Extracto
El cáncer de páncreas es una enfermedad agresiva con pronóstico sombrío. Es de suma importancia para entender los mecanismos etiológicos subyacentes e identificar novela, consistente y fácil de aplicar factores de pronóstico para la terapia de precisión. TUSC3 (supresor de tumor candidato 3) se identificó como un gen supresor de tumores potencial y estudio anterior mostró TUSC3 se disminuye en el cáncer pancreático a nivel de mRNA, pero su función supresora de tumor putativo queda por verificar. En este estudio, se encontró expresión TUSC3 ser suprimida tanto a nivel de mRNA y de proteínas en modelos de línea celular, así como en muestras clínicas; disminución de la expresión TUSC3 se asoció con mayor estadificación TNM patológico y peor resultado. En tres pares de líneas celulares con diferente actividad de NF-kB, se encontró que la expresión TUSC3 que se correlaciona inversamente con la actividad de NF-kB. línea celular de cáncer de páncreas silenciada-TUSC3 exhibió mayor potencial de proliferación, la migración y la invasión. En un modelo de ratón ortotópico implantado, TUSC3 silenciado células expuestas fenotipo más agresivo con más metástasis hepáticas. En conclusión, los actuales programas de estudio que la disminución de la tinción inmunológica TUSC3 es un factor de mal pronóstico de supervivencia en pacientes con cáncer de páncreas y disminución TUSC3 promueve la proliferación de células de cáncer de páncreas, invasión y metástasis. La correlación inversa entre la actividad y la expresión TUSC3 NF-kappa B puede sugerir un patrón de regulación novedoso para esta molécula
Visto:. Fan X, Zhang X, Shen J, Zhao H, Yu X, Chen Y, et al. (2016) Disminución TUSC3 promueve la proliferación del cáncer pancreático, invasión y metástasis. PLoS ONE 11 (2): e0149028. doi: 10.1371 /journal.pone.0149028
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |
Recibido: August 1, 2015; Aceptado: 26 Enero de 2016; Publicado: 12 de febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Fan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Shanghai Municipal Comisión 415 de Salud y Planificación Familiar (Grant No.201440345 a Xiaoqiang Ventilador) [http://www.wsjsw.gov.cn/WSJ /]. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad agresiva con pronóstico sombrío. Es el noveno cáncer más común en el mundo, pero es el cuarto de las muertes relacionadas con el cáncer [1], con aproximadamente 227.000 personas que mueren de esta enfermedad cada año [2]. La resección quirúrgica sigue siendo la única opción para la curación. Sin embargo, la mayoría de los pacientes se descubren en una etapa posterior por falta de síntomas específicos, perdiendo la posibilidad de resección curativa. Incluso aquellos que se sometieron a resección con intención curativa recaerá en general dentro de dos años [3]. agentes quimioterapéuticos convencionales y los nuevos fármacos diana molecular tienen efectos modestos sobre curso de la enfermedad [4-6], y mejoran ligeramente la supervivencia libre de enfermedad en un entorno de la terapia adyuvante [3, 7]. La estratificación de los pacientes según el riesgo de recurrencia ayudará a maximizar la personalización de la intervención y mejorar la eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos. En los últimos años, muchos factores patológicos se han establecido para predecir el pronóstico incluyendo el tamaño del tumor, grado tumoral, invasión vascular, metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión perineural [8]. Sistémicas índice inflamatorio y marcadores tumorales circulantes tales como CA 19-9 También se exploraron por su valor pronóstico [9-12]. También hay algunos marcadores moleculares que se sabe que son predictivos de la eficacia del tratamiento y el resultado a largo plazo, tales como Kras [13], EGFR y Her2 /neu et al [14]. Sin embargo, son aún insuficientes para los pacientes de consulta y terapia individualizada. Es de suma importancia para entender los mecanismos que contribuyen a la progresión de la enfermedad e identificar novela, consistente y fácil de aplicar factores de pronóstico para la terapia de precisión.
