Extracto
El cáncer de próstata es un problema de salud importante para los hombres en las sociedades occidentales. Aquí mostramos un cáncer prostático específico de mutagénesis dirigida;-Viro-Terapia (CTGVT-PCA), en el cual PTEN se insertó en un vector viral oncolítico DD3 controlado (OV) para formar Ad.DD3.E1A.E1B (Δ55) - ( PTEN) o, brevemente, Ad.DD3.D55-PTEN. El elemento de post-transcripcional de la marmota (WPRE) también se introdujo en la corriente abajo de la secuencia de codificación de E1A, lo que resulta en mucho más alto de expresión del gen E1A. DD3 es uno de los genes más próstata específicos de cáncer y se ha utilizado como un marcador clínico bio-diagnóstico. PTEN es frecuentemente inactivado en los cánceres de próstata primarios, lo cual es crucial para la progresión del cáncer de próstata. Por lo tanto, la Ad.DD3.D55-PTEN tiene efecto antitumoral específica y potente del cáncer de próstata. La tasa de crecimiento del tumor se inhibió casi completamente con el volumen final del tumor después del tratamiento Ad.DD3.D55-PTEN menor que el volumen inicial en el comienzo del tratamiento Ad.DD3.D55-PTEN, que muestra el potente efecto antitumoral de Ad.DD3 .D55-PTEN sobre el crecimiento tumoral del cáncer de próstata. El CTGVT-CP constructo informó aquí mató a todos las líneas celulares de cáncer de próstata probados, tales como DU145, 22Rv1 y CL1, pero había un tipo reducido o sin efecto letal en todas las líneas celulares de cáncer de próstata no probadas. El mecanismo de acción de Ad.DD3.D55-PTEN era debido a la inducción de apoptosis, tal como se detecta mediante ensayos de TUNEL y citometría de flujo. La apoptosis fue mediada por las vías de las mitocondrias-dependientes e independientes del, según lo determinado por ensayos de caspasa y potencial de membrana mitocondrial
Visto:. Ding M, Cao X, Xu Hn, Ventilador Jk, Huang Hl, Yang Dq, et Alabama. (2012) El cáncer de próstata-específico y potente efecto antitumoral de un
DD3
controladas por virus oncolítico que alberga el
PTEN
génica. PLoS ONE 7 (4): e35153. doi: 10.1371 /journal.pone.0035153
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Septiembre, 2011; Aceptado: 9 Marzo 2012; Publicado: 11 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Ding et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Pro_ram) (núm 2010CB529901) (X. Liu), Ciencia & amp Importante Nacional; Tecnología del proyecto específico de la hepatitis y el programa relacionado con hepatoma (2008ZX10002-023) (X. Liu), Programa de Innovación Nueva (2009-ZX-09102-246) (X. Liu), la concesión de Zhejiang Universidad de Sci-Tech (1.016.834-Y) , el Programa Nacional de Investigación básica de China (2009CB941704) (R. Li), el Comité Municipal de Shanghai de la Ciencia y la Tecnología (09140903200, 09DJ1400400, 08140901700 y 06ZR14072) (R. Li). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es un problema de salud importante para los hombres en las sociedades occidentales. Cada año, aproximadamente 230.000 hombres estadounidenses son diagnosticados con cáncer de próstata y cerca de 30.000 mueren a causa de esta enfermedad [1], [2]. El mejor tratamiento disponible para los pacientes con la enfermedad avanzada es la terapia de ablación de andrógenos, basado en las observaciones de Huggins y Hodges [3] que el cáncer de próstata clínico está bajo la influencia trófica de las hormonas masculinas. La regresión del tumor y la mejora de los síntomas clínicos son temporales y la enfermedad avanza inevitablemente a un estado independiente de andrógenos. Actualmente, no hay tratamiento curativo está disponible para los cánceres de próstata andrógeno-independiente.
