Extracto
Las actividades anti-proliferativos de los veinticinco fármacos inhibidores de quinasa dirigidos que están en uso clínico se midieron en dos paneles de ensayo grandes: (1) un panel de ensayos de proliferación de cuarenta y cuatro humana líneas celulares de cáncer de orígenes diversos tejidos tumorales; y (2) un panel de ensayos de actividad enzimática más de 300 quinasa. Este estudio proporciona una cabeza-en la comparación de todos los fármacos inhibidores de la quinasa en uso (estado de Nov. de 2013), y en seis de estos fármacos, la primera kinome perfiles de datos de dominio público. La correlación de las actividades de la droga con mutaciones del gen del cáncer reveló nuevos marcadores de sensibilidad a los fármacos, lo que sugiere que los cánceres dependientes de mutante
CTNNB1
responderán a trametinib y otros inhibidores de MEK, y cánceres dependientes de
SMAD4
de molécula pequeña Los fármacos inhibidores de EGFR. La comparación de las eficacias de orientación celulares revela los inhibidores más específicos para EGFR, ABL1 y BRAF (V600E) impulsada por el crecimiento celular, y demuestra que los agentes mejor dirigidos combinan una alta potencia bioquímica con una buena selectividad. Para inhibidores de ABL1, que computacionalmente deducir optimizado perfiles quinasa para su uso en una nueva generación de fármacos. Nuestro estudio demuestra el poder de la combinación de datos de perfiles bioquímicos y celulares en la evaluación de la acción del fármaco inhibidor de quinasa
Visto:. Uitdehaag JCM, de Roos JADM, van Doornmalen AM, Prinsen MBW, De Man J, Tanizawa Y, et al. (2014) Comparación de la focalización gen del cáncer y bioquímicos selectividades de los inhibidores de la quinasa de mira aprobado para uso clínico. PLoS ONE 9 (3): e92146. doi: 10.1371 /journal.pone.0092146
Editor: G. Yiqun Shellman, Universidad de Colorado, Escuela de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de diciembre de 2013; Aceptado: February 17, 2014; Publicado: 20 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Uitdehaag et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Oficina de Innovación (Agentschap NL) del Ministerio de Economía de los Países Bajos (INT 111 039). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. RB y GZ son fundadores y accionistas de Holanda traslacional Centro de Investigación B.V. (NTRC). KY es uno de los fundadores de Carna Biosciences, Inc. (Carna). KY y YK son accionistas de Carna. El cáncer de perfiles línea celular descrito se ofrece como un servicio comercial por NTRC bajo las Oncolines de marca. El perfil bioquímico quinasa descrito se ofrece como un servicio comercial por Carna bajo la marca QuickScout. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las terapias dirigidas a aumentar significativamente la eficiencia de la terapia del cáncer. Aportan gran beneficio para los pacientes ya que mejoran las tasas de supervivencia con mucho menos efectos secundarios que las terapias citotóxicas tradicionales. inhibidores de molécula pequeña de las proteínas quinasas son un buen ejemplo del éxito de la terapia dirigida. Actualmente hay (Nov. 2013) veinticinco fármacos inhibidores de la quinasa aprobados para uso clínico, todos excepto dos de cáncer (Tabla 1 y Figura 1). En 2012 las proteínas quinasas fueron los más exitosos clase de objetivo único, basado en el número de nuevos medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA) y esta tendencia continuó en 2013 [1]. Sin embargo, dado el alto desgaste de los fármacos candidatos, los beneficios de supervivencia limitado de terapias de primera generación, el problema de la resistencia a los medicamentos y el hecho de que la terapia dirigida sólo es de beneficio para una pequeña fracción de pacientes con cáncer, hay una necesidad de nuevos y mejorados inhibidores de quinasas específicas.
