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PLOS ONE: Crecimiento Celular simvastatina inhiben el cáncer renal y metástasis a través de Akt /mTOR, ERK y JAK2 /STAT3 Pathway

2014/9/25


Extracto

El carcinoma de células renales (CCR) es el tipo más letal de cáncer genitourinario debido a su oculta inicio y la resistencia a la quimioterapia y la radiación. Recientemente, evidencia acumulada ha sugerido manchas, inhibidores de la 3-hidroxi-3-metil glutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, se asociaron con la reducción del riesgo de cáncer. En el presente estudio, que tuvo como objetivo investigar los efectos potenciales de la simvastatina en células de RCC y los mecanismos subyacentes por los cuales simvastatina ejerce sus acciones. Con la viabilidad celular, la formación de colonias, y el flujo de ensayos de citometría de apoptosis, se encontró que la simvastatina potentemente el crecimiento celular suprimida de las células A498 y 786-O en un tiempo y dosis-manera dependiente. En consonancia, el modelo de xenoinjerto realizado en ratones desnudos exhibió crecimiento tumoral reducida con el tratamiento con simvastatina. Además, también se observaron los efectos inhibidores de la simvastatina sobre la migración y la invasión en
in vitro
. Mecánicamente, presentamos que la simvastatina podría suprimir la proliferación y la motilidad de las células RCC a través de la inhibición de la fosforilación de AKT, mTOR y ERK en un tiempo-y dosis-dependiente manera. La investigación adicional del mecanismo subyacente reveló simvastatina podría ejercer los efectos antitumorales mediante la supresión de la fosforilación inducida por IL-6 de JAK2 y STAT3. En conclusión, estos resultados sugirieron que la apoptosis simvastatina inducida y su actividad anti-metástasis en células de RCC fueron acompañados por la inhibición de AKT /mTOR, ERK, y JAK2 vías /STAT3, lo que implica que la simvastatina puede ser un agente terapéutico potencial para el tratamiento de pacientes con CCR

Visto:. colmillo Z, Y Tang, fang J, Zhou Z, Z Xing, Guo Z, et al. (2013) Cell Growth simvastatina inhiben el cáncer renal y metástasis a través de Akt /mTOR, ERK y JAK2 /STAT3 Camino. PLoS ONE 8 (5): e62823. doi: 10.1371 /journal.pone.0062823

Editor: Zhongjun Zhou, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong

Recibido: Enero 15, 2013; Aceptado: March 26, 2013; Publicado: 17-may 2013

Derechos de Autor © 2013 de Fang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172435). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el carcinoma de células renales (CCR) es el tipo más común de cáncer renal, lo que representa aproximadamente el 90-95% neoplasias renales [1]. A nivel mundial, la mortalidad por CCR ha superado los 100.000 pacientes cada año [2]. Acerca de 25-30% de los pacientes desarrollan metástasis en el diagnóstico de CCR [3], con una supervivencia ≥5 años que van desde 5% a 10%, y la mediana de supervivencia global de menos de un año [4], [5]. La intervención quirúrgica es el tratamiento primario para el CCR localizado, pero solo se ha limitado beneficio en pacientes con enfermedad agresiva [1]. Además, la quimioterapia citotóxica tradicional y la inmunoterapia no han podido demostrar un beneficio en los pacientes en el tratamiento adyuvante [6]. Los últimos años han visto un rápido desarrollo de la terapia molecular dirigida [7]. Entre las terapias de primera línea dirigidos, sunitinib y temsirolimus son los más representativos, que puede bloquear la vía de señalización de múltiples receptores tirosina quinasas (RTK) y mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR), respectivamente [8], [9]. Sin embargo, ninguna de las intervenciones sería considerado rentable en un umbral, la disposición a pagar de 30.000 libras por ajustado por calidad año de vida [10]. Por lo tanto, hay una gran demanda de tratamientos que pueden prolongar la supervivencia sin aumentar considerablemente los costos de la erosión o la calidad de vida de los pacientes.

