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PLOS ONE: Determinar un algoritmo de diagnóstico apropiado usando anticuerpos EGFR mutación-específicos para detectar el estado de EGFR en no pequeñas de pulmón de células-Cancer


Extracto

Antecedentes

receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) estado de la mutación es el indicador más valioso en la detección de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) para la terapia con inhibidores de la tirosina quinasa (TKI). métodos precisos, rápidos y económicos de la detección de mutaciones de EGFR se han vuelto importantes. El uso de dos anticuerpos mutación concreta para la mutación delE746-A750 en el exón 19 y la mutación L858R en el exón 21 hace posible esta tarea, pero la falta de criterios consensualmente aceptables para resultados positivos limita la aplicación de esta detección de mutaciones basados ​​en anticuerpos.

Métodos

Se recogieron 399 muestras de pacientes con CPNM (145 especímenes de resección, 220 muestras de biopsia, y 34 muestras de citología) cuyo estado de mutación del EGFR había sido detectado por el ensayo de PCR TaqMan. Inmunohistoquímica (IHC) analiza el uso de EGFR se emplearon anticuerpos mutación específica para todas las muestras. Después de la tinción y la puntuación, la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) se calcularon de acuerdo con los diferentes niveles de grados positivos en comparación con los resultados del ensayo basado en PCR.

resultados

En los análisis basados ​​en IHC, se puntuaron 0 144 casos, 104 casos fueron anotados 1+, 103 casos fueron anotados 2+, y 48 casos fueron anotados 3+. Con los resultados de base molecular se establecieron como el "patrón oro", la prevalencia de la mutación fue de 6.94% (10/144), 23,08% (24/104), 67,96% (70/103) y 100% (48/48 ), respectivamente, para las muestras con puntuaciones de 0, 1+, 2+ y 3+. Cuando 3+ puntuación se consideró positiva, la especificidad y el VPP fue del 100%; aunque sólo sea la puntuación de 0 se consideran negativas, se obtuvo 93,06% VAN.

Conclusión

Los pacientes con puntuación de 3+ tienen un VPP perfecta (100%), y puede aceptar el tratamiento TKI directamente sin ningún molecular Los ensayos basados. Los pacientes con puntuación de 0 tenían un alto VPN (93,06%), lo que podría llegar a 97.22% cuando se aplicó la detección del total de EGFR. Sin embargo, las muestras con puntuación de 1+ o 2+ son poco fiables y requieren un mayor verificación del estado de mutación de EGFR mediante ensayos basados ​​en moléculas

Visto:. Jiang G, C Fan, Zhang X, Q Dong, Wang L, Liu Y, et al. (2013) Determinación de un algoritmo de diagnóstico apropiado usando anticuerpos EGFR mutación-específicos para detectar el estado de EGFR en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (3): e59183. doi: 10.1371 /journal.pone.0059183

Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón

Recibido: 18 de diciembre de 2012; Aceptado: 12 de febrero de 2013; Publicado: 11 de marzo 2013

Derechos de Autor © 2013 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81071905 y 81272606 a EHW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Desde el comienzo del uso de los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico tirosina quinasa (EGFR-TKI) gefitinib y erlotinib para el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico avanzado (NSCLC) [1], los estudios han demostrado que pacientes con CPNM con mutaciones de EGFR activación pueden beneficiarse del tratamiento con ITC [2], [3]. El estado de las mutaciones de EGFR se ha convertido en el mejor predictor de la respuesta a TKIs [4] - [9]. La secuenciación directa es el método "estándar de oro" para la detección de mutaciones de EGFR. Sin embargo, su sensibilidad es relativamente baja; si el porcentaje de células tumorales es & lt; 25%, la probabilidad de un resultado falso negativo se incrementa en gran medida. Debido a la falta de un número suficiente de células tumorales disponibles para la extracción de ADN de alta calidad, la probabilidad de obtener un falso negativo se incrementa mientras se prueba una pequeña biopsia o citología muestra. Sin embargo, aproximadamente 70% de los cánceres de pulmón se diagnostican en estadios avanzados por lo que pequeñas biopsias y muestras citológicas son la única fuente de material para las pruebas de diagnóstico y mutación. Los avances recientes en métodos moleculares han permitido un desarrollo de métodos más sensibles para la detección de mutaciones. Tales métodos incluyen la reacción en tiempo real en cadena de polimerasa cuantitativa (QRT-PCR) utilizando sondas específicas (ensayo TaqMan PCR), sistema de mutación refractaria amplificado (ARMS) y el análisis de alta resolución de fusión (HRMA) [10] - [14]. Sin embargo, son caros y requieren invariablemente buenas condiciones experimentales y los instrumentos sofisticados. Por lo tanto, rara vez se aplican en los hospitales no docentes.