Todos son inhibidores de la quinasa que fueron aprobados para uso clínico en noviembre de 2013.
es crucial para el desarrollo de terapias dirigidas es la capacidad de la droga pareja respuesta a un marcador genético tal como mutación, translocación o sobreexpresión de un gen del cáncer [2]. A pesar de que hay más de 500 quinasas codificadas por el genoma humano, fármacos inhibidores de la quinasa actuales aprobados actúan principalmente a través de sólo unos diez objetivos diferentes (Tabla 1 y Tabla S1). La mayoría de los inhibidores de la quinasa para acto oncología mediante la inhibición de proliferación de células tumorales, la angiogénesis, o ambos [3]. Por lo tanto, se necesitan biomarcadores sensibilidad a los fármacos para apoyar el desarrollo de nuevas terapias dirigidas y para ampliar la utilidad de las terapias contra el cáncer comercializados.
Para predecir mejor las poblaciones de pacientes que responden en una etapa temprana en el desarrollo de fármacos, y para comprender mejor la acción del fármaco quinasa, hemos establecido un panel de línea celular de cáncer de cuarenta y cuatro líneas celulares que han sido derivadas de una amplia diversidad de tumores humanos (Figura 2A). Las mutaciones en el gen del cáncer que impulsan el fenotipo canceroso de la mayoría de las líneas celulares se han caracterizado en el proyecto Líneas Celulares cósmicos (CCL) [4]. Nuestro panel contiene representantes de todos los oncogenes conocidos y supresores tumorales, que en un panel de células gran suma de hasta más del 90% de todos los cambios genéticos documentados (Tabla S2) [4]. Veintitrés de estos cambios genéticos frecuentes se producen en al menos dos líneas celulares (Figura 2B y en la Tabla S3)
A:. Origen del tejido de líneas celulares en el panel Oncolines. B:. La frecuencia de cambios en los genes del cáncer en el panel de células,
es decir
, mutaciones, translocaciones y copiar los cambios de número en la línea celular COSMIC Proyecto [4]. C: La agrupación jerárquica de datos de perfiles de fármacos inhibidores de la quinasa que se comercializan en el panel de línea de 44 celdas. Sin escala
10logIC
se utilizaron 50s. Doxorubicin_123 es un perfilado triplicado para control. Los inhibidores no-quinasa son de color rojo. D:. Inhibidores de la quinasa tienen una mayor selectividad en el panel de células de agentes citotóxicos clásicos (5-fluorouracilo, cisplatino, vincristina, doxorrubicina, etopósido, docetaxel y bortezomib) guía empresas
Los estudios recientes han demostrado que la línea celular paneles pueden ser utilizados para identificar nuevos marcadores de sensibilidad a los fármacos mediante el acoplamiento de la respuesta al fármaco a la presencia de mutaciones en el gen del cáncer [4] - [7]. Estos estudios han utilizado paneles de células con hasta 400-1000 líneas celulares, para descubrir nuevas sensibilidades relacionadas con variantes genéticas raras. Sin embargo, tales paneles son poco prácticos para su uso rutinario [8]. Los paneles más pequeños son experimentalmente más accesible y también pueden dar información útil, como se ha demostrado para el panel de línea celular sesenta del Instituto Nacional del Cáncer (NCI60), en el que desde la década de 1990 más de 300.000 compuestos se han caracterizado [9], y el Panel línea de cuarenta y cinco células de la fundación de investigación japonés [10].
para comparar las actividades anti-proliferativos de todos los fármacos inhibidores de la quinasa que han sido aprobados para uso clínico, los hemos perfilado en nuestro cuarenta y cuatro panel de línea celular. Se correlacionaron las actividades de drogas a mutaciones genéticas del cáncer y se identificaron nuevos marcadores de sensibilidad a los fármacos para inhibidores de MEK y EGFR. Además, se utilizaron los datos del panel de células para comparar cuantitativamente la eficacia de orientación relativa de los fármacos diseñados para inhibir la quinasa misma.