TUSC3 (supresor tumoral candidato 3), era identificado como un potencial gen supresor de tumores previamente. Se encuentra en la banda cromosómica 8p22, que se elimina con frecuencia en varios tipos de tumores incluyendo la próstata [15] y el cáncer de páncreas [16-18]. Por lo tanto, TUSC3 se supone que es un gen supresor de tumor. Es un homólogo de la subunidad de levadura Ost3p del complejo oligosacariltransferasa (OST), un complejo de proteína de membrana integral que cataliza la glicosilación ligada a N de las proteínas en el retículo endoplasmático (ER) [19, 20]. Más tarde, también se encontró TUSC3 estar implicado en el transporte de magnesio y la actividad oxidorreductasa [21]. Como N-glicosilación es una modificación postraduccional ubicua de proteínas eucariotas mediante la modulación de plegamiento de proteínas, los protege de la degradación, y la regulación de su función, así como su inmunogenicidad, disminución TUSC3 se supone que está implicado en la patogénesis del cáncer a través de la glicosilación [22]. Krainer y sus colegas probaron la expresión TUSC3 en 143 pacientes de próstata utilizando un microarray de tejido, y se encontró que el 13,3% de las muestras de tejido demostrado un descenso crudamente expresión de la proteína de TUSC3, pero el seguimiento de la cohorte no mostraron influencia TUSC3 el avance de la enfermedad general o sin la supervivencia [23]. En ovárico, TUSC3 También se encontró que era significativamente las reguladas en muestras de cáncer de ovario de grado superior [24]. Estudios posteriores mostraron su expresión bajos resultados de TUSC3 la hipermetilación del promotor y el estado de metilación del promotor TUSC3 tiene una influencia significativa e independiente en la supervivencia global y libre de progresión en pacientes con cáncer de ovario [25]. Tan temprano como en 2005, la supresión homocigotos y heterocigotos del gen TUSC3 fue descubierto en líneas celulares de cáncer de páncreas y las muestras con los estudios basados en arreglos genómicos [16]. Sin embargo, su función de supresor de tumor putativo queda caracterizado en esta enfermedad. Lo que también queda por dilucidar es si su expresión se asocia con el estadio clínico-patológica y si se lleva un valor pronóstico para el cáncer de esta entidad.
Nuestro objetivo es explorar si la expresión TUSC3 se asocia con las características clínico-patológicas de cáncer de páncreas y representa un factor pronóstico de esta enfermedad cancerosa y caracterizar la función de la molécula en la patogénesis de la enfermedad utilizando modelos de línea celular más y un modelo de ratón
Materiales & amp.; Métodos
Pacientes & amp; Las muestras
muestras incluidas en parafina de 117 pacientes con cáncer de páncreas (CP) que se sometieron a resección quirúrgica entre enero de 2002 y diciembre de 2012 en nuestro hospital fueron recuperados. No se encontraron; muestras de 69 hombres y 48 mujeres con una edad media de 60,2 años (edad media, 61 años de rango, 42 a 71 años). La mediana de seguimiento fue de 19 meses (rango, 1 a 69 meses.) El estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki 1975 y fue aprobado por el comité de ética del Hospital de Jimin, Shanghai, China. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado por escrito de este estudio.
La inmunohistoquímica
5μm espesor secciones de tejidos fueron desparafinados por calentamiento a 60 ° C y posteriormente rehidratados en xileno y alcoholes graduados. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con una solución de recuperación de DEPP-9 epítopo, seguido de tratamiento con H 2 en PBS (pH 7,4) para inactivar la actividad de peroxidasa 0,3%
2O
endógeno. Después de bloquear con suero del huésped anticuerpo secundario 10% durante 10 minutos, las secciones se incubaron en anticuerpo primario (policlonal de conejo a TUSC3, dilución 1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 hora a temperatura ambiente. diluciones de anticuerpos primarios se realizaron en suero del huésped anticuerpo secundario 10%. Las secciones, después de 2 × lavados con PBS, se incubaron en respectivos anticuerpos secundarios biotinilados [biotinilado anti-conejo IgG (BA-10000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.], diluido 1: 200 en 10% de suero durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de 45 minutos de incubación en StreptABComplex /HRP (K0377 Dako, Glostrup, Dinamarca). Las secciones se lavaron de nuevo dos veces con PBS y se incubaron en el sistema de Dako Liquid DAB + sustrato-cromógeno (K3468) hasta el desarrollo de color pardo. Esto fue seguido por tinción de contraste con hematoxilina de Meyer, la deshidratación y el montaje utilizando medio Eukitt.