Las estatinas (o 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A [HMG-CoA] reductasa inhibidores) son un grupo de fármacos, que son análogos estructurales de la HMG-CoA reductasa que inhiben la conversión de HMG-CoA a mevalonato [11], [12]. Más allá de sus propiedades para reducir el colesterol, las estatinas presentan numerosos efectos pleiotrópicos, incluyendo anti-inflamación y la inmunomodulación [13], [14], la reducción en el riesgo de varias formas de demencia [15], y una disminución en la proteinuria y la progresión de riñón enfermedad [16], [17]. De importancia, la evidencia emergente reveló que las estatinas podrían exhibir efectos antineoplásicos en una variedad de células de cáncer [18], incluyendo el cáncer de próstata [19] - [22], cáncer de mama [23] - [25], cáncer hepático [26], [ ,,,0],27] y el cáncer de colon [28], [29]. Es alentador que un estudio de casos y controles retrospectivo que incluyó 500.000 veteranos informó un papel protector de las estatinas contra el desarrollo de CCR [30]. Sin embargo, el efecto preciso de simvastatina frente a células de RCC y los mecanismos moleculares subyacentes no han sido bien establecida.

En el presente trabajo, nuestros datos establecen los inhibidores de crecimiento y pro-apoptóticos efectos de la simvastatina sobre las células de RCC, tanto en
in vitro Opiniones y en
in vivo
. Mientras tanto, también encontramos que la simvastatina puede disminuir de forma potente la migración y la invasión de las células RCC. La investigación adicional de los mecanismos subyacentes indica AKT /mTOR, ERK y JAK2 /SAT3 vías desempeñan un papel clave en estas acciones. Nuestros hallazgos sugieren las implicaciones clínicas de la simvastatina en el tratamiento de pacientes con CCR.

Materiales y Métodos

Ética declaración

El protocolo experimental animales cumplido con las Normas de Gestión del animal Ministerio de Salud de china (Documento N ° 55, 2001) y fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Shandong. Libres de patógenos BALB /c ratones desnudos (con un peso de 19 ± 2 g, grado SPF, certificado SCXK2011-0012) de 4-5 semanas de edad fueron adquiridos de laboratorio del Departamento de Ciencia Animal de la Universidad de Pekín (Beijing, China). Todos los animales se mantuvieron en el Laboratorio clave del remodelado cardiovascular y la investigación de las funciones en el Hospital de la Universidad de Shandong Qilu.

Líneas celulares y reactivos

líneas celulares A498 Humana y 786-O se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio DMEM de alta glucosa (Hyclone) con suero bovino fetal al 10% (FBS) en las condiciones de 5% de CO2 a 37 ° C. Simvastatina (sal de sodio, C25H39O6 · Na) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.), que se activa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. IL-6 humana se adquirió de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN, USA). Los anticuerpos contra fosfo-mTOR, mTOR, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfo-JAK2, JAK2, fosfo STAT3 (Tyr705 y Ser727), STAT3, PARP, GAPDH, y conjugado con HRP de cabra anti-conejo y anti-ratón de IgG se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). Los anticuerpos contra casepas-3, bax, bcl-2 y survivina se obtuvieron de Immuno-way (Newark, DE, EE.UU.). Los anticuerpos contra fosfo-ERK, ERK se obtuvieron a partir de Anbo (San Francisco, CA, EE.UU.).

viabilidad de las células de ensayo

La viabilidad celular se determinó por 3- (4, 5-dimetiltiazol-2 il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo. Brevemente, A498 (2 × 10
3 células /pocillo) y 786-O (1 × 10
3 células /pocillo) en 100 l de medio se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 12 horas, el medio en cada pocillo se reemplazó con el medio que contiene diferentes concentraciones de simvastatina y la placa se incubó durante 48, 72 y 96 horas. Posteriormente, se añadieron 20 l de MTT (5 mg /ml) en cada pocillo. Después de incubación a 37 ° C durante 4 h, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 200 l de DMSO a cada pocillo. Después de la precipitación se disuelve completamente, los valores de absorbancia se determinaron con el lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

Efecto de la simvastatina sobre la morfología celular

Cuando A498 y 786 células -O alcanzaron 70% de confluencia, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego expuestos a 16 M simvastatina durante 48 horas. Se observó la morfología de las células tratadas bajo el microscopio y microfotografías fueron tomadas con una cámara digital Olympus.