Para estudiar más a fondo los orígenes bioquímicos de los efectos diferenciales en la orientación celular que perfila todos los fármacos inhibidores de quinasa en una Panel de ensayos de actividad enzimática de más de 300 de tipo salvaje y quinasas mutantes [11]. Mientras que se dispone de gran cantidad de datos de selectividad bioquímicos durante muchos inhibidores de la quinasa [12] - [14], esto proporciona la primera amplios perfiles de los fármacos aprobados cabozantinib [15], dabrafenib [16], ponatinib [17], regorafenib [18], trametinib [19] y vemurafenib [20] (Tabla 1). La combinación de los conjuntos de datos celulares y bioquímicos revela que la potencia bioquímica y la selectividad son contribuyentes independientes a la selección eficaz de los conductores genéticas en las células tumorales. Además, las actividades específicas fuera de objetivo pueden contribuir positivamente a la orientación, como se muestra por los inhibidores de ABL1, vinculando computacionalmente perfiles kinome de focalización celular. Nuestro estudio muestra que el panel de células perfilado en combinación con perfiles de panel de bioquímica es una poderosa herramienta en la búsqueda de nuevas aplicaciones para los inhibidores existentes, y el diseño de inhibidores específicos de manera óptima.
Resultados
Composición y validación de la célula del panel
Un panel de cuarenta y cuatro líneas celulares de cáncer humano se ensambla a partir de la American Type Culture Collection (ATCC). Se seleccionaron las líneas celulares para representar tanto una amplia gama de diferentes tipos de tumores de tejido (Figura 2A) y muchos diferentes alteraciones genéticas en oncogenes y genes supresores de tumores (Figura 2B). ADN pública información de la secuencia del proyecto CCL [4] y la línea celular de cáncer Enciclopedia (CCLE) [5] se utiliza para seleccionar las líneas celulares. Para todas las líneas celulares, hemos desarrollado ensayos de proliferación utilizando medición del contenido de ATP intracelular como una lectura indirecta del número de células. En comparación con otros paneles de la célula, el panel (Oncolines) ha aumentado la diversidad genética (Figura S1) y las concentraciones de ensayo abarcar una gama más amplia: nueve puntos en 32 mM a 3,2 nM. No nos estimamos actividades compuestas por extrapolación fuera del rango de prueba, tal como se llevó a cabo en otro estudio [4]. En cambio, para asegurar que todos los IC
50 cayeron dentro de la gama de prueba, que se extendió a concentraciones subnanomolares en el caso de compuestos muy potentes. Para preservar las características de líneas celulares, las líneas celulares se cultivaron en los medios recomendados por los investigadores originales que se depositan las líneas celulares, y por ATCC. Todas las células fueron utilizadas en los nueve pasajes del vial original ATCC
La precisión de los datos de respuesta celular es cada vez mayor atención [21] -. [23]. Siguiendo un flujo de trabajo estandarizado y la aplicación de criterios de calidad estrictos, hemos logrado una máxima IC
50 cambio de un factor de 2 y una desviación estándar de 0.07 en
10logIC
50 valores (un factor de 1,17), sobre la base de múltiples mediciones independientes de los mismos compuestos a través de el panel (Figura S2). Para este valor de referencia, se investigó la reproducibilidad en bases de datos públicas. A pesar del consenso general de que los conjuntos de datos públicos de los experimentos de caracterización de compuestos son de gran valor para la comunidad de descubrimiento de fármacos, la información sobre la reproducibilidad de los datos es escasa. Para el panel NCI60 se observó una variación máxima de IC
50 de un factor de 11 cuando el mismo compuesto se midió en dos ocasiones diferentes (Figura S2C) Además, en un análisis reciente de los datos chembl [21], cuando dos grupos de diferentes laboratorios miden la misma constante, una desviación estándar de 0,8 en
10logIC se encontró
50 años. Esto se traduce en un factor de 10
0,8 = 6 desviación estándar de IC
50 años. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que nuestra línea celular de datos de perfiles son altamente reproducible.