inmunohistoquímica (IHC) analiza también se puede utilizar para la detección de mutaciones de EGFR. Yu et al. anticuerpos desarrollados EGFR mutación específica monoclonales de conejo contra EGFR con la supresión E746-A750 en el exón 19 o el punto de mutación L858R que mostró una buena consistencia en comparación con los ensayos basados ​​en moleculares [15] - [26]. Sin embargo, la aplicación práctica de este método fue severamente limitada debido a la diferencia apreciable en los criterios utilizados para obtener resultados positivos entre los diferentes equipos de investigación. Algunos investigadores obtuvieron datos de acuerdo con la intensidad de tinción, y las muestras divididas en cuatro grados: 0, 1+, 2+ y 3+. Sin embargo, algunos autores abogaron por una puntuación por encima de 1+ a ser considerado positivo, y otros incluso argumentaron que una puntuación superior a 2 + debe proporcionar un resultado positivo. Las especificidades de estos dos enfoques eran relativamente cerca (96-100%), pero su sensibilidad variaron ampliamente (47-92%) [15] - [19]. Algunos investigadores también obtuvieron una puntuación para la expresión de multiplicar la intensidad de la tinción por el porcentaje de área de tinción (0-300 o 400), y, respectivamente, abogaron por una veintena de & gt; 10 o & gt; 20 para ser categorizado como positivo, pero una diferencia apreciable en sensibilidades (42,2 a 100%) y especificidad (77-100%) se observó [20] - [22]. Recientemente, Kawahara et al. propuso que la inmunotinción debe clasificarse como positivos (puntuación de 2 +), negativa (puntuación 0) o dudosos (puntuación de 1+), lo que indica la expresión cuestionable, negativo o débil, respectivamente, que pueden obtener una sensibilidad del 81,4%, especificidad del 97,5%, valor predictivo positivo (VPP) del 94,6% y un valor predictivo negativo (VPN) del 90,6% [23]. Consenso de un criterio universalmente aceptado para "positivo" que falta, lo que dificulta seriamente el uso clínico de anticuerpos mutación específica del EGFR para detectar mutaciones de EGFR.

En el presente estudio, se analizaron los resultados de IHC de 399 muestras de pacientes con CPNM que fueron anotados por un método de clasificación de cuatro teniendo en cuenta la intensidad y el área de la tinción. Por último, comparamos los resultados con un ensayo basado molecular para explorar la posibilidad de detección de mutaciones de EGFR en muestras de NSCLC mediante análisis IHC.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

todos los tejidos y células humanas se obtuvieron de acuerdo con los protocolos investigación con seres humanos aprobados por la Junta de Revisión de la Universidad de Medicina china. Los tejidos tumorales y las células fueron obtenidas con el consentimiento informado por escrito de los pacientes adultos con NSCLC.

selección de muestras y la base molecular de ensayo

Se recogieron 399 muestras (145 muestras de resección, 220 muestras de biopsia, y 34 muestras de citología) de pacientes con CPNM que habían solicitado para el ensayo de base molecular de las mutaciones de EGFR en el Departamento de Patología de la Universidad de Medicina china (Shenyang, china) a partir de agosto de 2008 y agosto de 2012. el rango de edad de los pacientes con cáncer de pulmón fue 26 -89 años (mediana, 62 años); había 214 hombres y 185 mujeres. Los tipos histológicos fueron 341 adenocarcinomas, 47 carcinomas de células escamosas, y otros 11 tipos (Tabla 1). El estado de la mutación EGFR de cada espécimen fue detectado por el ensayo TaqMan PCR. Resección y la biopsia tejidos se fijaron en formalina al 10% y embebidos en parafina. Los sobrenadantes de muestras de efusión pleural-se eliminaron por centrifugación, y los componentes celulares restantes se fijaron en 10% de formalina y embebidos en parafina. Los bloques de parafina se cortaron a un grosor de 8 micras para la investigación de mutaciones en el gen EGFR basados ​​en PCR. Las mutaciones del gen EGFR se examinaron en los exones 19 y 21 usando el ensayo TaqMan PCR. El ADN genómico de muestras de tejido o de citología incluidos en parafina se extrajo y se purificó usando un kit QIAamp DNA Micro (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Los cebadores para sondas de detección de mutaciones y TaqMan dirigidos E746-A750 y mutaciones de deleción L747-P753insS en el exón 19, y L858R y mutaciones puntuales en el exón 21 L861Q fueron adquiridos de GP Medical Technologies (Pekín, China). El ensayo TaqMan PCR se llevó a cabo utilizando un sistema 7900HT-PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster, CA, EE.UU.).