Bio-terapia ofrece una atractiva oportunidad para dirigirse a los cánceres de próstata andrógeno-independiente. A diferencia de la quimioterapia tradicional, que puede ser diseñado y personalizado para dirigirse específicamente a los cánceres de acuerdo a nuestra comprensión de la enfermedad a nivel molecular. El vector adenoviral se ha utilizado como un vehículo de transferencia para introducir genes en las células de cáncer debido a que es más eficiente que los métodos de transferencia de genes no virales [4], [5]. El vector adenoviral es estable
in vivo
, dicta eficientemente genes a las células, tanto que no se dividen y divisoria y rara vez causa enfermedad en sí misma significativa [6], [7]. Sin embargo, el adenovirus tradicional utilizado para la terapia génica es un uno de replicación deficiente con bajo nivel de expresión del gen terapéutico. la replicación específica del cáncer del vector oncolítico, por lo tanto, es absolutamente necesario para evitar estos problemas. Dos estrategias principales se han utilizado para construir un replicativa y adenovirus oncolítico específica del cáncer. El primero es para eliminar el elemento viral que es necesaria para la replicación del virus en las células normales, que no se requiere en las células tumorales. Por ejemplo, el gen E1B-55K, que fue suprimida en los virus oncolíticos ONYX-015 y ZD55 [8], [9], [10], es necesaria para la replicación viral en las células normales, pero es prescindible en las células cancerosas por una adecuada mecanismos. La segunda estrategia es reemplazar el promotor de un gen clave en la replicación del adenovirus, tal como el gen E1A o E1B, con un promotor específico de tumor [11], [12]. Por lo tanto, el virus oncolítico es muy replicarse cuando se activa el promotor.
Para superar las limitaciones de la terapia génica tradicional con una replicación deficiente vector adenoviral, un cáncer de mutagénesis dirigida;-Viro-Therapy (CTGVT) fue construido por la inserción de un gen anti-tumor en un vector viral oncolítico de doble objetivo (OV). En realidad, es un OV-gen, y tiene mucho mejor efecto antitumoral que la de cualquiera de terapia génica sola o virotherapy solo. El propio virus oncolítico tiene poder anti-tumor y selectivamente replica varios cientos de veces en las células tumorales y, por tanto, los genes terapéuticos también debe ser selectivamente replicado varios cientos de veces en las células tumorales [11]. Mediante la integración de manera innovadora terapia génica y viro-terapia, el efecto anti-tumor de la CTGVT es generalmente mucho mayor que cualquiera de los métodos solo. El 27 de enero de 2011, Amgen pasó de 1 mil millones de dólares para la compra de OncoHSV-GM-CSF (un virus oncolítico del Herpes Simplex Virus-1), que está en fase III para el melanoma avanzado [13], [14], lo que subraya la importancia y potencial de la estrategia CTGVT.
en este estudio, se generó por primera vez un adenovirus de doble regulada, Ad.DD3.D55, en el que el gen E1A está bajo el control de los
DD3
promotor y se ha eliminado el gen E1B-55K.
DD3
es uno de los genes más específicos para el cáncer de próstata, y ha sido utilizado como un biomarcador clínica para el cáncer de próstata [15]. Curiosamente, un fragmento de 214 pb del promotor central DD3 tiene una alta actividad de promotor [16], y por lo tanto se utiliza para controlar la expresión de E1A en el adenovirus oncolítico. Dado que la expresión DD3 está muy restringido en el cáncer de próstata, se utilizó previamente el promotor mínimo DD3 para conducir la expresión de E1A para la generación de un virus oncolítico [17]. El nivel de expresión E1A promotor impulsado DD3 era insuficiente, por lo tanto, WPRE se introdujo para mejorar la expresión del gen E1A en este estudio. WPRE promueve la expresión de genes en un promotor-y la línea celular dependiente de manera [18]. WPRE se ha explotado como un potenciador de la expresión transgénica mediante la mejora de la exportación nuclear de un ARN mensajero aberrante retenido desde el núcleo hasta el citoplasma [19]. Además,
PTEN
es un conocido gen supresor tumoral que codifica una proteína fosfatasa [20]. Su supresión se ha observado en el cáncer de próstata de grado alto y es muy importante para la progresión del cáncer de próstata [21]. En este estudio,
PTEN
con un promotor de CMV se insertó en Ad.DD3.D55 para formar Ad.DD3.D55-PTEN, que tiene un cáncer de próstata de replicación y el gen de especificidad antitumoral especificidad. Ad.DD3.D55-PTEN induce eficazmente la apoptosis en células de cáncer de próstata, la eliminación de xenoinjertos de cáncer de próstata con mayor eficacia antitumoral.