Para determinar si el panel tiene un tamaño suficiente, se realizó un análisis de potencia. Dependiendo del número de líneas celulares que llevan una mutación en el gen específico de cáncer, un IC
50 cambio de 2 a 10 veces entre los respondedores y no respondedores es estadísticamente significativa (Tabla S4). Estos límites están muy dentro de las respuestas normalmente observado [4], y por lo tanto un panel de la línea 44 de células es suficientemente grande para llevar a cabo los análisis de respuesta de drogas.
Profiling de inhibidores de la quinasa clínica en la célula del panel
en un análisis de sensibilidad al fármaco comparativo, perfilamos los veinticinco inhibidores de la quinasa en uso clínico en todas las líneas celulares de cuarenta y cuatro años, junto con seis agentes citotóxicos clásicos y el inhibidor del proteasoma bortezomib (Figura 2C, el cuadro S5). Todos los fármacos inhibidores de la quinasa aprobados para oncología mostraron actividad anti-proliferativa en al menos algunas de las líneas celulares. Sólo tofacitinib y fasudilo, los dos medicamentos que están aprobados para indicaciones no cancerosas (Tabla 1), no mostraron actividad inhibitoria o muy pobre.
La agrupación de todos los datos de proliferación celular (Figura 2C) confirmó que los agentes citotóxicos tienen actividad relativamente undiscriminatory contra todas las líneas celulares. El perfil de la bortezomib inhibidor del proteasoma parece a la de agentes citotóxicos, que ilustra que la inhibición de un objetivo bien definida no da lugar a una terapia dirigida cuando el objetivo realiza una función fisiológica general. De todas las líneas celulares, SHP-77 era la menos sensible a la doxorrubicina, cisplatino, docetaxel, etopósido, vincristina y bortezomib (Figura 2C), que coincide con su expresión de múltiples mecanismos multi-resistentes a los medicamentos [24]. HCT-15 y DLD-1 son diferentes en cariotipo pero se originan a partir del mismo paciente [25]. Consistentemente, los perfiles de las dos líneas de células se agrupan juntos. SW-620 y SW-480 también se originan de la misma paciente, pero no se agrupan, principalmente debido a SW-620, que se deriva de una metástasis, es sustancialmente más sensibles a la trametinib inhibidor de MEK (Figura 2C).
Claro dirigida efectos se muestran mediante fármacos inhibidores de quinasa, como muchos inhibir la proliferación de sólo unas pocas líneas celulares. Qué líneas depende de su mecanismo de acción. Por ejemplo, el EGFR inhibidores de lapatinib, erlotinib y clúster gefitinib juntos, ya que inhiben el mismo subconjunto de líneas de células, lo más notablemente AU-565, FaDu, CAL 27 y C-33A, que se originan a partir de una variedad de tejidos y tienen la característica común que sobreexpresan
EGFR gratis (Tabla S3). El ABL1 inhibidores de clúster de imatinib y nilotinib juntos porque selectivamente inhiben las líneas de células A-204 y K-562 que dependen de ABL1 para el crecimiento (Figura 2C). Sin embargo, otros fármacos quinasa inhiben el crecimiento de varias líneas celulares, tales axitinib, ponatinib, bosutinib, sunitinib y crizotinib, que se agrupan juntos en el mapa de calor (Figura 2C), la mTOR inhibidores de temsirolimus y everolimus, y la trametinib inhibidor de MEK (Figura 2C). A fin de analizar la selectividad celular de inhibidores de la quinasa, se comparó la más potente celular IC
50 de un compuesto, como una medida de la actividad celular específica, con la media de IC
50 en el panel completo, como una medida de toxicidad celular general. terapias y bortezomib citotóxicos clásicos muestran una diferencia de 10 veces entre el promedio IC
50 en el panel de células y el más potente IC
50 (Figura 2D). En contraste, la mayoría de los inhibidores de la quinasa mostraron una diferencia de 100 veces, y dasatinib incluso una diferencia de más de 1000 veces (Figura 2D), lo que demuestra que los inhibidores de la quinasa de hecho alcanzar una ventana de selectividad mejorada en comparación con los agentes quimioterapéuticos clásicos.