análisis IHC

Los bloques de parafina se cortaron a un espesor de 4 micras para inmunotinción. Convencional de-encerado y tratamiento de hidratación se realizaron utilizando xileno y una serie graduada de etanol, respectivamente. Las muestras se hirvieron en un baño de agua a 100 ° C durante 20 minutos en ácido tetra-acético /l de etilendiamina 1 mmol (EDTA) a un pH de 9,0 y una solución de recuperación diana (Dako, Glostrup, Dinamarca) para recuperar antígenos. actividad de la peroxidasa intrínseca fue bloqueado por el tratamiento con reactivo de bloqueo de peroxidasa (Dako) durante 15 min a temperatura ambiente. Los puntos de unión no específicos se bloquearon mediante incubación con suero de cabra no inmune normal para 15 min a temperatura ambiente. Después de lavar en solución salina tamponada con Tris (TBS; Dako) durante 15 minutos, tres anticuerpos primarios (es decir, el anticuerpo monoclonal EGFR (D38B1), delE746-A750 anticuerpo monoclonal-mutación específica (6B6) y el anticuerpo monoclonal-mutación específica L858R (43B2) ; Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.) se diluyeron por separado en 1:400 y se añaden a las muestras. Las muestras se incubaron a 4 ° C durante la noche, se lavaron en TBS durante 15 min, y se incubaron con la etiqueta de polímero-peroxidasa de rábano anticuerpo secundario (kit ChemMate Envision; DAKO) durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar en TBS durante 15 minutos, los portaobjetos se visualizaron utilizando 3,3 'diaminobencidina.

IHC puntuación

La puntuación de tinción IHC se basa en la intensidad de la tinción y el porcentaje de área de tinción en la membrana y /o el citoplasma de las células tumorales. Se emplearon cuatro grados: 0, 1+, 2+, 3+. Zero denota ninguna tinción; 1+ denotado tinción de color amarillo claro, sin partículas obvias o manchas de color amarillo con partículas obvias en & lt; 10% de las células tumorales; 2+ denotado tinción amarilla con partículas obvias en & gt; 10% células tumorales o tinción de color marrón con partículas obvias en & lt; 10% de las células tumorales; y 3+ denotado tinción marrón con partículas obvias en & gt; 10% las células tumorales. evaluación de la tinción se lleva a cabo sólo si & gt; 5 células tumorales estaban presentes en una biopsia con aguja o una muestra de citología. Todos los análisis inmunohistoquímicos fueron evaluados por tres investigadores experimentados (YL, jhy e YZ) que no eran conscientes de las condiciones clínicas de los pacientes o diagnóstico patológico.


análisis estadísticos
La sensibilidad, especificidad, VPP y VPN de la base de ensayo IHC se calcularon utilizando el ensayo basado en molecular como referencia. El acuerdo entre las 2 técnicas se calculó utilizando Cohen κ. Todos los datos fueron analizados con el programa SPSS 13.0 para Windows.

Resultados

Molecular basado en el estado mutacional del EGFR de 399 muestras de NSCLC

Se detectaron un total de 399 muestras de NSCLC utilizando el TaqMan ensayo de PCR. Se detectó una mutación de EGFR en 162 casos (40,6%, 162/399). Esto incluyó un E19 (E746-A750) mutación por deleción en 86 casos (21,55%, 86/399), E21 (L858R) mutaciones puntuales en 70 casos (17,54%, 70/399), tanto E746-A750 y L858R en 4 casos, las mutaciones E19 (L747-P753insS) deleción en 4 casos (1,03%, 4/399), E21 (L861Q) mutaciones puntuales en 6 casos (1,5%, 6/399), y ninguna mutación en 237 casos (59,4%, 237/399). La tasa de mutaciones en muestras de resección fue 40,69% (59/145), en muestras de biopsia fue 36,82% (81/220), y en muestras de citología fue 35,29% (12/34).