Clonar ensayo de formación de

células A498 y 786-O se sembraron a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo en placas de 6 pocillos. Después de la incubación durante la noche, cada pocillo se añadió de simvastatina (8 y 16 mM) y se incubó durante 24 horas. A continuación, el medio se reemplazó con medio completo sin simvastatina y se incubaron en las condiciones de 5% de CO
2 y 37 ° C durante dos semanas. Cuando clones visibles formadas en las placas, se dio por terminada la incubación. Los clones se lavaron con PBS y después se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 30 minutos. La colonia que contiene más de 50 células se contó con un microscopio.


in vitro
cero ensayo


in vitro
ensayo cero se realizó como se ha descrito previamente [31]. Las células A498 y 786-S fueron sembradas en placas de 24 pocillos. Después de la incubación durante 24 horas, cada pocillo se rascó de forma manual con una punta de pipeta 200 l, se lavó con PBS tres veces y se incubó a 37 ° C con simvastatina (8 y 16 mM). El área de pruebas fue fotografiado 18 horas más tarde. La distancia entre dos bordes celulares fueron analizados por el software ImageJ

La invasión y la migración de ensayo

El sistema transwell (24 pozos, 8 micras de tamaño de poro con una membrana de policarbonato;. Corning Costar, Lowell, MA, EE.UU.), recubierta con 2 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences) se utilizó para la en
in vitro
ensayos de invasión. Un total de 5 × 10
5 células se suspendieron en 100 l de medio libre de suero y se añadieron a las cámaras superiores. DMEM que contiene 20% de FBS y simvastatina (8 y 16 M) después se añadió a la cámara inferior. Después de 24 horas, las células que quedan en las cámaras superiores se retiraron con un hisopo de algodón mientras que las células correspondientes a la superficie inferior se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. El número de células que migraron a la parte inferior se contó en cinco campos al azar bajo un microscopio óptico. El número de células se contó y se analizó estadísticamente.

Para el ensayo de migración, las células se sembraron en cámaras superiores sin Matrigel recubierto. El resto del ensayo se realizó como el ensayo de invasión. Después de 18 horas, las células en la superficie inferior también se contaron en cinco campos al azar, entonces el número de células se analizaron estadísticamente.

Apoptosis ensayo

Este ensayo se realizó para detectar la apoptosis de células con una anexina Kit V-FITC apoptosis Detección (BD Biosciences, San Jose, CA). En resumen, las células recolectadas se resuspendieron en 100 l de tampón de unión para lograr una concentración de 1 × 10
6 /mL. A continuación, se añadieron 5 l de Anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio (PI, 20 mg /ml) y los tubos se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, se añadió tampón de unión (400 l) a cada tubo de reacción y las células se analizaron por citometría de flujo. Los datos fueron analizados usando el software V2.9 WinMDI (El Instituto de Investigación Scripps, San Diego, CA, EE.UU.).

interferencia de ARN y transfección transitoria

pequeños ARN de interferencia (siRNA) focalización AKT humana , ERK1 /2 y STAT3 se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). células A498 (2 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos) fueron transfectadas con AKT, ERK1 /2 y STAT3 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, respectivamente. Después de la transfección, las células se incubaron durante 24 h y luego tratados con simvastatina (8 M) para MTT, migración, invasión y ensayos de transferencia Western.

se recogieron análisis de transferencia de Western

Las células y se lisaron en tampón RIPA en presencia de inhibidores de la proteasa. La proteína (50 mg) se separó por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF usando un aparato de transferencia húmeda (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios, seguido de incubación con los anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante. Las bandas de proteínas se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia (Millipore). Los niveles de proteína se detectaron utilizando un lector de quimioluminiscencia ImageQuant LAS4000 (GE, EE.UU.). Los niveles de proteína se analizaron mediante el software ImageJ.