Resultados
actividad transcripcional del cáncer de próstata-específico de la DD3 Promotor y el efecto citopático de Ad.DD3.D55
la actividad promotora mínima DD3 en ausencia de WPRE se midió por la expresión de luciferasa-reporter, que mostró el promotor mínimo DD3 típicamente exhiben mucha más actividad en las líneas celulares de cáncer de próstata que en otro líneas celulares. El control pGL3, que contiene el promotor SV40 y el potenciador, se utilizó como control positivo (actividad = 1000). Como se muestra en la Figura 1A, la expresión impulsada por el
DD3
promotor con WPRE fue mucho mayor en LNCaP y 22Rv1 que en otras células, incluyendo las líneas celulares de cáncer de próstata DU-145, PC3 y CL1. Aunque no hubo diferencias en los niveles de expresión en estas líneas celulares de próstata, estos resultados indican que WPRE podría mediar la mejora de la expresión génica y mantener la actividad relativamente restringida del promotor DD3 en líneas celulares de próstata.
A. La actividad de la luciferasa del promotor DD3 en presencia de WPRE se expresa en comparación con el control pGL3 (actividad = 1000). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos. Cuarenta y ocho horas después de la infección con el reportero plásmidos pGL3-control o pGL3-DD3-WPRE, se recogieron las células, y se midió la actividad de luciferasa. La actividad de pGL3-DD3-WPRE en relación con el control pGL3 se presenta como la media ± desviación estándar (DE) de tres transfecciones. B. La expresión de E1A por Ad.DD3.D55 (sin WPRE) y Ad.DD3.D55 en diferentes líneas celulares se evaluó. a-tubulina se evaluó como control de carga. C. Crystal ensayo de violeta. Las células en placas de 24 pocillos se infectaron con el virus diferentes a las MOI se indica. La citotoxicidad se observó por tinción con cristal violeta a los cinco días después de la infección.
Hemos construido un nuevo virus oncolítico, Ad.DD3-E1A.E1B (Δ55), brevemente Ad.DD3.D55 (Fig. 2A ), que es un adenovirus de doble regulados en los que el promotor nativo de E1A se ha sustituido por la mínima
DD3
promotor y el gen E1B-55K ha sido eliminado. El efecto citopático del Ad.DD3.D55 se evaluó en células normales y tumorales por tinción con violeta cristal (Fig. 1B). En líneas celulares de cáncer de próstata DU145 y 22Rv1, la citotoxicidad de Ad.DD3.D55 era comparable al adenovirus-regulada única Ad.DD3 y Ad.D55. Por el contrario, en la célula de cáncer de próstata no BEL-7404 y T24, el efecto citopático del Ad.DD3.D55 y Ad.DD3 fue mucho más baja, lo que indica que el cáncer de próstata de la especificidad de la citotoxicidad ejercida por Ad.DD3.D55 era mucho más mejorado.
A. diagrama esquemático de Ad.DD3.D55-PTEN. El promotor endógeno de E1A fue sustituido por el promotor DD3, y se eliminó el gen E1B-55K. El
PTEN
casete de expresión se insertó en Ad.DD3.D55 para construir Ad.DD3.D55-PTEN. ITR, repetición terminal invertida. B. Caracterización de Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 y expresión Ad.DD3.D55-PTEN por análisis de transferencia Western. Se evaluó la expresión de PTEN, E1A y E1B-55K por Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 o Ad.DD3.D55-PTEN en las células CL1. Ad.WT se utilizó como control positivo. a-tubulina se evaluó como control de carga. C. Los niveles de mRNA relativa de
PTEN Opiniones y E1A en 22Rv1 células infectadas con Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 y Ad.DD3.D55-PTEN. GAPDH se evaluó como una referencia interna. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. El análisis de transferencia Western de D. total y fosforilados los niveles de proteína Akt en células infectadas con CL1 Ad.DD3.D55 y Ad.DD3.D55-PTEN. E. Análisis de secciones de tumor derivadas de tumores tratados con PBS o uno de varios adenovirus por hematoxilina y eosina y hexon y inmunotinción PTEN. Barra de escala, 100 micras.
A continuación, se midieron los niveles de expresión de E1A en las diferentes células infectadas con Ad.DD3.D55 (con WPRE) o Ad.DD3.D55 (sin WPRE) (Fig. 1C), respectivamente. La expresión de E1A fue más fuerte en las células 22Rv1 entre todas las líneas celulares ensayadas, y no cambió significativamente en presencia de WPRE. Sin embargo, la introducción de WPRE efectivamente había aumentado los niveles de expresión de E1A en la línea celular de cáncer de próstata incluyendo varios CL1, LNCaP, PC3 y DU-145. Además de ello, los datos demostraron que la introducción de WPRE no afectó significativamente la expresión restringida de E1A impulsado por el promotor DD3 en células de cáncer de próstata, proporcionando una sólida pieza de pruebas que corroboren que WPRE es un candidato prometedor para la construcción de un adenovirus oncolítico para apuntar el cáncer de próstata las células.