Análisis comparativo de IHC y basado en el estado mutacional del EGFR
base molecular
Las mutaciones de EGFR patrones de tinción de anticuerpos mutación específica del EGFR se muestran en la Figura 1. Fuera de 399 muestras de NSCLC, se marcaron 144 casos 0 (en el que 10 casos albergaban y la tasa de mutaciones en esta categoría fue de 6.94%, 10/144); 104 casos fueron anotados 1+ (había 24 casos de las mutaciones de EGFR y la tasa de mutación fue 23,08%, 24/104); 103 casos fueron anotados 2+ (mutaciones de EGFR estaban presentes en 70 casos y la tasa de mutaciones fue 67,96%, 70/103); 48 casos se puntuaron 3+ (48 casos albergaban mutaciones de EGFR, y la tasa de mutación fue 100%, 48/48). Los resultados detallados se muestran en la Tabla 2. Las muestras anotado 3+ tiene un VPP perfecta (100%), y los que anotó 0 tienen una buena NPV (93,06%).

inmunotinción Representante de ambas muestras histológicas y citológicas en pacientes con CPNM (A, D, G y J, muestras de resección, 200 ×; B, e, H y K, las muestras de biopsia, 200 ×; C, F, I y L, las muestras para citología, 400 ×). Se emplearon cuatro grados: 0, 1+, 2+ y 3+. 3+ denotado tinción marrón con partículas obvias en & gt; 10% de células tumorales (A, B y C); 2+ denotado tinción de color amarillo con partículas obvias en & gt; 10% las células tumorales o manchas de color marrón con partículas evidentes en & lt; 10% de las células tumorales (D, E y F); 1+ denotado tinción de color amarillo claro sin partículas obvias o tinción de color amarillo con partículas obvias en & lt; 10% de las células tumorales (G, H y I); Cero denota ninguna tinción (J, K y L).

El acuerdo entre los ensayos basados ​​en IHC y la base molecular de acuerdo con los diferentes niveles de grados positivos se calculó utilizando Cohen κ. Cuando los grupos con puntuación de 0 ó 1+ fueron considerados como negativos, y los que tienen puntuación de 2+ o 3+ fueron considerados como positivos, el acuerdo entre los diferentes métodos de detección 2 fue más alta (κ = 0,644). Sin embargo, no habría 24 casos falsos negativos (23,08%, 24/104) en el grupo de puntuación de 1+ y 33 casos de falsos positivos (32.04%, 33/103) en el de puntuación de 2+, lo que resulta en una sensibilidad del 77,63%, una especificidad del 86,64%, VPP del 78,14%, y el VPN del 86,4% para la detección mediante técnicas de inmunohistoquímica. Ninguno de estos valores era ideal (que se muestra en la Tabla 3).

Con las pruebas moleculares como un estándar, el anticuerpo-mutación específica delE746-A750 (6B6) podría detectar 69 de los 86 casos con un E746 -A750 mutación por deleción (40 con la puntuación de 2+ y 29 con la puntuación de 3+) mientras que fue negativa en los 17 casos restantes (4 con puntuación de 0 y 14 con la puntuación de 1+) (κ = 0,584, sensibilidad: 80,23%, especificidad: 85,3%, VPP: 60%, VPN: 94.01%); la L858R anticuerpo-mutación específica (43B2) podría identificar a 53 de los 70 casos con una mutación puntual L858R (31 con la puntuación de 2+ y 3+ con 22), mientras que fue negativa en los 17 casos restantes (7 con puntuación de 0 y 10 con puntuación de 1+) (κ = 0,639, sensibilidad: 75,71%, especificidad: 91,79%, VPP: 66,25%, el VPN:. 94,67%)