perfil bioquímico clínico de inhibidores de quinasa
para relacionar la actividad antiproliferativa de los fármacos inhibidores de la quinasa a la inhibición de la quinasa objetivos específicos, todos los compuestos fueron perfilados a una sola concentración en un panel de más de 300 ensayos de quinasa bioquímicos (Figura 3, Tabla S6) [11]. Además, para los objetivos más importantes, IC
50 valores se determinaron (Tabla 1). Para vemurafenib, dabrafenib, trametinib, regorafenib y cabozantinib, este es el primer perfil kinome grande en el dominio público. Una comparación de los inhibidores de vemurafenib y dabrafenib aprobados RAF muestra que dabrafenib es mucho más potente que el vemurafenib de tipo salvaje BRAF y BRAF mutante (V600E). Dabrafenib también inhibe sustancialmente más quinasas (Tabla 1; Figura 3A). El primer perfil de trametinib revela que, como la mayoría de los inhibidores de MEK [26], es exquisitamente selectiva (Figura 3A). Regorafenib es un análogo estructural de sorafenib y muestra un perfil bioquímico similar (Figura 3A). Regorafenib ha sido clasificada como más potente [18]. Sin embargo, los datos muestran que esto es cierto para su inhibición de VEGFR2, un objetivo de fármacos angiogénicos, pero no para PDGFRa, un objetivo en los tumores estromales gastrointestinales, una indicación para la que se aprueba regorafenib también (Tabla 1). inhibición bioquímica de TIE2, otro receptor implicado en la angiogénesis, fue menor, coherente con un informe anterior (Tabla S6) [18]. En su lugar, regorafenib tiene actividad inhibidora adicional sustancial en varias quinasas oncogénicas, incluyendo los receptores de Ephrin y p70S6K, que podrían contribuir a su perfil clínico diferencial [27]. Cabozantinib se ha caracterizado como un VEGFR2 combinado, MET y el inhibidor de RET y es uno de los inhibidores de VEGFR2 más potentes (Tabla 1). Está aprobado para su uso en el carcinoma medular de tiroides, consistente con su potente inhibición de RET [28]. Sin embargo, esto no es una característica distintiva de cabozantinib, como todos los inhibidores de la quinasa del receptor del factor de crecimiento, y los inhibidores de muchos ABL1 son inhibidores potentes de RET (Tabla S6). La actividad de cabozantinib en MET, otro objetivo importante de drogas [29], es mucho más especial, como crizotinib es actualmente el único fármaco aprobado que inhibe esta quinasa
A:. La agrupación jerárquica de los perfiles de todos los medicamentos inhibidores de quinasa en un panel de más de 300 ensayos de quinasa bioquímicos (% Inhibición a una concentración del inhibidor 1 mM). Trametinib, everolimus y temsirolimus mostrar sólo la inhibición de menor importancia, como ensayos de quinasa de mTOR y MEK no están incluidos en el panel. B: potentes bioquímicos IC
50 años en la diana biológica se correlacionan con la más potente celular IC
50 años. C: Bioquímica selectividad conduce a una respuesta más selectivo en el panel de células. selectividad bioquímica se cuantificó por la selectividad entropía [33] y la selectividad del crecimiento de células de orientación se expresó por la media IC
50 en el panel de células. No oncológica drogas fasudilo y tofacitinib se suprimieron del análisis debido a la falta de respuesta. Los círculos vacíos: la mTOR y MEK inhibidores de everolimus, temsirolimus y trametinib, respectivamente
Los perfiles bioquímicos de los veinticinco drogas quinasa en el mismo panel de ensayo nos permiten estudiar cómo bioquímica potencia y selectividad influencia. focalización celular general. Esto es importante, ya que en el campo quinasa, la selectividad de los nuevos medicamentos es un tema muy debatido [30] - [32]. potencia bioquímica mejorada se correlaciona con la mejora de celulares IC
