Extracto
Antecedentes
Los genes reloj en coche alrededor del 5-15% de la expresión del ARNm de todo el genoma, y la alteración del reloj circadiano pueden desregular las funciones biológicas normales de la célula. Cryptochrome 1 es un regulador clave del bucle de realimentación circadiano y juega un papel importante en los organismos. El presente estudio se realizó para investigar la expresión de Cry1 y su significado pronóstico en el cáncer colorrectal (CCR). Además, la función de Cry1 en el CCR humano se investigó en modelos de cultivo celular.
Métodos
PCR en tiempo real cuantitativa, análisis de transferencia de Western e inmunohistoquímica se utilizaron para explorar expresión Cry1 en la celda CRC líneas y muestras clínicas primarias CRC. Se usaron ensayos de MTT y de formación de colonias para determinar los efectos sobre la capacidad de proliferación celular. El modelo animal fue utilizado para explorar el impacto Cry1 en la capacidad del tumor de proliferación celular
in vivo
. Se realizaron Transwell ensayos para detectar la capacidad de migración de las líneas celulares. Los análisis estadísticos se aplican para evaluar el valor diagnóstico y las asociaciones de expresión Cry1 con parámetros clínicos.
Resultados
Cry1 expresión fue hasta regulado en la mayoría de las líneas celulares de CRC y 168 CRC primaria clínica especímenes a nivel de proteínas. análisis patológico clínico demostró que la expresión Cry1 se correlacionó significativamente con la metástasis de los ganglios linfáticos (
p = 0,004
) y el estadio TNM (
p
= 0,003). Cry1 alta expresión se asocia a peor supervivencia global en pacientes con CCR (
p = 0,010
). Experimentalmente, se encontró que la sobre regulación de Cry1 promovió la proliferación y migración de las células HCT116, mientras que la baja regulación de Cry1 inhibió la formación de colonias y la migración de las células SW480.
Conclusiones
Estos resultados sugieren que Cry1 probablemente juega un papel importante en el desarrollo y la progresión del CRC andCry1 puede ser un biomarcador pronóstico y una diana terapéutica prometedora para CRC
Visto:. Yu H, Meng X, Wu J, Pan C, Ying X, Zhou Y, et al. (2013) Cryptochrome 1 sobreexpresión se correlaciona con la progresión tumoral y mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (4): e61679. doi: 10.1371 /journal.pone.0061679
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 10 Enero, 2013; Aceptado: March 13, 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Programa, Nº 2011CB504805, Nº 2010CB52994), de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30973448) y Guangdong Programa de Reclutamiento de creativo Research Group. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los ritmos circadianos son oscilaciones diarias en diversos procesos biológicos. En los últimos años, la regulación del ritmo circadiano se comprende mejor. El mecanismo molecular de las oscilaciones circadianas en el núcleo supraquiasmático (SCN) y las células periféricas se basa en los circuitos de retroalimentación de ocho genes circadianos básicas [1], [2]:
PERIOD1 (Per1)
,
Period2 (Per2)
,
periodo3 (PER3)
,
Reloj
,
Bmal1
,
caseína quinasa I ε (CKIε)
,
Cryptochrome1 (Cry1) y Cryptochrome2 (Cry2)
. Entre los ocho genes, los Crys se acumulan en el citoplasma y luego entrar en el núcleo, la promoción de la formación de complejos Per /Cry /CK1ε estables. Una vez en el núcleo, los Crys se separan del complejo transcripcional Bmal1 /Reloj asociada, lo que resulta en la inhibición de la Cry y por la transcripción y la des-represión de la transcripción Bmal1. El reloj molecular de los tejidos periféricos coordina la transcripción de los genes circadianos. Los genes circadianos son en gran parte específica de tejido y vincular funciones de los tejidos clave para el medio ambiente circadiano, lo que permite estas importantes funciones estén disponibles en determinados momentos cuando más se necesitan [3], [4], [5].
