RT) PCR cuantitativa. la expresión de microARN se normalizó a la pequeña U6 ARN nuclear utilizando kits de ensayo TaqMan microARN (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Una muestra de 30 ng de ARN se procesó mediante el kit TaqMan MicroARN transcripción reversa (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). En resumen, 5 RNA l se mezcló con 1 mmol /l de cada desoxirribonucleótido trifosfato, 50 unidades de Multiscribe transcriptasa inversa, 5 × tampones de reacción, 4 unidades de inhibidor de RNasa, y 5 × gen específico RT mezcla cebadores en un volumen final de reacción de 15 l. Las reacciones se incubaron a continuación a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, 85 ° C durante 15 min con un mantenimiento final a 4 ° C. Después, 15 l de la solución de ADNc se diluyó con agua libre de nucleasa a un volumen final de 100 l. Cuantitativa PCR se llevó a cabo en una máquina de 7900 HT PCR con paso de desnaturalización a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de una etapa de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos, y una etapa de hibridación /alargamiento a 60 ° C durante 60 segundos . Doble cambio de micro ARN en muestras de tejido y se calcularon usando la ecuación 2-? Ct de ensayo /control de 2? Ct.

Análisis de los datos

Las secuencias de unión de las bibliotecas pequeñas de ARN se eliminan con el software cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/) bajo los parámetros por defecto. La distribución de la longitud de microARN fue construido por el trazado lee cargos en contra de 0-30 longitudes de nucleótidos. La pequeña herramienta de análisis de tuberías ARN de Applied Biosystems fue utilizado con los siguientes parámetros para incluir sólo una calidad suficientemente alta lee en nuestro estudio: 1) Umbral de la calidad de lectura media mínima fue de 20 (se calcula el valor QV utilizando una puntuación de Phred como q = -10 × log10 (p) donde q es el valor de la calidad y (p) es la probabilidad predicha de que la llamada de colores es incorrecto.), 2) ser rigurosos permitimos que sólo el 1 desajuste entre las lecturas y miRBase versión de 16 golpes para cada contados leer 3 ) la longitud mínima de alineado lee tenía que ser 17 bases. Los datos se normalizaron como se lee por millón (RPM). Se consideraron las secuencias con expresión de valor inferior a 5 RPM no se detecta por la correlación entre la parte de análisis congelado y FFPE

Resultados

Efectos de FFPE degradación de la muestra:. microARN leen longitud distribución

la fijación en formol y largo almacenamiento veces son conocidos por dar lugar a la degradación del ARN [23]. Esta degradación resulta en una longitud más corta de ARN promedio [24]. Para identificar los posibles efectos de la degradación de los microARN, se analizó la distribución de la longitud de lectura de muestras de tejido de cáncer congeladas y frescas FFPE emparejados. Después se recortaron las secuencias 3 'del adaptador de cada lectura, la secuencia lee distribución de longitud fue examinado (figura 1). Se observaron leer longitudes estar centrado en el 21 nt en todas las muestras congeladas y todos menos uno muestras FFPE. Hubo una muestra FFPE cuya longitud microARN pico se encontró a los 17 nt, lo que indica una degradación significativa. A continuación, examinó cuidadosamente los pequeños ARN perfiles de clasificación y correlación de los valores de expresión de microARN de las muestras congeladas y frescas FFPE. Hemos encontrado que hay son insignificantes o ningún efecto sobre esos análisis. Los tiempos de almacenamiento o los métodos de preparación no fueron diferentes entre esta muestra FFPE degradado y las otras muestras analizadas en este estudio. Además, la proporción de ARN pequeños en el intervalo de 20 a 22 nt fue menor para varios casos en el FFPE en comparación con los especímenes emparejados congelados (un caso de carcinoma de células renales, el caso de adenocarcinoma de pulmón, y el caso del cáncer de próstata). Esto también es probable debido a la degradación en muestras FFPE, aunque pequeñas variaciones durante la preparación de la biblioteca podrían contribuir en parte a las diferencias observadas

Efectos de FFPE degradación de la muestra:. Almacenamiento de Tiempo,
La tiempo de almacenamiento de las muestras varió de 2 a 9 años. 624 micoRNAs y sus precursores fueron identificados en los 8 pares de muestras de tejido. Algunos microRNAs no podría ser detectada en cualquiera de las muestras congeladas o frescas FFPE. La Figura 2 muestra los porcentajes de microARN que fueron detectados en ambas muestras congeladas y frescas FFPE, sólo en muestras frescas congeladas y sólo en muestras FFPE durante el año de recogida de muestras. No hubo cambios almacenamiento dependientes del tiempo en esos porcentajes, lo que indica que no existe una asociación significativa entre el tiempo de almacenamiento y el número de micro ARN presentes durante esta ventana de tiempo de 9 años.