Construcción y caracterización de Ad.DD3.D55-PTEN
el
PTEN
casete de expresión se introdujo en el DD3 control de doble Ad.DD3.D55 regulados por el adenovirus para generar Ad.DD3.D55-PTEN (Fig. 2.A). Los niveles de expresión de PTEN y E1A en diferentes células infectadas por el virus CTGVT se determinaron mediante transferencia Western después de infectar la línea celular de cáncer de próstata humano CL1 (Fig. 2B). El adenovirus de replicación deficiente Ad-PTEN con la región E1 y de la eliminación del adenovirus de doble regulado Ad.DD3.D55 se utilizaron como controles. Como era de esperar, los virus de doble regulada Ad.DD3.D55 y Ad.DD3.D55-PTEN expresan la proteína E1A en aproximadamente los mismos niveles que hizo Ad.WT y dejado de expresar la proteína E1B-55K. Se obtuvieron resultados similares cuando la expresión de proteínas se midió a nivel del ARNm por PCR en tiempo real (Fig. 2C). Para caracterizar la función de PTEN en Ad.DD3.D55-PTEN, los efectos de su expresión en el estado de fosforilación de Akt se examinaron mediante transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 2D, la infección por el virus oncolítico condujo a un aumento en la expresión de fosfo-Akt, que era detectable tan pronto como 24 h después de la infección. Además, la expresión de PTEN inhibe la fosforilación de Akt en su residuo de activación (Ser473) sin disminuir los niveles totales de proteína Akt en comparación con el Ad.DD3.D55 vector. Estos resultados son consistentes con la actividad fosfatasa de lípidos de PTEN. Para caracterizar adicionalmente los virus
in vivo
, los niveles de la hexon proteína viral y el gen terapéutico
PTEN
se midieron en muestras de tumores 7 días después de la inyección de los virus. Como se muestra en la Figura 2E, se observaron altos niveles de hexon en los grupos Ad.DD3.D55 y Ad.DD3.D55-PTEN. La expresión del gen terapéutico
PTEN
fue también midió en estas muestras de tumor. Las muestras infectadas con Ad-PTEN y Ad.DD3.D55-PTEN muestran altos niveles de expresión de PTEN, pero
PTEN
expresión no se observó en el grupo tratado con Ad.DD3.D55.
La citotoxicidad específica para el cáncer de próstata de Ad.DD3.D55-PTEN
in vitro
La citotoxicidad de Ad.DD3.D55-PTEN se evaluó mediante el ensayo de MTT en líneas celulares de cáncer de próstata tres CL1, LNCaP, DU145, 22Rv1, PC3 y dos líneas celulares de cáncer de próstata no T24 (línea celular de carcinoma de vejiga urinaria humana) y Bel-7404 (línea celular de cáncer de hígado humano). Los resultados mostraron que el crecimiento de células de cáncer de próstata infectadas eran mucho inhibido con diferente grado, mientras que se observó la mayor eficiencia de la inhibición por Ad.DD3.D55-PTEN en las células LNCaP y células CL1 (Fig. 3A). Estos datos también mostraron que la citotoxicidad de Ad.DD3.D55-PTEN es significativamente mayor que la de Ad.DD3.D55. Sin embargo, ambos virus mostraron ser incapaces de inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata no significativamente (Fig. 3A).
A. ensayo de MTT. Las seis líneas celulares indicadas anteriormente se sembraron en placas de 96 pocillos y se infectaron con diferentes virus a una MOI de 10. La viabilidad celular se midió por ensayos de MTT en post-infección 0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas. Los resultados se presentan como la media ± SD de cinco experimentos independientes y se expresan como el porcentaje relativo a las células de control tratados de forma simulada. B. Crystal ensayo de violeta. Las células en placas de 24 pocillos se infectaron con el virus diferentes a las MOI se indica. La citotoxicidad se observó por tinción con violeta cristal a los cinco días después de la infección.