en los mamíferos, aproximadamente el 5-15% de la expresión del ARNm de todo el genoma es impulsado por los genes circadianos, incluyendo reguladores del ciclo celular clave (como
ciclina D1
), oncogenes y supresores de tumores, como
c myc
y
WEE-1 gratis (una especie quinasa que bloquea la división celular) [6]. La alteración del reloj circadiano puede desregular las funciones biológicas celulares normales y tienen efectos significativos sobre la salud humana, causando condiciones tales como trastornos del sueño, gastrointestinales y enfermedades cardiovasculares y la depresión. El reloj circadiano también se asocia con un aumento de la incidencia de varios cánceres epiteliales [7], [8], [9], [10], [11], [12]. En modelos de ratones, los tumores trasplantados crecen el doble de rápido en los ratones lesionados-SCN como en el simulacro de animales con lesiones [13]. Estos hallazgos sugieren que existe una estrecha relación entre la organización circadiana y el desarrollo de diversos tipos de cáncer. Las relaciones entre genes circadianos y el cáncer se ha demostrado en los últimos años. El reloj circadiano huésped ha sido informado a desempeñar un papel importante en el control endógeno de la progresión del tumor [14] .Cry1, un miembro de la familia Cryptochrome, se ha demostrado ser esencial para el brazo negativo del bucle de realimentación circadiano [15] , [16].
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las tres principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo [17]. CRC pacientes frecuentemente desarrollan metástasis de ganglios linfáticos durante las primeras etapas de la enfermedad. Durante las etapas avanzadas, la mayoría de los pacientes también desarrollan hígado, pulmón y metástasis peritoneo. Los factores implicados en la metástasis CRC son en gran parte desconocidos; sin embargo, la desregulación de los procesos moleculares se considera que resultará en el crecimiento y la metástasis de CRC. En consecuencia, la importancia de los marcadores que promueven el desarrollo de CRC se ha destacado, ya que podrían proporcionar dianas terapéuticas [18], [19].
Sin embargo, los estudios que evalúan las relaciones de expresión Cry1 a las características clínico-patológicas y los resultados en el cáncer colorrectal no han sido reportados. Nosotros, por lo tanto, evaluaron los niveles de expresión de Cry1 en tejidos de cáncer colorrectal humano y mucosa no tumoral emparejados y analizado la importancia clínica de expresión Cry1 pacientes inCRC. Nuestros datos demuestran que la expresión Cry1 se correlaciona significativamente con el estadio TNM y el estado de los ganglios linfáticos. Por lo tanto, Cry1 puede servir como un nuevo marcador diagnóstico y diana terapéutica para el tratamiento del CCR.
Materiales y Métodos
Pacientes y seguimiento
Ciento sesenta y ocho colorrectal pacientes con cáncer de todos los estadios TNM del Centro de cáncer de Sun Yat-sun Universidad entre septiembre de 1999 y diciembre de 2005 se incluyeron en el estudio. Diez pares de tejidos a partir de las 168 muestras se utilizaron para un ensayo de Q-PCR.
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Junta Institucional del Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-sen, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos de los pacientes.
los datos clínicos, incluyendo la edad, el sexo, el tamaño del tumor, localización del tumor, los niveles de antígeno carcinoembrionario (CEA preoperatorio) y antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9), se obtuvieron de los casos sin procesar informes.
parámetros patológicos, como la profundidad invasiva del tumor, grado de diferenciación histológica y el patrón se obtuvieron de los informes patológicos y verificados por los patólogos. Los pacientes fueron seguidos una vez cada tres meses durante los primeros dos años, una vez cada seis meses durante el tercer y cuarto años, y una vez al año después del quinto año de la intervención.
Todos los pacientes fueron contactados por teléfono para comprobar su estado de salud; la última fecha de seguimiento fue de 1 de marzo de 2012. La supervivencia libre de enfermedad (DFS) y supervivencia global (OS) veces se calcula a partir de la fecha de la operación a la metástasis o recurrencia fecha o la fecha de la muerte, ni la última vez censor.
cultivo de células
las líneas celulares de CRC humanos SW480, SW620, HCT116, HT29, la línea celular de riñón embrionario humano GP293 y la línea normal de las células del epitelio del colon FHC se obtuvieron de la American Type Culture Collection . Se obtuvieron las células THC8307 de nuestra propia colección de laboratorio. Las líneas celulares de CRC se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células FHC se cultivaron en DMEM: medio F12 que contenía 0,005 mg /ml de insulina, 10 ng /ml de toxina de cólera, 100 ng /ml de hidrocortisona y 0,005 mg /ml de transferrina y suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 estreptomicina ng /ml y 100 U /ml de penicilina. Todas las líneas celulares se cultivaron en una cámara húmeda con 5% de CO
2 y a 37 ° C.