A continuación examinó el porcentaje de microARN lee entre Total de Lecturas (figura 3) para comprender si la pureza de microRNAs se redujo en las muestras FFPE. Aproximadamente el 70% y el 85% de lecturas en muestras de FFPE y congelados, respectivamente, fueron identificados como secuencias de microARN. Una posible razón de esta diferencia podría ser la presencia de fragmentos de ARNm lncRNAs y en la fracción más pequeña de ARN de 40 nucleótidos (nt) de los tejidos FFPE (figura 4).


Efectos de FFPE degradación de la muestra: clasificación de los pequeños ARN

Para entender mejor si la diferencia en el porcentaje de pequeñas secuencias de ARN entre todas las lecturas entre los datos de tejido congelado y FFPE examinamos la distribución de las clases de ARN en una de la muestra de cáncer de mama . Hubo un total de 11.563.414 y 10.273.837 lecturas de secuenciación, en el dos analizaron diferentes muestras y las lecturas fueron asignadas a las del genoma humano (hg19, Centro Nacional de la construcción de la Información Biotecnológica) utilizando scripts de Python personalizado. El lecturas fueron clasificados en diferentes grupos de ARN de acuerdo con la base de datos Ensembl. La mayoría de los pequeños ARN en ambas bibliotecas congeladas y frescas FFPE fueron microARN (figura 4). La comparación de los datos de las muestras congeladas frescas coincidentes con los datos de las muestras FFPE había lincRNA y secuencias de clases desconocidas en los datos obtenidos a partir de muestras FFPE. Teniendo en cuenta que sólo los ARN pequeños que se extrajeron 40 nt y procesados ​​para su secuenciación esto sugiere que hay una fragmentación de lincRNA ARN y otra larga en los tejidos FFPE, que son más de 40 nt.

Un total de 469 a la 548 ( significaría 519) diferentes microRNAs y sus precursores fueron identificados en ambas muestras congeladas y frescas FFPE. Se determinó el porcentaje de microARN que tienen más de un 2 veces la diferencia de expresión entre las muestras congeladas y frescas FFPE emparejados (figura 5). Entre los diferentes casos, de 69 a 145 transcripciones de microARN eran más de 2 veces sobreexpresado en muestras frescas congeladas. De 73 a 186 transcripciones de microARN fueron más de 2 veces sobreexpresa en los tejidos FFPE (figura 5).

La correlación de los valores de expresión de microARN de FFPE emparejado y muestras congeladas

Se determinó la correlación próxima de los valores de expresión de microARN de FFPE muestras emparejadas y muestras frescas congeladas. Había 250 microRNAs detectados en todas las muestras en este estudio. Hubo una fuerte correlación de los valores de expresión de microARN en FFPE emparejado y encaje tejidos congelados frescos a través de todos los microARN y todos los casos (r = 0,85; Figura 6). Correlaciones entre los microARN detectados desde el mismo tumor /paciente eran altas, con r que van desde 0,71-0,95 (figura 7) [25].

Sólo se utilizaron los 250 MIR que no tienen datos que faltan.


Cada punto representa los valores de expresión de microARN uno en un par fresco congelado-FFPE.

La media de los coeficientes de correlación de Pearson de los valores de expresión de microARN individuales de FFPE y tejidos congelados fue de 0,46 (figura 8), con sólo 41 microRNAs maduros y precursores que tienen coeficientes de correlación más altos que 0,8 (tabla 2). Nos buscó para identificar las características que se asocian con los coeficientes de correlación más altos indican invariancia el método de preservación del tejido. Para probar si el nivel de expresión de un microRNA dada está asociada con la correlación entre el tejido congelado y fresco FFPE, Fisher transformado (arctanh) correlaciones se retrocedido en la expresión media de FFPE (figura 9). No hubo asociación entre los valores de expresión y las correlaciones entre los datos a partir de tejido congelado y FFPE observado. Luego trató a entender si una posible falta de variación de microRNAs individuales entre las repeticiones biológica está dando lugar a correlaciones pobres. Fisher transforma correlaciones se retrocedido en log transformado FFPE varianzas. El análisis de varianza mostró que microRNAs con mayor varianza tienen significativamente más altas correlaciones de datos de FFPE y tejidos congelados (figura 10; arctanh (r) = 0,47 + 0,59 × log10 (varianza FFPE)), que puede ser debido a la presencia de cierto biológica variación presente en estos microRNAs.


validación de PCR de la expresión de microARN

Hemos seleccionado dos microARN (miR-21 y miR-19a) que eran expresado mayor en las muestras congeladas que en las muestras FFPE en nuestros resultados de la secuenciación de microARN para la validación mediante PCR (TaqMan). Tanto el miR-21 y miR-19a se encontró que también será mayor expresado en tejido congelado que en las muestras FFPE emparejados utilizando un ensayo de PCR (figura 11), en consonancia con nuestros resultados de la secuenciación.