La citotoxicidad de Ad.DD3.D55-PTEN también se analizó por tinción con cristal violeta como se muestra en la Figura 3B. Ad.DD3.D55-PTEN tuvo un fuerte efecto citotóxico sobre las células de cáncer de próstata. células LNCaP y células CL1 eran más sensibles a la citotoxicidad ejercida por Ad.DD3.D55-PTEN que eran DU-145 y 22Rv1 células. Sin embargo, se observó poca o ninguna citotoxicidad en líneas celulares de cáncer no prostático, tales como líneas celulares normales T-24, BEL-7404, y, HFL-I y BEAS-2B. Estos resultados indican que la citotoxicidad de Ad.DD3.D55-PTEN no sólo era mucho más fuerte que la de Ad.DD3.D55 debido a la expresión de
PTEN
, pero también fue altamente restringida a las células de cáncer de próstata.
Ad.DD3.D55-PTEN induce la apoptosis en células de cáncer de próstata
in vitro
Estamos manchados con células Hoechst33258 para analizar aún más la capacidad inductora de apoptosis de Ad.DD3 .D55-PTEN
in vitro
. Como se muestra en la Figura 4A, Ad.DD3.D55-PTEN induce apoptosis significativa en CL1 y 22Rv1 células. Sin embargo, incompetente para la replicación de Ad-PTEN y Ad.DD3.D55 doble regulado exhibieron una capacidad marginal para inducir apoptosis. La citometría de flujo se realizó en la que las células muertas fueron representados por la fracción de células en la fase sub-G1. La infección con Ad.DD3.D55-PTEN aumentó el número de células en la fase sub-G1 en las líneas celulares de próstata analizadas (CL1, DU145, 22Rv1, PC3) y un índice apoptótico más alta se encontró en 22Rv1 células (43,135%) que en DU145, las células PC3 o CL1, en consonancia con la más alta expresión de E1A en la línea celular 22Rv1 (Fig. 4B).
a. CL1 y 22Rv1 células se tiñeron con Hoechst 33258 a las 48 horas después de la infección viral. Las flechas indican las células apoptóticas. Barra de escala, 10 micras. B. Análisis de citometría de flujo de células de yoduro de propidio manchados se realizó a las 48 horas después de la infección. Se muestran los porcentajes de células sub-G1. Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (** indica
P Hotel & lt; 0,01; * indica
P Hotel & lt; 0,05; N /S indica
P
& gt;. 0,05) guía empresas
Ad.DD3.D55-PTEN induce la apoptosis a través intrínseca y extrínseca vías de señalización
El mecanismo de la apoptosis inducida por Ad.DD3.D55-PTEN fue estudiado. Como se muestra en la Figura 5B, el inhibidor pan-caspasa Z-VAD-fmk inhibe la muerte celular inducida por Ad.DD3.D55-PTEN en las células CL1. Este resultado indica que la muerte celular inducida por Ad.DD3.D55-PTEN es dependiente de caspasa. Además, una serie de cascadas de señalización de la apoptosis dependiente de caspasa se analizaron por transferencia Western (Fig. 5A). escisión mejorada PARP y la activación de la procaspasa-3, la procaspasa 8 se detectaron en células infectadas-PTEN Ad.DD3.D55 (Fig. 5A). También se detectó una reducción dependiente del tiempo en el nivel de precaspase-9 en células infectadas por el PTEN Ad.DD3.D55 (Fig. 5A), consistente con la activación de la vía de señalización de la apoptosis mediada por mitocondrias. La integridad de la mitocondria celular se evaluó con el colorante fluorescente potenciométrico JC-1 (Fig. 5B). La citometría de flujo reveló que la infección con Ad.DD3.D55-PTEN resultó en una disminución significativa en el potencial eléctrico transmembrana mitocondrial (Fig. 5C). En conjunto, estas observaciones indican que PTEN mejorar de manera efectiva la apoptosis inducida por Ad.DD3.D55 vías intrínseca y extrínseca.
A. Western blot de las proteínas relacionadas con la apoptosis en las células infectadas con CL1 Ad.DD3.D55 o Ad.DD3.D55-PTEN. células B. CL1 se trataron con los agentes y celda indicada viabilidad se analizó por el ensayo MTT después de 120 horas. Para el ensayo de inhibición de Z-VAD-fmk, las células se trataron previamente con Z-VAD-fmk (20 mM) 2 h antes de la infección de virus. Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (** indica
P Hotel & lt; 0,01; * indica
P Hotel & lt; 0,05; N /S indica
P
& gt; 0,05). C. Análisis del potencial de membrana mitocondrial de las células CL1 por FACS después de JC-1 tinción. Se muestra el porcentaje de células en la región trapezoidal.