Quantitative PCR con transcripción inversa
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol ® (DSBIO, Guangzhou, china) según las instrucciones del fabricante. ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de 2 g de ARN total usando M-MLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI). cDNA se amplificó por el ADN oro AmpliTaq® polimerasa (Applied Biosystems, Foster, CA) y cebadores específicos de genes. Se utilizaron los siguientes cebadores para Cry1, 5'-GAGTATGATTCTGAGCCCTTTG-3 '(hacia adelante), 5'-GGTTGTCCACCATTGAGT-3' (hacia atrás). GAPDH se utilizó como control interno.
análisis de Western Blot
proteínas celulares totales se extrajeron y se separaron en geles de SDS-PAGE y análisis Western Blot se realizó de acuerdo con procedimientos estándar. GAPDH se utilizó como control de carga en la misma membrana. Los anticuerpos primarios que se utilizaron incluyeron monoclonal anti-Cry1 (1:1000, Abcam, EE.UU.) y anti-GAPDH (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.). Las proteínas se visualizaron utilizando el procedimiento de ECL (Amersham Biosciences, EE.UU.).
transfección celular
La secuencia de codificación de Cry1 se amplificó y se clonó en el
NotI
y
BamHI
sitio de pcDNA3.1
+ para generar una pcDNA3.1
+ - Cry1 vector de expresión; La construcción resultante se confirmó mediante secuenciación. Cry1 siRNA (GCAAGAGAAUUUGCUUAAUTT) y el control de siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) se adquirieron de Shanghai Genepharma Co. Ltd. (Shanghai, China).
Para la transfección transitoria, las células SW480 (6 × 10
5 células por pocillo) y células HCT116 (5 × 10
5 células por pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos a 60% de confluencia y se transfectaron con 100 nM de oligonucleótidos o 4 mg de plásmido, utilizando Lipofectamine 2000 ((Invitrogen) de acuerdo con el fabricante de instrucciones. Después de 6 h de incubación a 37 ° C, el medio de transfección se reemplazó con 3 ml de medio completo que contenía 10% de FBS. las células se recogieron para ensayos de transferencia, proliferación y la invasión occidentales en diferentes momentos.
Retrovirus el embalaje y la transducción de
Cry1 y controlsequences se clonaron en el
Xho I y
Cla I
sitio de la pLNCX2 vector de retrovirus. embalaje virus se realizó en células de GP293. células GP293 se cultivaron en DMEM con 10% FBS en una incubadora a 37ºC con 5% de CO
2. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante se recogió por centrifugación a 1000 g durante 10 min. Las células HCT116 se transducidas con el retrovirus que contienen Cry1 o secuencias de control de plásmidos. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se añadió G418 (600 ug /ml) a los medios de comunicación durante 2 semanas para seleccionar las células estables infectadas con el retrovirus. Los ensayos de transferencia de Western se utilizaron para detectar la expresión de Cry1 en dos líneas celulares estables como se describe anteriormente
viabilidad de las células de ensayo
El 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il). - 2, se utilizó 5-bifenilo bromuro de tetrazolio (MTT) ensayo para detectar la proliferación celular. HCT116 células se sembraron en 96 pocillos a 1 × 10
3 células /pocillo. La absorbancia espectrofotométrica de cada muestra se midió a 490 nm. Todos los experimentos se repitieron tres veces, y se calcularon los resultados promedio.