además, también se pudo detectar EGFR total en todos los 399 casos usando anticuerpo monoclonal contra EGFR. Los resultados mostraron 27 casos se anotó 0, 38 casos fueron anotados 1+, 193 casos fueron anotados 2+, y 141 casos fueron anotados 3+. anticuerpo monoclonal EGFR (D38B1) es diferente de los dos anticuerpos-mutación específica. anticuerpo-mutación específica DelE746-A750 (6B6) puede reconocer específicamente las proteínas EGFR con una mutación de deleción E746-A750 en el exón 19, y el anticuerpo-mutación específica L858R (43B2) es capaz de identificar específicamente la proteína EGFR con un punto de mutación L858R en exón 21; en contraste, el anticuerpo monoclonal EGFR (D38B1), que no es un anticuerpo de mutación específica, identifica la proteína total EGFR independientemente del estado de la mutación. Aunque total de EGFR fue altamente expresado en la mayoría de los casos, aún había 38 casos con puntuación de 1+ y 27 casos con puntuación de 0, en el que 12 casos se dieron positivo por mutaciones del gen EGFR por el método molecular. Esto puede explicarse por el hecho de que los niveles de EGFR totales en las células tumorales son tan bajos, que la tinción de los dos anticuerpos-mutación específica puede ser negativo en algunos casos, a pesar de que tienen mutaciones en el gen EGFR detectado (como se muestra en la figura S1). Por lo tanto, la detección del nivel de EGFR total usando el anticuerpo EGFR monoclonal (D38B1) podría prevenir la aparición de resultados falsos negativos similares a las anteriores, mientras que la sensibilidad de delE746-A750 y anticuerpos mutación específica L858R podrían incrementarse a 82.56% y el 90% respectivamente.

análisis comparativo de los resultados basados ​​en IHC de muestras de resección, la biopsia y citología

los patrones de tinción de muestras de resección utilizando anticuerpos EGFR mutación específica se muestran en la Figura 2. de acuerdo con nuestra anotando criterios, de las 145 muestras de resección, 52 fueron anotados 0, en el que 2 casos albergaban mutaciones de EGFR y la tasa de mutación fue sólo 3,85% (2/52); 40 casos se puntuaron 1+, en el que hubo 10 casos de las mutaciones de EGFR y la tasa de mutación era 25% (10/40); 35 casos se puntuaron 2 +, en el que las mutaciones de EGFR estaban presentes en 29 casos, y la tasa de mutación fue 82,56% (29/35); 18 casos se puntuaron 3 +, en la que 18 casos albergaban mutaciones de EGFR, y la tasa de mutación fue del 100% (18/18). Los resultados detallados se muestran en la Tabla 2.

La proteína total EGFR en muestras de resección podría ser manchado con EGFR (D38B1) anticuerpo (A, D y G, 200 ×). Las muestras sin mutaciones de EGFR no se tiñeron con dos anticuerpos mutación específica (B y C, 200 ×). Las muestras con E746-A750 mutación por deleción se tiñeron con deleción E746-A750 (6B6) de anticuerpos específicos (E, 200 ×) y las muestras con la mutación L858R se tiñeron con L858R mutante (43B2) anticuerpo específico (I, 200 ×).


las características de tinción de muestras de biopsia usando anticuerpos EGFR mutación específica se muestran en la Figura 3. de acuerdo con nuestros criterios de puntuación, de las 220 muestras de resección, se marcaron 77 casos 0, 6 en la que albergaban mutaciones de EGFR y la tasa de mutación era 7,79% (6/77); 55 casos fueron anotados 1+, en el que 10 casos albergaban mutaciones de EGFR y la tasa de mutación fue de 18,18% (10/55); 60 casos se puntuaron 2 +, en la que 37 albergaban mutaciones de EGFR, y la tasa de mutación fue 61,67% (37/60); 28 casos se puntuaron 3 +, en la que 28 casos albergaban mutaciones de EGFR, y la tasa de mutación fue del 100% (28/28). Los resultados detallados se muestran en la Tabla 2.

La proteína total EGFR en muestras de biopsia podría ser manchado con EGFR (D38B1) anticuerpo (A, D y G, 40 × y la esquina izquierda superior 200 ×). Las muestras sin mutaciones de EGFR no se tiñeron con dos anticuerpos mutación específica (B y C, y 40 × la esquina izquierda superior 200 ×). Las muestras con E746-A750 mutación por deleción se tiñeron con E746-A750 deleción (6B6) de anticuerpos específicos (E, 40 × y la esquina superior izquierda 200 ×) y las muestras con la mutación L858R se tiñeron con mutante L858R (43B2) anticuerpo específico (I, 40 × y la esquina izquierda superior 200 ×).

las características de tinción de muestras de citología utilizando anticuerpos específicos de EGFR mutación se muestran en la Figura 4. de acuerdo con nuestros criterios de puntuación, de las 34 muestras de citología, 15 casos se anotó 0, en el que 2 casos albergaban mutaciones de EGFR y la tasa de mutación fue 13,33% (2/15); 9 casos se anotó 1+, en el que 4 casos tenían mutaciones de EGFR y la tasa de mutación fue del 44,44% (4/9); 8 casos se puntuaron 2 +, en la que 4 contenían mutaciones de EGFR, y la tasa de mutación fue 50% (4/8); 2 casos se puntuaron 3+, en el que 2 casos albergaban mutaciones de EGFR, y la tasa de mutación fue 100% (2/2). Los resultados detallados se muestran en la Tabla 2.