El tumor de xenotrasplante modelo

En resumen, un total de 5 × 10
6 de las células A498 se mezclaron con Matrigel y luego se inyecta por vía subcutánea en el flanco los ratones de desnudos. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (10 de cada grupo). Entonces se les dio ratones de simvastatina a dosis de 5 mg /kg /d por sonda oral durante 5 semanas. Los ratones de control recibieron el mismo volumen de solución salina normal. El volumen del tumor y los ratones de peso se midió cada semana. Todos los ratones fueron asesinados 50 días después de la inoculación de las células cancerosas y los tumores se recogieron.

deoxinucleotidil terminal transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo de

xenoinjertos de tumores se fijaron-formalina, embebido en parafina y luego cortada en la sección 6 micras para el ensayo de TUNEL para identificar las células apoptóticas. La apoptosis TUNEL ensayo kit (Beoytime, Pekín, China) se utiliza para teñir las células apoptóticas. Estas células se visualizaron con fluorescente de color rojo con un microscopio de fluorescencia (Olympus).

El análisis estadístico

Se utilizó la prueba t de dos colas del estudiante para determinar las diferencias estadísticas entre los valores de tratamiento y control. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p & lt; 0,05. Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.

Resultados

simvastatina inhibe la proliferación celular de las células de cáncer renal

Para estudiar los efectos de la simvastatina sobre la proliferación RCC de células, las células A498 y 786-S fueron expuestas a diferentes concentraciones de simvastatina durante 48, 72 y 96 h en el ensayo de MTT. En consecuencia, la simvastatina, inhibió la proliferación de células A498 y 786-O en un tiempo y dependiente de la dosis de forma (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) (Fig. 1A y 1B). La viabilidad de las células A498 y 786-O se redujo a 52,6% y 38,8% después del tratamiento con simvastatina (16 M) durante 72 horas, con el IC50 de 18.434 ± 1,26 M y 16,311 ± 1,21 mM, respectivamente.

El efecto de la simvastatina sobre la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. células A498 (A) y células 786-O (B) fueron tratados con simvastatina durante 48, 72 y 96 h. Simvastatina viabilidad celular significativamente inhibido de las dos líneas celulares de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Se muestran cambios morfológicos de las células A498 y 786-O inducida por simvastatina. Imágenes de A498 (C) y (D) células 786-O antes y después de la adición de simvastatina (16 micras) se tomaron a 48 h. Después tratados con simvastatina durante 48 h, cuerpos apoptóticos en A498 (C) y las células (D) 786-O pueden ser observados por microscopio óptico. (E) Efecto inhibidor de la simvastatina en la formación de colonias. (F) El número de colonias fue contado en el microscopio y la colonia se define para consistir en al menos 50 células. Los resultados representan como media ± SD de tres experimentos independientes y el error estándar correspondiente. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01

Efecto de la simvastatina sobre la morfología celular de las células de cáncer renal

De acuerdo con los resultados anteriores [32], también se observó una respuesta de dos fases en el tumor células a la simvastatina tratamiento. La primera fase se produjo un cambio dramático en la morfología de las células dentro de las primeras 6 h a 24 h. La fase posterior de la respuesta se produjo entre las 24 h a 72 h, lo que implicaba la pérdida de integridad de la membrana de plasma. cambio de morfología de las células A498 y 786-O después del tratamiento con simvastatina (16 M) durante 48 horas se muestra en la Fig. 1C y 1D. Como se ha representado, simvastatina causó células para retraer sus procesos y perder integridad de la membrana plasmática. se observó la contracción del cuerpo de la célula central alrededor de los núcleos en la membrana plasmática, lo que indica la apoptosis estaba ocurriendo en estas células. El cuerpo de apoptosis era claramente visible después del tratamiento con simvastatina (16 M) durante 48 h.