Para el ensayo de formación de colonias, las células HCT116 (4 × 10
3 células por 10 cm
2 placa) que sobreexpresan GFP de control Cry1or y las células SW480 (5 × 10
3 células por 10 cm
2 de placa) las reguladas por la expresión de Cry1 de siRNA o un control negativo se sembraron en medio completo. Las células fueron cultivadas durante 14 días a 37 ° C en 5% de CO
2 humidificadores de aire. La formación de colonias y el crecimiento se visualizaron por tinción con cristal violeta. El número de colonias que contienen & gt; se determinaron 50 células, y se contaron 12 campos
in vitro
la migración de ensayo
La capacidad de migración de las células se midió en transwell cámaras. (8 poros micras; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). La cámara inferior se llenó con 700 l de DMEM que contiene 10% de FBS. Para el ensayo de migración, las células tumorales (1 × 10
5 células en un volumen total de 200 l) se colocaron en la cámara superior y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 de aire humidificado. Después de 24 h se cultivó, las células en la superficie superior de la membrana no migración fueron retirados, y las células que migraron al lado inferior de la membrana de policarbonato se fijaron con etanol y se tiñeron con cristal violeta durante 10 minutos. Después se determinó el número de células que migran a partir de 5 campos microscópicos independientes. La media de los ensayos por triplicado para cada condición experimental se utilizó para el análisis.
ensayo inmunohistoquímico
La expresión de Cry1 en tumores primarios y en la mucosa colorrectal no canceroso adyacente se examinó usando un ensayo inmunohistoquímico. El ensayo inmunohistoquímico se realizó dentro de los cinco días de preparación sección. secciones de parafina se cortaron a un espesor de 4 um y se montaron en portaobjetos silanizados. Las secciones fueron desparafinados, rehidratada y se bloquearon con peróxido de hidrógeno 0,3%. antígenos de tejido fueron recuperados con microondas horno a 95 ° C durante 25 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente en 10 tampón mmol /citrato de sodio (pH 6,0). Después, cada rodaja se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante la noche a 4 ° C con Cry1 (1:400, ab54649 clon, Abcam, Cambridge, UK). Los anticuerpos primarios se diluyeron mediante la reducción de fondo los componentes (S2022, Dako, Glostrup, Dinamarca). El anticuerpo secundario se utilizó con el Kit de detección de Envision (Dako). Los portaobjetos se tiñeron durante 2 min con diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) y después de contraste con hematoxilina. Tejido tratado con la solución de dilución de anticuerpo se utilizó como control negativo. Todos los controles dieron resultados satisfactorios.
Evaluación de la tinción
Los especímenes fueron evaluados por dos investigadores, que no estaban al tanto de la evolución clínica y que se examinaron de forma independiente los portaobjetos teñidos. Cada diapositiva se evaluó con un microscopio a 200 × magnificación. La expresión de Cry1 se evaluó usando H-resultados. El H-resultados consistieron en una evaluación de la intensidad de la tinción y el porcentaje de la zona de tinción que tiene una intensidad dada. Sólo se evaluaron las células malignas teñidas. Las muestras se agrupan en las siguientes cuatro categorías en función de la intensidad de la tinción nuclear: ninguno (0), débil (1), media (2) y fuerte (3). La suma indexada se obtuvo multiplicando el grado de intensidad por el porcentaje de área de tinción
.
El nivel de expresión Cry1 se dicotomizó acuerdo con SLE y la SG por una curva ROC. El valor de corte de la tasa positiva fue la suma maximizado de los puntos de sensibilidad y especificidad.