La proteína total EGFR en muestras de citología podría ser manchado con EGFR (D38B1) anticuerpo (A, D y G, 400 ×). Las muestras sin mutaciones de EGFR no se tiñeron con dos anticuerpos mutación específica (B y C, 400 ×). Muestra con E746-A750 mutación por deleción se tiñeron con deleción E746-A750 (6B6) de anticuerpos específicos (E, 400 ×) y las muestras con la mutación L858R se tiñeron con L858R mutante (43B2) anticuerpo específico (I, 400 ×).


Cuando puntuación de 3+ se consideran positivos, la especificidad y el VPP en el ensayo basado en IHC fue del 100% para todos los tres tipos de muestras. Cuando por 0 se considera negativa, las muestras de resección dado como resultado el VAN más alto (96,15%), seguido por las muestras de biopsia (92,21%), y las muestras para citología tenido el VAN más bajo (88,24%). Cuando marcó el 0 y 1+ se considera negativa y la puntuación de 2+ y 3+ considera positiva, la especificidad de las muestras de resección tenido el VAN más alto (93,02%), seguido por las muestras de biopsia (83.45%), y las muestras para citología tenido el VAN más bajo (81,82%) (Tabla 3).

Hubo 12 pacientes con ambas muestras de resección y la citología en nuestras muestras, y 6 de ellos albergaron mutaciones de EGFR (3 casos de E746-A750 mutación por deleción y 3 casos de mutación puntual L858R) por ensayo basado molecular. Por ensayo basado en IHC en las muestras de resección, 4 de las 6 muestras con mutaciones de EGFR fueron identificados como puntuación de 3+, y los otros 2 fueron identificados como teniendo una puntuación de 2+. Por el contrario, en las muestras de citología, sólo en 1 caso tuvo una puntuación de 3+ y 1 caso tuvo una puntuación de 2+, y los otros 4 casos eran todos puntuación de 1+. En las 6 muestras sin una mutación de EGFR, sólo en 1 caso tuvo una puntuación de 1+ mediante un ensayo basado en la IHC en las muestras de resección, y las otras cinco muestras tenían una puntuación de 0. Por el contrario, los resultados en las muestras de citología habilitados al efecto una puntuación de 2 + en 1 caso, la puntuación de 1+ en 1 caso, y la puntuación de 0 en los otros 4 casos (Tabla 4).

Discusión

mutaciones de EGFR pueden ser detectados en el CPNM mediante métodos IHC usando anticuerpos específicos de EGFR-mutantes. Sin embargo, debido a las diferencias apreciables entre los criterios de positividad definidos por diferentes grupos de investigación, los lectores o los diagnósticos se pueden confundir con o incluso inducir a error en cuanto a la aplicación práctica de este método. Por lo tanto, se requiere una investigación más amplia para llegar a un consenso. Los resultados del presente estudio y otros informes [15] - [19], [23] sugieren que los criterios de puntuación basado en la intensidad de la tinción de la membrana y /o el citoplasma de las células tumorales y el porcentaje del área de tinción (que fue dividido en cuatro grados: 0, 1+, 2+ y 3+) puede ser el mejor de todos los sistemas de puntuación disponibles. El acuerdo entre los ensayos basados ​​molecular IHC-basado y se calculó utilizando Cohen κ de acuerdo con los diferentes niveles de clasificación inmunohistoquímica. Aunque el acuerdo entre los 2 métodos de prueba fue más alta (κ = 0,644) cuando la puntuación de 2+ y 3+ fueron considerados como positivos, todavía había 33 casos de falsos positivos (32.04%, 33/103) en los casos de puntuación y 2+ 24 casos de falsos negativos (23,08%, 24/104) en los casos de puntuación 1+, lo que resulta en una sensibilidad del 77,63%, una especificidad del 86,64%, VPP del 78,14%, y el VPN del 86,4%, ninguno de los cuales era ideal. Por lo tanto, con una prueba molecular como un estándar, incluso si una muestra se calificó como positivo por el método de IHC, el ensayo basado en molecular todavía puede ser necesaria para verificar el estado de mutación de EGFR, y por lo tanto la proyección de las mutaciones de EGFR por IHC no parece ser aplicable. A pesar de que el número de casos de falsos positivos ha sido muy pocos en otros estudios [15] - [19], la detección molecular mayor puede no ser totalmente abandonado. En este estudio, se observó que las muestras con una puntuación de 3+ tuvieron un VPP perfecta (100%), y la puntuación de 0 muestras tenían un buen VPN (93,06%). Si la puntuación de 3+ se considera que es un criterio positivo, los pacientes con muestras positivas por ensayo basado en IHC podrían recibir directamente la terapia de TKI sin necesidad de que la verificación de una prueba molecular. La aplicabilidad de la terapia de TKI podría evaluarse rápidamente por inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos de EGFR-mutación en casi 50% de todos los pacientes (los que obtuvieron como 0 o 3+). La posibilidad de que las mutaciones en las muestras con una puntuación de 1+ estaba a punto 23,08% y una probabilidad de ninguna mutación en ellos era 76.92%, por nuestro análisis. La tasa de mutación en las muestras con una puntuación de 2+ era 67,96%, lo que sugiere fuertemente la posibilidad de una mutación de EGFR en este grupo. A partir de entonces, si se utiliza correctamente, el cribado estado de mutación de EGFR mediante inmunohistoquímica puede tener un valor diagnóstico para la toma de decisiones terapéuticas, especialmente en un centro médico que no tiene una capacidad de pruebas moleculares.