Supresión del crecimiento tumoral por Ad.DD3.D55-PTEN induce la apoptosis
in vivo
Los resultados presentado anteriormente muestran que el efecto antitumoral del agente CTGVT Ad.DD3.D55-PTEN es mucho mejor que cualquiera de los Ad.DD3.D55 virus oncolítico o Ad.PTEN solo. De las líneas celulares de cáncer de próstata probados, Ad.DD3.D55-PTEN mató células LNCaP y CL-1 con la mayor eficiencia. Seleccionamos la línea celular CL1, un subclon independiente de los andrógenos de LNCaP, para evaluar el potencial oncolítico de Ad.DD3.D55-PTEN porque las células LNCaP tienen una pobre capacidad de formación de tumores
in vivo
. Como se muestra en la Figura 6A, el crecimiento del tumor después de la inyección de se inhibió casi completedly con el volumen final del tumor después del tratamiento Ad.DD3.D55-PTEN menor que el volumen inicial en el comienzo del tratamiento Ad.DD3.D55-PTEN. Otra forma de decir, no sólo Ad.DD3.D55-PTEN-infectado tumores no crecen, pero sus volúmenes en realidad se redujo en un 41,3% cuando se mide 20 días después de la inyección. Esto demuestra el poderoso efecto de Ad.DD3.D55-PTEN sobre el crecimiento tumoral. Sin embargo, tanto Ad.DD3.D55 y Ad.PTEN inhibieron el crecimiento del tumor con una eficiencia mucho más baja, en comparación con la de Ad.DD3.D55-PTEN.
A. Efecto antitumoral de la infección de CL1 tumores de xenoinjertos con diferentes adenovirus. El volumen del tumor se midió y se presenta como la media ± desviación estándar. B. Ad.DD3.D55-PTEN inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos CL1. El análisis de la cinética viral de Ad-PTEN o Ad.DD3.D55-PTEN-tratada 22Rv1 tumores mediante PCR en tiempo real. Adenovirus región E3 se amplificó para evaluar el contenido de ADN viral. Se utilizó ADN ß-actina como control interno. (NS medios
P Hotel & gt; 0,05, sin significación estadística). C. Análisis de secciones de tumor derivadas de tumores tratados con PBS o uno de varios adenovirus por tinción de TUNEL. Barra de escala, 100 micras.
El estudio de la cinética viral
in vivo
ilustrar más la superioridad de Ad.DD3.D55-PTEN con su cantidad de ADN viral hasta 100 veces mayor que la de Ad-PTEN dentro de las 72 h y una duración de 2 semanas (Fig. 6B). análisis TUNEL reveló que la inyección de Ad.DD3.D55-PTEN causada cantidad significativa de la apoptosis en los tumores, mientras que no se observó apoptosis en los tumores tratados con PBS, y poco en los tumores tratados con Ad-PTEN (Fig. 6C).
Discusión
en este estudio, Ad.DD3.D55-PTEN demostró un excelente efecto antitumoral
in vitro
y
in vivo
. Dos factores principales contribuyen a la citotoxicidad ejercida por Ad.DD3.D55-PTEN. La primera es que se replica selectivamente en células de cáncer de próstata. Hemos informado anteriormente de que el virus oncolítico promotor controlado por DD3 mínima replica selectivamente en células de cáncer de próstata [17], aunque la actividad promotora no fue muy satisfactoria. PSA es un biomarcador bien conocida de cáncer de próstata y su promotor ha sido ampliamente utilizado para estudiar bioterapias para el cáncer de próstata, incluyendo la terapia génica con vectores diferentes [22], [23], [24], [25]. Diferentes promotores recombinantes se han generado a partir de la actividad del cáncer de próstata-específico de un promotor o potenciador para aumentar la actividad del cáncer de próstata-específico del promotor que controla la replicación del virus oncolítico [26], [27], [28], [ ,,,0],29]. Cell matar eficacia podría mejorarse por muchos métodos, tales como la combinación de la adenovirus oncolítico con radioterapia o quimioterapia. Los ensayos clínicos han demostrado que la combinación de virus ONYX-15 y la quimioterapia provoca una respuesta antitumoral más fuerte contra el cáncer de cabeza y cuello que ONYX-15 o la quimioterapia sola [30]. Los pacientes con cáncer de próstata han sido tratados con mayor frecuencia con la ablación de andrógenos. Debido a que la actividad de la PSA promotor /potenciador es dependiente de andrógeno endógeno [31] altamente, la
in vivo