En vivo
ensayos de proliferación
Mujer atímicos BABL /c ratones nude ( 4-5 semanas de edad) fueron adquiridos de la Animal Medical Center provincia de Guangdong (Guangdong, china). Se llevaron a cabo todos los estudios en animales conformidadconlos con useguidelines animales NIH y las regulaciones chinas actuales y standardson el uso de animales de laboratorio. Para determinar la capacidad de proliferación de la célula linesstably alta expresión Cry1
in vivo
, un total de 1 × 10
se inyectaron 6 células por vía subcutánea en la izquierda de ratones desnudos y el grupo de control negativo se inyectaron en el derecho (n = 9). Se evaluó el volumen del tumor utilizando la fórmula siguiente:. tumorvolume = 4π /3 × (anchura /2)
2 × (/2 de longitud) .Cuatro semanas después de la inyección, los animales fueron sacrificados
El análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± SEM a menos que se indique lo contrario. Se utilizó un emparejado
t
prueba para la prueba de las diferencias en la expresión entre el tumor Cry1 emparejado y mucosa benigna. La significación estadística de los
in vitro
estudios in se analizó utilizando Estudiante de
t-test
. log-rank pruebas de la igualdad de los sobrevivientes de Kaplan-Meier y se utilizan para dibujar las curvas de supervivencia de alta versus baja puntuación Cry1 IHC (según la definición de la curva ROC). Todos los
p
valores fueron de dos caras, y
P Hotel & lt; 0,05 era el nivel de significación estadística. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS paquete de software, versión 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Características de los pacientes y tumores
Un total se estudiaron de 168 pacientes que recibieron resección radical entre enero de 1999 y diciembre de 2005. Las características de los pacientes se resumen en la Tabla 1. La edad media de los pacientes fue de 54,6 años (DE, 14,3). La duración mediana de seguimiento fue de 84 meses (rango de 4 a 146). Ochenta y cinco tumores (50,6%) se localizaron en el colon. Diez de los 168 tumores (6,0%) eran T1 o T2. Noventa y cuatro tumores fueron TNM en estadio I-II (56.0.0%). La mediana del número de ganglios linfáticos cosechados fue 19 (rango de 0 a 48). proteínas Cry1 niveles de expresión se utilizaron para el análisis inmunohistoquímico. Cry1 estaba manchada principalmente en el citoplasma y regiones nucleares de las células. Se detectó alta expresión de la proteína Cry1 en 101 muestras (60,1%) y se observó tinción débil o negativa en 67 muestras de tumores (39,9%, Figura 1).
inmunohistoquímicos imágenes representativas de las muestras de tejido de cáncer colorrectal que indica negativo o débilmente tinción Cry1 detectable (A y B); tinción Cry1 moderada (C); y se muestran fuerte tinción Cry1 (D). El aumento es x 200 (A, B, C y D).
Cry1 se sobreexpresa en tejidos de cáncer colorrectal
Cry1 expresión de mRNA en el cáncer colorrectal se investigó mediante RT- PCR; Los análisis de Cry1 ARNm fueron ejecutados en diez parejas de muestras de cáncer colorrectal y muestras de tejidos cancerosos adyacentes. Cry1 mRNA se expresó a niveles más altos en ocho de las muestras de tejido de cáncer colorrectal que en los tejidos no cancerosos adyacentes. La alta expresión diferencial varió de 1,1 veces a 13,1 veces (Figura 2D). De acuerdo con estos datos, la proteína Cry1 también subió regulada en el cáncer colorrectal en comparación con las muestras de tejido de control emparejados (Figura 2A-C).
se muestra (A) Una imagen representativa de la tinción Cry1 en tejidos de cáncer colorrectal. se muestra (B) Una imagen representativa de la tinción de tejidos cancerosos Cry1 en adyacentes. (C) Cry1 nivel de expresión de la proteína fue mayor en los tejidos tumorales en comparación con tejidos de control adyacente como se detectó por inmunotransferencia (media ± SEM, n = 109; * **,
P Hotel & lt; 0,001). (D) Normal T /N proporciones de Cry1 la expresión de ARNm en el cáncer colorrectal emparejado (T) y los tejidos normalmucosa (N) se cuantificaron por qPCR y normalizado para GAPDH. Las barras de error representan la desviación estándar de la media (SD) calculado a partir de tres experimentos paralelos. La ampliación es × 200.