simvastatina inhibe la formación de colonias en las células de cáncer renal

También examinó los efectos de la simvastatina sobre la formación de colonias de células de las células de RCC. Nuestro estudio demostró que la simvastatina inhibió la formación de colonias de las células A498 y 786-O de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1E). El número de colonias se redujo significativamente después de las células RCC tratados con simvastatina (8 y 16 M), en comparación con las células de control (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01). (Fig. 1F)

induce Simvastatina apoptosis en células de cáncer renal

para verificar y cuantificar las células apoptóticas inducidas por la simvastatina, se utilizó la anexina V conjugada con Alexa Fluor 488 y yoduro de propidio tinción para analizar el porcentaje de células apoptóticas. Los porcentajes de células apoptóticas tempranas y más tarde se muestran en la parte inferior derecha (LR) y la parte superior derecha (UR) cuadrante de los histogramas, respectivamente (Fig. 2A y 2B). El porcentaje total de células apoptóticas (UR + LR) aumentó de 2,64% en las células A498 no tratados con simvastatina a 7,82% y 10,15% en las células tratados con simvastatina (8 y 16 mM, respectivamente) después de 48 horas (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) (Fig 2C).. Encontramos el fenómeno similar en células 786-O, y el porcentaje total de células apoptóticas se incrementó de 6.32% a 9.68% y el 17,6% (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) (Figura 2D.). El tratamiento de células A498 y 786-O con 8 y 16 M simvastatina durante 48 horas indujo apoptosis en ambas líneas celulares, y fue de una manera dependiente de la dosis. La inducción de la apoptosis significativa después del tratamiento con simvastatina indicó su efecto contra el cáncer en las células de RCC.

(A) A498 y (B) células 786-S fueron tratados con simvastatina (0, 8 y 16 mM) durante 48 horas y teñidas con FITC-AnnexinV y PI. El porcentaje de células supervivientes se muestra en el cuadrante inferior izquierdo; el porcentaje de etapa temprana de la apoptosis y la etapa tardía de las células de la apoptosis se demostró en los cuadrantes correctos correctos inferior y superior, respectivamente. (C, D) La cuantificación de la apoptosis inducida por la simvastatina se calculó. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01

La migración y la invasión son inhibidas por la simvastatina en las células de cáncer renal

El ensayo se llevó a cabo cero para detectar el efecto de la simvastatina sobre la migración de células de cáncer renal. Como se muestra en la Fig. 3A y 3B, la migración de las células A498 fue restringido por la simvastatina en una forma dependiente de la dosis. Y el efecto similar se observó también en las células 786-O (Fig. 3C y 3D). A fin de probar la influencia de la simvastatina sobre la migración celular y la invasión, las células A498 tratadas con el aumento de la concentración de simvastatina se aplicaron a la migración transwell y ensayos de invasión Matrigel transwell-recalce. Nuestro resultado mostró que la simvastatina podría inhibir significativamente la migración renal de células de cáncer y la invasión (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) (Fig. 4A y 4B) de una manera dependiente de la dosis. Encontramos el mismo efecto de la simvastatina en células 786-O (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01). (Fig. 4C y 4D)

(A) ensayo de arañazos de las células A498 tratadas con 0, 8 y 16 micras de simvastatina. (B) La inhibición de la migración se transformó en el porcentaje de la distancia inicial entre los dos bordes. Las células A498 tratados con simvastatina mostró una menor tasa de cierre de la herida que las células control. ensayo (C) los arañazos de las células 786-O tratado con 0, 8 y 16 micras de simvastatina. (D) Las células 786-O tratados con simvastatina mostró una menor tasa de cierre de la herida que las células control.

(A) El tratamiento con 0, 8 y 16 micras de simvastatina mostró la migración y la invasión inhibido de las células A498. (B) El número de células A498 que migró e invadió se contó con éxito. (C) La migración y la invasión de las células 786-O se inhibió tras el tratamiento con diferentes concentraciones de simvastatina. (D) La disminución del número de células 786-S indica el gran efecto inhibidor de la simvastatina sobre la movilidad celular. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01

simvastatina inhibe el crecimiento tumoral e inducir la apoptosis en células tumorales un modelo de xenoinjerto