Las muestras de ARN a partir de fresco congelado ( n = 8) y FFPE (n = 8) se analizaron tejidos. U6 pequeños ARN nucleares se utilizó como referencia. MiR-21 y miR-19a tuvieron mayor expresión en las muestras congeladas frescas que en las muestras FFPE, consistente con los resultados de secuenciación.

Discusión

Los microARN como reguladores de la expresión de genes parecen tener un importante papel en la diferenciación de células de cáncer [4], la proliferación [26], metástasis [27] y la apoptosis [28]. Se han realizado muchos esfuerzos Perfiles de microARN utilizando tejidos de cáncer congelados [29] [30] [31]. muestras de tejido de cáncer suelen ser archivados después de la fijación en formol e inclusión en parafina (FFPE) y tejido congelado está disponible sólo para una minoría de casos en los archivos de patología y los bancos de tejidos. Una mejor comprensión de la calidad de microARN resultados de la secuenciación de los tejidos FFPE permitiría una decisión más informada en cuanto a cuando el uso de tejido FFPE para pequeños experimentos de secuenciación de ARN sería apropiado
.
En este estudio, se analizaron los pequeños ARN perfiles de secuenciación de ocho pares de muestras congeladas y frescas FFPE coincidentes de tejido de cáncer utilizando el sólido plataforma ABI 4. El tiempo de almacenamiento de hasta nueve años parecía no afectar el número de micro ARN detectables en bien congelado de tejido FFPE en este estudio. La presencia de porcentajes más altos de los no microRNAs en la fracción de los nucleótidos más pequeña que 40 nt sugerido que los tejidos FFPE son más degradada, sin embargo. Sin embargo, esta degradación aparente no se tradujo en un menor número de microRNAs su detección en los tejidos FFPE, lo que sugiere que un enfoque de secuenciación puede superar la degradación de la muestra en algún grado. Mientras que los pequeños RNAs en una de las ocho muestras FFPE parecían degradados como se sugiere por las longitudes de lectura reducidos centradas a 17 nt en comparación con los otros ocho FFPE y las ocho muestras congeladas centradas a 21 nt, el número de alineado lee y el número de microRNAs detectado esta muestra degradada fueron similares a los datos de otras muestras, lo que sugiere que no necesariamente tienen que ser eliminado de todos los tipos de análisis de los datos obtenidos de las muestras con el grado de degradación se ha descrito anteriormente.

En general, hubo una excelente correlación entre los valores de expresión de los genes miARN entre FFPE congelado y emparejado al combinar todas las muestras y todos los microARN (fig. 6), o cuando se analizan todos los microARNs dentro de pares de muestras de pacientes individuales (Fig. 7). Esos resultados se consistían con los informes anteriores utilizando diferentes plataformas de secuenciación que sugieren que los enfoques de secuenciación puede resultar en una buena correlación de FFPE muestras congeladas y si se incluyen varios cientos de microRNAs [32] [33] [9] [34].

Las correlaciones de los valores de expresión de microRNAs individuales (ver figs. 8, 9, 10) fueron inferiores a las correlaciones entre ellos todos los microARN (figuras 6, 7). La razón subyacente de esta observación probablemente se origina en la asociación identificada de los coeficientes de correlación de microARN individuales y varianza de los valores de expresión de microARN (figura 10). los valores de expresión muy similar de un microRNA individuales entre los ocho casos (igual a baja varianza en la fig. 10) típicamente resultan en bajos coeficientes de correlación debido a que la variación entre los datos congelado y FFPE es mayor que la variación de la expresión entre los ocho casos incluidos en este estudiar. Por lo tanto, no es necesariamente sorprendente tener una amplia distribución de correlaciones de microARN individuales como se analiza en detalle en las figuras 8, 9 y 10.

Las limitaciones de este análisis incluyen el tamaño pequeño de la muestra y los posibles derivas de PCR y PCR limitado sesgos de selección durante la amplificación en el múltiplex de construcción de bibliotecas basado en la PCR [35] [36]. Esta desventaja debe ser superada por la 3
generación rd de la tecnología de secuenciación, que se cree que no requiere la amplificación de la secuencia diana más, pero detectar moléculas de ácido nucleico individuales [37]. Además, el uso de tejido adyacentes para crear muestras coincidentes para este análisis presenta algunos efectos heterogeneidad del tejido y probablemente contribuye a las diferencias observadas entre las muestras congeladas y FFPE emparejados. En resumen, microARN secuenciación de los tejidos FFPE es factible el uso de la secuenciación basada en la ligadura y los valores de expresión de microARN de pacientes individuales están altamente correlacionados con los datos de expresión de tejidos congelados emparejados. Los microARN con mayor varianza parecen tener una mayor correlación de sus valores de expresión en los datos de tejido congelado y FFPE emparejados.

Reconocimientos

Agradecemos Carlo M. Croce útil para los debates.

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