Tal como se recomienda Wu et al. [22], la expresión de EGFR totales también fue probado en todos los 399 casos en nuestro estudio. A diferencia de los dos anticuerpos mutación específica, el anticuerpo monoclonal EGFR (D38B1) identifica la proteína EGFR total independencia del estado de la mutación. Debido a que los niveles de EGFR totales en ciertos casos son muy bajos, las proteínas mutantes pueden no ser detectable mediante el uso de dos anticuerpos-mutación específica, a pesar de que los casos Harbor mutados del gen EGFR (como se muestra en la Figura S1). No obstante, el uso del anticuerpo monoclonal EGFR (D38B1) en combinación con anticuerpos específicos de mutación probablemente reduce los resultados falsos negativos por nuestro análisis. Con este enfoque, la sensibilidad de los anticuerpos de mutación específica delE746-A750 y L858R podrían aumentar a 82,56% y 90%, respectivamente. La sensibilidad de anticuerpo-mutación específica L858R (43B2) parece ser mayor que el anticuerpo delE746-A750-mutación específica (6B6), que es coherente con lo que se ha informado por Ambrosini-Spaltro A et al [16].

Además, hemos llevado a cabo un análisis comparativo de los resultados basados ​​en IHC sobre muestras de resección, la biopsia y citología. Cuando una puntuación de 2 + se considera positiva, la tasa de falsos positivos valores de muestras de resección fue sólo 17,14% (6/35), mientras que las tasas de los valores falsos positivos para biopsias y muestras de citología fueron 38.33% (23 /60) y 50% (4/8), respectivamente. Este hallazgo sugiere que, debido a la menor cantidad de células y tejidos tumorales que especímenes de resección, la heterogeneidad de las células tumorales en muestras de biopsia o citología puede ser más prominente, y por lo tanto causar un aumento de la variabilidad de los resultados de prueba. Además del número limitado de células tumorales en el líquido pleural (citología de muestras), la composición de los componentes celulares era más compleja, que a menudo incluye muchas células rojas de la sangre, células inflamatorias y células mesoteliales, y de este modo diluye las células tumorales. Aunque muestras de citología se pueden utilizar tanto para los ensayos basados ​​en moleculares y basados ​​en IHC, el último ensayo tiende a mostrar valores más falsos negativos en comparación con muestras de tejido (especialmente cuando se compara con muestras de resección). Esto puede explicar por una disminución de la sensibilidad de la detección notablemente mutante en muestras de citología (Tabla 3). Además, hemos examinado 12 casos con ambas muestras de resección y citología recogidos. De éstos, 6 albergaban mutaciones de EGFR mediante un ensayo basado en la molecular y los otros 6 no lo hicieron. Cuando se utilizó la puntuación 3+ como un umbral, ensayo basado en IHC podría identificar 4 de los 6 muestras con mutaciones de EGFR en muestras de resección, pero sólo detectar 1 caso en muestras de citología. Si se aplicó la puntuación ≥2 +, el ensayo podría identificar todos los 6 casos con mutaciones de EGFR en muestras de resección, pero detectar sólo 2 de los 6 casos en muestras de citología. Estos resultados sugieren que, con respecto a la detección basada IHC de mutaciones de EGFR, muestras de resección fueron mucho mejores que las muestras de biopsia, y las muestras de biopsia fueron significativamente mejores que las muestras para citología.