citotoxicidad de un virus oncolítico promotor PSA /a base de potenciador podría reducirse significativamente si se utiliza en pacientes que han sido tratados con ablación de andrógenos. En este estudio, hemos introducido WPRE en el casete de expresión de E1A DD3 controlada. Curiosamente, la presencia de WPRE elevó los niveles de expresión de reportero considerablemente, pero no afectó significativamente la expresión restringida en células de cáncer de próstata. Para nuestro conocimiento, este es el primer uso informado de WPRE en la generación de un virus oncolítico. Además, nuestros datos muestran que Ad.DD3.D55-PTEN, en el que la expresión de E1A está bajo el control del promotor DD3 y WPRE, ejerce un fuerte efecto inhibidor sobre el crecimiento de andrógeno-dependientes, así como líneas de células independientes de andrógenos , incluyendo CL1, DU145 y 22Rv1 en cultivo celular y el crecimiento tumoral CL1 en un ratón desnudo de xenoinjerto. Ad.DD3.D55-PTEN tiene un potente efecto citotóxico en las líneas celulares independientes de andrógenos. Por lo tanto, la expresión de E1A bajo el control del promotor DD3 y WPRE puede ser clínicamente significativa para la terapia viral oncolítico de los pacientes con cáncer de próstata
. Nuestros resultados mostraron que la expresión de PTEN jugó el segundo papel clave en la citotoxicidad de Ad.DD3.D55-PTEN. PTEN actúa como una fosfatasa fosfatidilinositol con un posible papel en la fosfatidilinositol 3'-quinasa (PI3'K) la transducción de señales mediada por, la supresión de la vía PI3K /AKT mediante la reducción del nivel de PI3'K en la célula [32], [33] . El virus oncolítico Ad.DD3.D55 y Ad.DD3.D55-PTEN condujo a un aumento en la expresión de fosfo-Akt a las 24 h después de la infección (Fig 2.D.); la activación de la señalización de PI3K-Akt es la vía empleada por virus para la endocitosis y la replicación viral [34], [35], [36], [37]. Ad.DD3.D55-PTEN inhibe la fosforilación de Akt en su residuo de activación (Ser473) como resultado de la expresión de PTEN, mientras que la activación de Akt se mantuvo con la infección de Ad.DD3.D55 (Fig. 2.D). La diferencia indica claramente el poderoso papel de PTEN. Además, PTEN se ha identificado como la alteración de inactivación en múltiples tipos de cáncer humano, tales como glioma, de mama, de pulmón, de próstata, de vejiga, tumores de melanoma y de los riñones, astrocitoma, y la leucemia [38]. En el cáncer de próstata, la pérdida de la proteína PTEN está correlacionada con tumores de alto grado y estadio, lo que sugiere que las alteraciones en el
PTEN
gen pueden estar asociados con la progresión del cáncer de próstata [21], [39]. Wu et al. establecido un modelo de ratón con eliminación prostático específico de PTEN [40]. Este modelo de ratón recapitula la progresión del cáncer de próstata en los seres humanos: la iniciación del cáncer de próstata con neoplasia intraepitelial prostática, seguido de progresión a adenocarcinoma invasivo y la posterior metástasis. Por lo tanto, PTEN es un candidato óptimo para la terapia génica del cáncer debido a sus propiedades únicas. Introducción de PTEN por el adenovirus o retrovirus se ha estudiado para bio-terapia de diversos tipos de cáncer, incluyendo el de ovario, de endometrio, vejiga, gástrico, colorrectal y los cánceres de esófago y de glioblastoma [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47]. Por ejemplo, Gallick et al. informó que la expresión mediada por adenovirus de PTEN inhibe la proliferación y la metástasis de las células de cáncer de próstata humano
in vitro Opiniones y en
in vivo
[48]. la expresión del transgen PTEN mediada por adenovirus en combinación con radioterapia, quimioterapia y otros genes del cáncer de supresión se ha utilizado para tratar las células de cáncer de próstata para potenciar el efecto antitumoral [49], [50], [51], [52]. En este estudio, los altos niveles de expresión de PTEN dirigido por el promotor CMV fueron mediados por un virus oncolítico que replica selectivamente en células de cáncer de próstata mediante el uso de promotor DD3 para conducir la expresión de E1A. La eficacia antitumoral de PTEN en el virus oncolítico fue muy mejorada en comparación con el PTEN mediada por adenovirus que se había informado anteriormente para su uso en el cáncer de próstata [48], [52], que podría ser el resultado de que Ad.DD3.D55-PTEN inducida una apoptosis masiva en las células de cáncer de próstata por vías intrínseca y extrínseca.