50, y la fuerza de esta relación es dependiente de la diana (Figura 3B). Para controlar la selectividad bioquímica, se resumieron los perfiles kinome mediante el cálculo de la entropía selectividad (Tabla 1) [33]. Cuanto menor sea este valor, el un compuesto más selectiva. Se espera que una entropía selectividad bioquímica inferior para dar lugar a toxicidad celular menos general, determinado por el panel de célula promedio IC
50 y este es el caso de muchos inhibidores (Figura 3C). Axitinib, ponatinib, bosutinib, sunitinib y crizotinib tienen una alta entropía (Tabla 1) y muestran una amplia actividad celular (Figura 3C). La toxicidad celular de los inhibidores de BRAF (V600E) EGFR, ABL1 y también mejora con el aumento de la selectividad (Figura 3C). Las excepciones son los inhibidores de mTOR y MEK que son bioquímicamente inhibidores altamente selectivos (Tabla 1, Figura 3A), pero inhibe la proliferación de muchas células. Esto confirma que el MEK y mTOR conducen a la proliferación de muchas líneas celulares, e ilustra que la selectividad de una respuesta celular también depende de la diana biológica.
Marcadores genéticos de Drogas sensibilidad
Para explorar la biología subyacente las respuestas celulares, que investigó los determinantes genéticos de la respuesta a los veinticinco fármacos inhibidores de la quinasa de una manera imparcial. Se correlacionaron las diferencias en CI
50 por análisis de varianza con mutaciones, translocaciones, la sobreexpresión de ARNm y el número de copias de ADN cambios en un conjunto de genes del cáncer altamente frecuentes y validados (Tabla S3 y las figuras S3 a S5). Varias asociaciones conocidas de terapias dirigidas se utilizaron para validar el panel de células como una herramienta de investigación para el descubrimiento de nuevos marcadores de sensibilidad a los fármacos. Por ejemplo, nutlin 3a, un compuesto de la estabilización de la interacción de p53 con MDM2, inhibe la proliferación de líneas celulares de tipo salvaje para
TP53
mucho más potente que líneas celulares que expresan mutante
TP53 gratis (Figura S3 ). El BRAF inhibidores de vemurafenib y dabrafenib preferentemente inhiben la proliferación de líneas celulares que contienen el
BRAF (V600E)
mutación. inhibidores de ABL1 y los inhibidores de EGFR preferencialmente líneas de células inhibidas que son dependientes de
ABL1
y
EGFR
oncogenes, respectivamente (Figuras S4 y S5).
Con el análisis Anova, nos descubiertos nuevos marcadores de sensibilidad a los fármacos para inhibidores de MEK y EGFR. El trametinib inhibidor de MEK líneas celulares preferencialmente inhibidos que llevan mutaciones en
CTNNB1
, que codifica el factor de transcripción β-catenina (Figura 4A). La asociación fue confirmada con otros dos inhibidores de MEK,
es decir.
AZD6244 y PD0925301 (Figura S6). En promedio, los inhibidores de MEK fueron entre 12 y 37 veces más potente en líneas celulares que expresan mutante β-catenina en comparación con líneas celulares que expresan sólo la proteína de tipo salvaje. Un hallazgo interesante adicional es que los cuatro inhibidores de EGFR, incluyendo afatinib, son más activos en ensayos de proliferación de líneas de células que albergan una mutación en
SMAD4 gratis (Figura 4B y la figura S5). La asociación fue confirmada con otros dos inhibidores de EGFR que todavía están en desarrollo clínico,
es decir, España. Pelitinib y neratinib (Figura S7). La diferencia en la actividad de los inhibidores de EGFR en
SMAD4
mutante
células frente
de tipo salvaje varió de 2 a 12 veces