Asociación entre la expresión Cry1 y variables clínico
La asociación de expresión y clinicopathological variables de Cry1 se analizó adicionalmente. expresión Cry1 y todos los otros parámetros clínico se dicotomizaron en dos grupos. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Hubo una correlación significativa entre la expresión Cry1 y tanto el estadio TNM (
p
= 0,003) y el estado de los ganglios linfáticos (
p
= 0,004).
entre los 168 pacientes con cáncer colorrectal, no se encontró correlación significativa entre la expresión Cry1 y el género, la edad, la ubicación de la masa primaria, el tamaño del tumor, grado de diferenciación del tumor, el tipo histológico, preoperatoria CA 19-9 o el nivel de CEA (
p
& gt;. 0,05)
Asociación entre la expresión y la supervivencia Cry1
La aplicación de expresión Cry1 como un marcador pronóstico de los pacientes con CCR también fue investigado. Al final del período de seguimiento (1 de marzo de 2012), 32 pacientes habían muerto a causa de enfermedades relacionadas con el cáncer colorrectal. La tasa de supervivencia a cinco años de SSE fue de 74,7% para el grupo de alta expresión Cry1. Esta tasa fue significativamente más baja que la tasa de supervivencia (89,1%) para el grupo de baja expresión (
p = 0,011
). Del mismo modo, la tasa de supervivencia a cinco años de SG fue de 77,6% en el grupo de alta expresión Cry1 y el 92,3% en el grupo de baja expresión (
p = 0,010
) (Tabla 2 y Figura 3).
Las curvas de Kaplan-Meier con el análisis univariado (log-rank) para los pacientes con cáncer colorrectal con alta expresión Cry1 (n = 101) en comparación con la expresión baja o nula Cry1 para la supervivencia global (n = 67) (a) y libre de enfermedad supervivencia (n = 67) (B) se muestran. De la expresión de Cry1 correlacionó positivamente con los patientoutcomes pobres.
Cry1 es altamente expresado en la mayoría de las líneas celulares de CRC
Para investigar el papel potencial de Cry1 en la tumorigénesis de cáncer colorrectal, se determinó la expresión de ARNm y proteínas Cry1 para cinco líneas celulares (CRC SW480, HT29, SW620, HCT116 y THC8307) y una línea celular de epitelio de colon normal, FHC. expresión Cry1 mRNA fue como máximo 10 veces mayor en las líneas celulares de cáncer colorrectal que en las células FHC (Figura 4A). proteínas Cry1 fue altamente expresado en las líneas celulares de cáncer colorrectal y sólo débilmente expresado en las células FHC (Figura 4B).
La expresión de cry1 ARNm y proteínas en líneas celulares de cáncer colorrectal (SW480, SW620, HT29, THC8307, y HCT116) y FHC fueron examinados por qPCR (A) y transferencia Western (B). Los niveles de expresión se normalizaron a GAPDH. Las barras de error representan la desviación estándar de la media (SD) calculado a partir de tres experimentos paralelos, *,
P Hotel & lt; 0,05
Cry1 promueve el crecimiento y la proliferación tumoral
a continuación, se investigaron los efectos de la manipulación Cry1 (a través de ganancia de función y pérdida de función) sobre la proliferación de células cancerosas.
exógenamente sobreexpresa Cry1 en las células HCT116, que tienen una una menor expresión endógena. a continuación, se evaluó el impacto de Cry1 sobre la proliferación celular usando MTT y ensayos por clonación. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de Cry1 puede promover la proliferación celular en las células HCT116 transfección instantáneo (
p
& lt; 0,001, Fig 5B.). En contraste, el grupo control no mostró ningún efecto significativo sobre la proliferación celular. Los ensayos de formación de colonias también mostraron que la sobreexpresión de Cry1 aumentó significativamente el número de colonias formadas después de 14 días de cultivo en comparación con las células de control (
p
= 0,033, Fig. 5C, D). El vínculo entre Cry1 y el crecimiento celular del cáncer colorrectal, se comprobó mediante ensayos de formación de colonias después de Cry1 caída. Como se muestra en la figura 5E y 5F, desmontables de expresión Cry1 endógeno mediante siRNA resultó en una inhibición de la formación de dramático clon de células SW480 (
p = 0,007)
(A) Cry1 niveles de proteína se upregulated en células HCT116 y downregulated en las células SW480. (B) ensayos de MTT en las células HCT116 24, 48, y 72 h después de la transfección con Cry1 o control GFP (***, p & lt; 0,001). (C-D) ensayo de formación de colonias de células HCT116 transfectadas con Cry1 o control GFP (*,
p = 0,033
). (E-F) La inhibición de la SW480 capacidad de formación de colonias de células por Cry1 siRNA relación al control (**,
p
= 0,007). Los experimentos se repitieron al menos tres veces, y se presentan datos representativos;
bares, SD *,
P
. & Lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01, ***,
p
. & Lt; 0,001
Cry1 promueve themigration de células de cáncer colorrectal
en cuanto a la expresión Cry1 se asoció con el estado de los ganglios linfáticos, el efecto de Cry1 sobre la migración de células de cáncer colorrectal se exploró utilizando el ensayo transwell para examinar los efectos de la sobreexpresión o supresión Cry1. En los ensayos de transwell, las células HCT116 transfectadas con plásmidos Cry1 o de control GFP fueron sembradas en las cámaras, y su potencial de migración se determinó 24 h después de la transfección. Los ensayos mostraron que la capacidad de migración de las células HCT116 que sobreexpresan Cry1 se incrementó en un 112% en comparación con las células control (
p = 0,019
, Fig. 6A).