Hemos observado que varía sensibilidades de las diferentes líneas celulares de cáncer de próstata a la citotoxicidad de Ad.DD3.D55-PTEN. El nivel de expresión del indicador dirigido por el promotor DD3 y WPRE en las células LNCaP sólo 21,79% de que en 22Rv1 células (Fig. 1), lo que sugiere una replicación más baja de Ad.DD3.D55-PTEN en las células LNCaP, lo que parece incompatible con la mayor eficacia matando de Ad.DD3.D55-PTEN en las células LNCaP que en 22Rv1 células (Fig. 3). Sin embargo, 22Rv1 células expresan un PTEN funcional, mientras que las células LNCaP no [53] hacen. Teniendo en cuenta los datos anteriores, Ad.DD3.D55-PTEN probablemente ejerce un efecto citotóxico en células de CaP más fuerte PTEN-negativo que en células de CaP PTEN-positivo.
Los volúmenes de tumor de células CL1 se redued un 41,3% 20 días después de la infección con Ad.DD3.D55-PTEN en el ratón desnudo (Fig. 6A) sugiere fuertemente que Ad.DD3.D55-PTEN tiene el potencial terapéutico para el tratamiento de cánceres independientes de andrógenos. Este estudio reveló que la replicación adenoviral disminuyó después de aproximadamente 12 días de replicación activa (Fig. 6B). Curiosamente, incluso la tasa de virus oncolítico mantenerse muy baja
in vivo
después del período (Fig. 6B), el tumor infectado todavía no creció significativamente (Fig. 6A). se desconoce su mecanismo de este fenómeno. Una explicación plausible es que una gran mayoría de las células de cáncer murió en los primeros días después de la inyección de Ad.DD3.D55-PTEN, mientras que el crecimiento de las células cancerosas restantes se inhibe de manera eficaz incluso en presencia de una cantidad mínima de virus oncolítico. El fenómeno es probablemente alentador ya que la mayoría de los virus se elimina por
in vivo
cuando el virus oncolítico se utilizan clínicamente.
En conclusión, hemos desarrollado un novedoso CTGVT específico de la próstata (CaP-CTGVT ), Ad.DD3.D55-PTEN, mediante el control de la expresión del gen E1A con un promotor mínimo y DD3 WPRE. Ad.DD3.D55-PTEN tenía una excelente eficacia antitumoral en ambas líneas celulares de cáncer dependientes de andrógenos y de próstata -independiente. Este informe también proporciona una nueva estrategia para la construcción de un CTGVT-CP con especificidad tipos de tumores que tienen pocos promotores específicos de tumores disponibles.
Materiales y Métodos
Ética y Declaración de animales Experimento
Hombre Balb /c ratones nude (4 semanas de edad) se mantuvieron y se utiliza en una sala de luz y temperatura controladas en una instalación acreditada por la AAALAC, y se le dio agua y de laboratorio Chow
ad libitum
[17] . Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Instituto de Shanghai de Bioquímica y Biología Celular bajo protocolo IBCB-SPF0029. Para establecer tumores de xenoinjertos, 5 × 10
6 22Rv1 o CL1 células en 150 l DMEM se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron 70-150 mm
3 en tamaño, los ratones fueron asignados al azar a uno de cuatro grupos (seis ratones por grupo). Adenovirus (2 × 10
9 UFP por ratón) o PBS se inyectaron en los tumores cada dos días, con un total de tres inyecciones. El volumen del tumor (mm
3) se midió con un calibrador vernier cada cuatro días y se calculó como (longitud x anchura
2) /2. Para estudiar la cinética viral
in vivo
, los tumores inyectados con Ad-PTEN o Ad.DD3.D55-PTEN se recogieron a los 3, 6, 9, 12 y 15 días después de la última inyección y rápidamente congelados en nitrógeno líquido . El ADN tumoral total fue extraído utilizando el kit Genomic DNA minipreparaciones (Generay Biotech, Shanghai, China). El ADN viral se midió por PCR en tiempo real usando cebadores que hibridan con la región E3 de adenovirus.