Para determinar si la simvastatina inhibe el crecimiento tumoral en
in vivo
, las células A498 (5 × 10
6) fueron inyectadas subcutáneamente en cada flanco de ratones desnudos. inhibición del crecimiento tumoral era distinta en ratones tratados con simvastatina a 5 mg /kg /d, en comparación con los ratones tratados con PBS (* P & lt; 0,05) (Fig. 5A, 5B y 5C). Además, no había ninguna toxicidad significativa con los ratones tratados con simvastatina (5 mg /kg /d) mediante la evaluación de los ratones de peso de 2 grupos (Fig. 5D). Para conocer si la simvastatina podría inducir la apoptosis de células de RCC en el ensayo
vivo
, las secciones de parafina de xenoinjertos tumorales A498 de ratones desnudos se aplicaron a la terminal desoxinucleotidil transferasa fin de etiquetado dUTP nick (TUNEL). El aumento del número de células TUNEL positivas demostró claramente que la simvastatina podría inducir la apoptosis de CCR en
in vivo gratis (* p & lt; 0,05). (Fig. 5E y 5F)

Imágenes del extirpada tumores (a) y los ratones desnudos (C) fueron tomadas del grupo de control y tratamiento. Las flechas apuntan a los xenoinjertos. (B) gráficos que representan los volúmenes promedio de tumor de xenoinjertos A498 tratados con o sin simvastatina. curva de peso (D) del cuerpo de los ratones desnudos portadores de tumores A498 tratados con simvastatina. tinción (E) Representante de TUNEL (fluorescencia roja) del A498 xenoinjertos de cáncer renal. gráfico (F) de barras que muestra la cuantificación de las células A498 positivas TUNEL en xenogafts tumorales. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, * p & lt;. 0,05

Efectos de simvastatina sobre la expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis de células

La expresión de la proteína pro-apoptótica Bax ha estado a menudo asociado con el aumento de la apoptosis, mientras que la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 se ha asociado con la inhibición de la apoptosis en las células diana [33], [34]. Después se trató con aumento de las concentraciones de simvastatina durante 48 h, se detectó la expresión de Bax y Bcl-2 en células de RCC. En consonancia con el aumento de la apoptosis en A498 y 786-O, el nivel de Bax fue elevado mientras que el nivel de Bcl-2 se redujo (Fig. 6A). La relación de Bax /Bcl-2 nivel de proteínas es el factor decisivo para transmitir la señal de apoptosis. Mediante la comparación de la intensidad de sus bandas, encontramos la relación de Bax /Bcl-2 se aumentó de una manera dependiente de la dosis (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) (Fig 6B.). Con la proporción elevada de Bax /Bcl-2, el casepase-3 aguas abajo de la apoptosis se activó. Como se muestra, la expresión de survivina y pro-caspasa-3 se disminuyó, mientras que la expresión de la caspasa-3 escindido y la escisión de PARP se elevó.

células A498 y 786-O (A) se ensayaron para determinar Bcl-2, Bax, la longitud total de la caspasa 3 y caspasa 3 escindida, PARP longitud completa y PARP escindida por análisis de transferencia Western con GAPDH como control. (B) Bax /Bcl-2 ratios de A498 y células 786-S. El valor de la densitometría de cada banda se determinó con ImageJ. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01. (C-H) Los niveles de mTOR, AKT, ERK y sus formas fosforiladas se analizaron por Western Blot. La cuantificación de la p-mTOR /mTOR, p-AKT /AKT y la relación de p-ERK /ERK se determinó mediante análisis de densitometría.

simvastatina inhibe la proliferación y la metástasis de células de RCC a través de AKT /mTOR y ERK vía