(A) ensayos de migración de células HCT116 transfectadas con Cry1 o control GFP. (N = 3, *,
p = 0,019
) (B) ensayos de migración de las células SW480 transfectadas con siRNA-Cry1 o un control negativo. (N = 3, ***,
p Hotel & lt; 0,001). Imágenes representativas se muestran anteriormente, y el número medio de células por campo en los puntos de tiempo indicados se muestran a continuación. Los datos son la media de tres experimentos independientes.
Confirmación de que Cry1 promovió la migración de células de cáncer colorrectal se evaluó mediante la transfección de células SW480 con Cry1-siRNA o siRNA negativo. Después de 24 horas de cultivo, la capacidad de migración de las células knock-down Cry1 SW480 se redujo en un 52,4% en comparación con las células control (
p
. & Lt; 0,001, figura 6B).
cry1 promovió el crecimiento CRC
in vivo
Para investigar más a fondo las propiedades oncogénicas de cry1
in vivo
, se construyó un vector de retrovirus overexpressingCry1 y establecieron dos líneas celulares estables, que eran llamado ctrl-HCT116 y Cry1-HCT116 (Fig. 7A). Estas dos líneas celulares fueron injectedsubcutaneously en los flancos de ratones desnudos. La progresión tumoral se estudió con el tiempo. En 4 semanas después de la implantación, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tumores. Como shownin Fig. 7B-C, el volumen y el peso de los tumores resultantes de la inyección de las células HCT116-Cry1 eran significativamente más grandes y más pesados que los originado a partir de las células HCT116-ctrl. Takentogether, estas observaciones son consistentes con los
in vitro
resultados e indican que Cry1 tiene la capacidad de promover el crecimiento celular CRC
in vivo
.
(A) La expresión de cry1 se incrementó notablemente en la línea celular estable cry1-HCT116 en comparación con un control estable la línea celular HCT116-ctrl. GAPDH se utilizó como control interno. (B) Imágenes representativas de tumores derivados de Cry1-HCT116 o ctrl-HCT116, siguientes trasplantes de xenoinjertos subcutáneos en ratones desnudos (C) La sobreexpresión de Cry1 promovió el crecimiento del cáncer colorrectal. Se inyectaron células tumorales por vía subcutánea en ratones desnudos. Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas, y el volumen de cada tumor se midió cada 4 días. Bares, ± SEM; *
P Hotel & lt; 0,05, **
p = 0,01
Discusión
Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que. evaluar los niveles de expresión de proteínas de Cry1 en el cáncer colorrectal humano. Claramente, la expresión Cry1 fue mayor en los tejidos y las células cancerosas que en las células y tejidos normales. También se ha estudiado la relación entre los niveles de expresión de Cry1 a los resultados del paciente y las características clínico-patológicas. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión del gen Cry1 podría ser un predictor útil de metástasis en los ganglios linfáticos, el estadio TNM y malos resultados en pacientes con cáncer colorrectal.