En teoría, las proteínas EGFR sobre la membrana celular o en citoplasma desempeñar diferentes funciones en las células tumorales y tienen diferente interacción con los ITC. Sin embargo, los efectos del tratamiento con inhibidores de TK en pacientes que muestran una distribución subcelular diferente de EGFR en las células tumorales no han sido bien investigado todavía. Como se informó anteriormente, se observó que EGFR podría localizar en la membrana de células tumorales, en el citoplasma o ambos en la membrana y en el citoplasma mediante análisis inmunohistoquímico. Con el fin de determinar las características funcionales de las diferentes distribuciones subcelulares de las proteínas EGFR, tratamos de analizar una posible correlación entre el estado de mutación del EGFR y la distribución subcelular de las proteínas, pero descubrimos ninguna correlación entre ellos. En lugar de ello, la intensidad de la tinción muestra una fuerte correlación con el estado de la mutación EGFR. Por lo tanto, la tinción de "la membrana y /o citoplasma" fue igualmente y de manera conjunta en cuenta en nuestro sistema de puntuación.

La alta actividad de la proteína EGFR en cáncer de pulmón es debido a las mutaciones de activación, pero las amplificaciones de genes pueden también juegan un papel importante. En este estudio, 334/399 (83,7%) casos de CPNM se demostró tener una expresión elevada de la proteína EGFR (≥2 +) mediante el uso de anticuerpos monoclonales, la tasa mucho más alta que la detección estándar a nivel genético (40,6%). Queda por investigar más a fondo si esta elevada expresión de EGFR en algunos casos sin mutaciones detectables está mediada por su de amplificación de genes o de otros mecanismos alternativos. Independientemente de que el ITC se puede aplicar empíricamente para estos pacientes debe ser verificado por estudios experimentales y ensayos clínicos adicionales.

En resumen, de acuerdo con nuestros análisis de estado de mutación de EGFR por IHC, los pacientes con una puntuación de 3 + tenía un PPV perfecta (100%), y puede aceptar el tratamiento TKI directamente sin necesidad de un ensayo basado en molecular de confirmación. Los pacientes con una puntuación de 0 tenían un alto VPN (93,06%). Sin embargo, las muestras con puntuación de 1+ o 2+ son fiables y necesitan una verificación adicional del estado de mutación de EGFR mediante el ensayo de base molecular. Por lo tanto, mediante el uso de nuestro algoritmo de diagnóstico, en casi la mitad de todos los pacientes (pacientes con puntuaciones de 0 o 3+), una aplicabilidad de la terapia de TKI se pudo determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica y prueba molecular más complejo, costoso evitarse. Las muestras con puntuación de 0 en ensayo basado en IHC con los anticuerpos-mutación específica dos EGFR deben ser probados más para la expresión de EGFR EGFR total usando anticuerpo monoclonal (D38B1), con el fin de reducir aún más la tasa de falsos negativos (Figura 5). Tomar juntos, en comparación con el uso de ensayo basado en IHC solo, este enfoque integrado que combina IHC- y ensayos basados ​​en moleculares demuestra una sensibilidad más alta (97,37%), especificidad (100%) y el valor de κ (0.979), y es por tanto más práctico para los pacientes examinados para una posible terapia de TKI. Nuestro algoritmo de diagnóstico potencialmente pueden optimizar las opciones terapéuticas, reducir costes y ahorrar tiempo
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"IHC" se refiere a análisis inmunohistoquímico.

Apoyo a la Información
Figura S1. Empresas El mutación da como resultado falsos negativos de IHC debido al bajo nivel de EGFR total. El nivel del total de EGFR en las células tumorales era tan bajo (A y D, 200 ×) que las proteínas mutantes fueron indetectables con anticuerpos mutación específica en determinados casos (B, C, E y F, 200 ×), a pesar de que las mutaciones eran identificado por ensayo basado molecular en los casos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059183.s001 gratis (TIF)

Reconocimientos

el estudio se realizó de acuerdo con el reglamentos de las juntas de revisión institucional de la Universidad de Medicina china.

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