Western Blot se utiliza para detectar el mecanismo subyacente en la que la simvastatina ejerce sus acciones. mTOR se desregula con frecuencia en las células cancerosas, que está bajo investigación como un objetivo potencial para los pacientes de RCC [35]. AKT, como el de aguas arriba de mTOR, juega un papel crítico en la proliferación, la supervivencia y la motilidad de las células cancerosas y se puede fosforilar directamente mTOR [36]. Por lo tanto, investigamos el efecto de la simvastatina sobre la regulación de la vía Akt /mTOR. Después de las células A498 y 786-O fueron tratados con simvastatina (8 y 16 M) durante 24 y 48 horas, los niveles de fosforilación de AKT y mTOR se suprimieron con eficacia. Las proporciones de p-AKT /AKT, así como p-mTOR /mTOR también se redujeron en un tiempo y dosis- forma dependiente (Fig. 6C, 6D, 6E y 6F). ERK, que es la frecuencia aberrantemente activadas en células de cáncer, promueve la proliferación celular del cáncer y la metástasis [37]. A continuación, hemos probado los efectos de la simvastatina sobre la activación de ERK, y encontramos simvastatina inhibe la fosforilación de ERK en un tiempo-y dosis-dependiente manera en los dos A498 y 786-O células (Fig. 6G y 6H)
.
Para investigar el papel de AKT y ERK en la proliferación y movilidad de las células de RCC, se utilizó siRNA a desmontables AKT y ERK1 /2 expresión génica en células A498. Como se muestra en la Fig. 7A y 7B, el análisis de transferencia de Western indicó una reducción significativa en los niveles de proteína de AKT y ERK1 /2 en las células transfectadas con AKT y ERK1 /2 campared a las células transfectadas con mock siRNA. A continuación, se evaluó la apoptosis inducida por simvastatina y su actividad anti-metástasis en células A498 que fueron transfectadas con AKT o ERK1 /2 siRNA. Los resultados mostraron que desmontables de AKT o la proliferación celular ERK1 /2 suprimió de forma significativa, la migración y la invasión (Fig. 7C, 7D, 7E y 7F), indicando que Akt y ERK1 /2 desempeñan papeles importantes en la proliferación, la migración y la invasión en las células de RCC . Además, la simvastatina inhibe significativamente la proliferación y la motilidad de las células AKT o ERK1 /2 desmontables, lo que sugiere que la inhibición de la vía de señalización AKT o ERK podría potenciar el efecto anticancerígeno de la simvastatina.

(A, B células A498) se transfectaron y se trataron con simvastatina (8 M), y los niveles de AKT y ERK se analizaron por Western Blot con GAPDH como control. Después transfectadas con AKT o ERK siRNA, se incubaron las células A498 en ausencia o presencia de simvastatina (8 M) durante 48 h. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo de MTT (C, D), y la migración celular y la invasión se midió por ensayo transwell (E, F). * P & lt; 0,05 o ** p & lt; 0,01, en comparación con las células no tratadas (Mock).#P & lt; 0,05 o ## p & lt; 0,01, en comparación con las células transfectadas con AKT o ERK siRNA

simvastatina inhibe la proliferación y la metástasis de células de RCC mediante IL-6 vía JAK2 /STAT3 inducida

Anteriormente, se ha informado de las estatinas que ejercen efectos pleiotrópicos sobre señalizaciones celulares y funciones implicadas en la inflamación [38]. Por lo tanto, especular si la simvastatina ejerce efecto supresor del tumor a través de la modulación de la inflamación de promoción tumoral. La acumulación de pruebas ha informado de la vía JAK2 pro-inflamatoria /STAT3 desempeña un papel crítico en la metástasis del cáncer, la apoptosis y la angiogénesis [39]. En particular, IL-6 es una citocina que puede activar la señalización de JAK2 /STAT3 en células de cáncer, que tiene un efecto importante en la oncogénesis [40]. Para evaluar si IL-6 podría inducir la proliferación y la metástasis de las células cancerosas de RCC, que las células A498 privadas de suero durante 12 h y luego cultivadas en ausencia o presencia de IL-6 por 48 h. A continuación, la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT, mientras que la capacidad de metástasis de las células se midió por transwell ensayo. Se encontró que la IL-6 podría inducir significativamente la proliferación y la metástasis de las células A498. Además, la IL-6 proliferación y la metástasis en células A498 inducida podría ser suprimida por la simvastatina (8 M) (Fig. 8A y 8B).

(A, B) las células A498 se trataron con IL-6 ( 10 ng /ml) durante 48 h, y la vitalidad celular y la motilidad se estimó utilizando el MTT y transwell ensayo respectivamente. Cada barra representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 o ** p & lt; 0,01, en comparación con las células tratadas y sin IL-6. (C-H) La simvastatina inhibe la fosforilación de JAK2, STAT3 (Tyr705) y STAT3 (Ser727) en las células de cáncer renal en una dosis y tiempo dependiente. El análisis cuantitativo de la p-JAK2 /JAK2, p-STAT3 (Tyr705) /STAT3 y p-STAT3 (Ser727) /relación de STAT3 se muestra en cada panel inferior.