Varios estudios previos han comparado los niveles de expresión de Cry1 entre el tejido canceroso y adyacentes mucosa normal. Un estudio encontró que Cry1 y otros niveles de mRNA expresión de genes circadianos (Cry2, Per2 y BamlI) fueron similares en el cáncer de colon y la mucosa normal adyacente [20]. Otro estudio encontró que los niveles de expresión de ARNm de Cry2 y Per2 estaban regulados en el cáncer colorrectal. Este estudio también encontró mayor expresión Cry1 en la mucosa tumoral de los cánceres colorrectales ubicados en segmentos distales. Cry1mRNA niveles en los tejidos de CRC también se asociaron significativamente con la edad y sexo del paciente [21]. En el cáncer de ovario epitelial humano, Cry1 nivel de expresión mRNA fue claramente superior en los tejidos cancerosos que en los tejidos normales [22]. Nuestros resultados están en desacuerdo parcial con estos estudios. En nuestro estudio, la proteína del gen Cry1 niveles de expresión fueron mayores en los tejidos cancerosos que en el tejido canceroso adyacente. Los mismos resultados se encuentran en las células de tumor colorrectal y células normales, y se encontró que la sobreexpresión de Cry1 para promover el crecimiento y la migración en las células tumorales colorrectales. Sin embargo, no se encontró correlación significativa entre la expresión Cry1 y el género, la edad, la ubicación de la masa primaria, el tamaño del tumor, grado de diferenciación del tumor, el tipo histológico, CA 19-9 preoperatoria o nivel de CEA (
p Hotel & gt; 0,05). Estos resultados parecen ser razonables por la siguiente razón. Cry1 niveles de expresión de proteínas pueden ser incompatible asociadas con los niveles de expresión de mRNA de estos factores ambientales. Sin embargo, las proteínas juegan el papel más importante en los efectos biológicos, y que detectan la expresión de proteínas en los tejidos de Cry1 CRC.
También examinamos las relaciones de expresión Cry1 con características clínico-patológicos y resultados de los pacientes. Los niveles de proteína Cry1 se asociaron significativamente con la etapa AJCC /TNM (con los más altos niveles detectados en TNM estadios III-IV) y la afectación ganglionar (con los más altos niveles detectados en el caso de los ganglios linfáticos positivos). genes circadianos han sido implicados en la regulación del ciclo celular [23]. ratones mutantes Cry1 tienen un nivel elevado de Wee1 en muchos tejidos, incluyendo el hígado. Wee1 bloquea la división celular mediante la inhibición de la quinasa de la transición G2-M. Alta expresión Cry1 puede inhibir la capacidad de Wee1 para promover la proliferación celular, proporcionando de esta manera una ventaja de supervivencia para CRC [24] .Por otra parte, la proteína Cry1 se conoce para formar complejos con la adenilato ciclasa, y la sobreexpresión de Cry1 reduce la producción de cAMP en respuesta a PGE2, isoproterenol, e incluso el activador de la adenilato ciclasa directa, forskolina [25]. Los estudios han informado de que altas concentraciones de cAMP pueden inhibir la migración y metástasis de las células de cáncer de próstata humanos. PKA es una quinasa de proteína que está relacionada con la vía de señalización cAMP. Los estudios han sugerido que la PKA inhibe la actividad y la función de RhoA [26], [27]. RhoA es un miembro clave de la familia Rho de pequeñas proteínas de unión a GTP y media la señalización relacionada a disposición del citoesqueleto, la migración, la proliferación y la expresión de genes [28], [29], [30]. Estudios previos han encontrado que el crecimiento invasivo y la metástasis fueron reprimidos en una variedad de células cancerosas (incluyendo las células CRC) cuando se inhibió la actividad de RhoA [26], [31]. Los resultados actuales sugieren que una vía mediada Cry1-cAMP /PKA-RhoA está implicada en la migración y la metástasis de CRC.
Nuestros datos de inmunotinción de acuerdo con estos estudios. Superior estadio TNM y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos se correlacionaron significativamente con los niveles más altos de expresión Cry1, lo que sugiere que Cry1 se puede utilizar como un marcador para determinar la progresión de la CRC.