A continuación, investigamos si la simvastatina inhibe la fosforilación de JAK2 y STAT3 inducida por IL-6 en células de RCC. células A498 y 786-O fueron pre-tratados con simvastatina (8 y 16 M) durante 12, 24 y 48 horas, y luego se incubaron estas células con IL-6 (10 ng /ml) durante 10 min. Los análisis de transferencia Western mostraron que la simvastatina, inhibió la IL-6 induce la fosforilación de JAK2 y STAT3, tanto en Tyr705 y el sitio Ser727 (Fig. 8C-8H).

Para evaluar si STAT3 está implicado en la apoptosis y anti-inducida simvastatina -metastasis de las células RCC. Aplicamos siRNA desmontables expresión del gen STAT3 en células A498. Después transfectadas con siRNA STAT3 o oligonucleótidos de control, las células A498 fueron tratados con simvastatina (8 M) o control. Como se muestra en la Fig. 9A, desmontables de STAT3 suprimió significativamente la proliferación, la migración y la invasión de las células A498 (Fig. 9b y 9c), lo que indica que STAT3 desempeña un papel importante en la proliferación y la motilidad de las células A498. Además, el tratamiento combinado con simvastatina (8 M) y STAT3 siRNA disminución de la viabilidad celular y la motilidad de las células A498, en comparación con las células tratadas con STAT3 siRNA solo. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la IL-6 vía JAK2 /STAT3 inducida se asoció con la supervivencia y la metástasis en células de RCC, y la inhibición de IL-6 inducida por vía JAK2 /STAT3 señalización podrían sensibilizar a las células RCC al tratamiento simvastatina.

(a) células A498 fueron transfectadas con siRNA STAT3 y tratados con simvastatina (8 M), y los niveles de STAT3 se analizó por Western Blot con GAPDH como control. (B, C) Después transfectadas con siRNA STAT3, se incubaron las células A498 en ausencia o presencia de simvastatina (8 M) durante 48 h. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo de MTT, (B), y la migración celular y la invasión se midió por ensayo transwell (C). * P & lt; 0,05 o ** p & lt; 0,01, en comparación con las células no tratadas (Mock).#P & lt; 0,05 o ## p. & Lt; 0,01, en comparación con las células transfectadas con siRNA STAT3

simvastatina inhibe la fosforilación de AKT, ERK y STAT3 en los tumores de xenoinjertos

Para determinar si el efecto de la simvastatina sobre el crecimiento de xenoinjerto de tumor A498 implica la inhibición de AKT, ERK1 /2 y la actividad STAT3. análisis de transferencia de Western de AKT, ERK1 /2 y STAT3 activación indicó que los niveles de fosforilación de AKT, ERK1 /2 y STAT3 se suprimieron eficazmente en xenoinjerto A498 después del tratamiento con simvastatina en
vivo
(Fig. 10). En general, nuestro estudio indica que la simvastatina podría inhibir el crecimiento del tumor renal en
in vivo
que implica la inhibición de AKT, la actividad de ERK1 /2 y STAT3.

análisis de Western blot para la AKT fosforilada, ERK y STAT3 los niveles en xenoinjerto de tumor recogidos de ratones desnudos tratados con o sin simvastatina. La cuantificación de p-AKT /AKT, p-ERK /ERK y la relación de p-STAT3 /STAT3 se determinó mediante análisis de densitometría. * P & lt;. 0,05 comparado con el control

Discusión

Stains son inhibidores de la reductasa HMG-CoA, que son ampliamente utilizados en el tratamiento de trastornos de lípidos, especialmente hipercolesterolemia [41]. Recientemente, numerosos datos experimentales han demostrado que las estatinas presentan efectos antitumorales contra varias células cancerosas de diferentes orígenes [42].

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