Cada diapositiva se tiñó en las secciones de serie y examinado por 2 patólogos. La intensidad de la tinción se obtuvo como sigue: 0, negativo; 1+, débil tinción; 2 +, tinción moderada; 3+, fuerte tinción. Para el análisis semicuantitativo, se utilizó H-Resultado [26] en este estudio. Brevemente, se contaron más de 500 células tumorales en cada caso, y la H-score se generó posteriormente mediante la adición de los valores de porcentajes de fuerte tinción multiplicado por 3 porcentaje más de tinción moderada multiplicado por 2 porcentaje más de tinción débil multiplicado por 1. , dando un posible rango de 0-300. H-score más de 100 se observó que la alta expresión. También se examinó la expresión TUSC3 en la metástasis de los ganglios linfáticos (LN) en 24 casos y se compararon las diferencias de expresión TUSC3 entre la lesión primaria y la metástasis de los ganglios linfáticos. Ki 67 se obtuvo en la forma de porcentaje, es decir, índice de marcaje, independientemente de la intensidad de inmunotinción.
condiciones de cultivo celular
Quince líneas celulares humanas PC y una línea de células epiteliales de páncreas no tumorigénicos inmortalizado ( HPNE) fueron escogidos para este estudio. Todas las líneas celulares se obtuvieron como regalos de laboratorio del Dr. Paul J. Chiao en el MD Anderson, de la Universidad de Texas. ASPC-1, AsPC-1 mu [27], MDA pan28, MDA p28 mu [28], BxPC-3, Colo357, L3.6pl, MIAPaCa-2, PANC-1, PTAC43, PTAC50, PTAC53, PTAC66, y Capan -1 células se hicieron crecer como un cultivo celular monocapa en DMEM que contenía 4,5 mg /ml de D-glucosa y L-glutamina suplementado con suero bovino fetal 10%. células HPNE se cultivaron en medio D con una mezcla de medio M3 y DMEM que contiene un volumen de medio de cultivo M3 Base F (Incell Corp., San Antonio, EE.UU.), tres volúmenes de DMEM libre de glucosa, 10% de FBS, glucosa 5,5 mM , 10 ng /ml EGF, y 50 mg /ml de gentamicina. La línea celular 293T se cultivó en DMEM completo. HPNE /Kras /p16shRNA y HPDE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA eran líneas celulares de cáncer de páncreas (un regalo del laboratorio del Dr. Paul J. Chiao, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center) por transfección del plásmido relevante en HPNE y celular HPDE respectivamente [29]. /células HPDE Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA fueron cultivadas en medio libre de suero de queratinocitos.
La proliferación celular y Clonigénicas Ensayo
Para el ensayo de curva de crecimiento de las células, las células se sembraron en 24 pocillos placas (1 × 10
4 células /pocillo) por triplicado en medio de crecimiento. Las células se contaron en los días 1, 3 y 5. Los resultados se expresaron como la media ± error estándar de la media de tres experimentos independientes. Para probar la clonogenecity de las células PC TUSC3 silenciada, exclusión con azul tripan probados TUSC3 desmontables líneas de células viables y las células de control se sembraron scramble (100 /pocillo) en una placa de seis pocillos y después se incubaron durante aproximadamente 10-12 días a 37 ° C en un 5% de CO
2/5% de O
2/90% N
2 incubadora. Las colonias se tiñeron con 2% de cristal violeta. Un campo representativo para cada experimento fue fotografiado en un aumento de 100x. Por lo menos tres ensayos independientes se realizaron por triplicado. Los datos se muestran como el valor medio del número de colonias /por campo ± el error estándar de la media de tres experimentos independientes.
PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo de las células mediante la aplicación de TRIzol de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). calidad y la cantidad de ARN se midieron mediante un espectrofotómetro ND-2000 (Nanodrop). cDNA se sintetizó usando el PrimeScript RT Master Mix (Bio-Rad). cDNA (20 ng) se sometió a PCR en tiempo real a cabo con reactivos SYBR usando el sistema de PCR IQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA). β-actina se utilizó como gen de control interno. cebadores específicos fueron sintetizados por Sigma-Aldrich y las secuencias se describen como sigue: hTUSC3: cebador directo: 1275-AGACGGATAATTTGCCTAGTGGG-1297, cebador inverso: 1417-AGTGCCATGGTCCAAATCACA-1397. La trama se compara el nivel de expresión relativa de ARNm en varias líneas celulares de tumor de páncreas en comparación con el HPNE celular inmortalizada no tumorigénicos pancreático epitelial. Cada experimento se realizó tres veces y cada vez con tres repeticiones.
Lentiviral transducción
Desmontables de TUSC3 en la línea celular de cáncer de páncreas Colo357 se llevó a cabo mediante la entrega lentiviral utilizando el vector que contiene Plko.1 TUSC3 shRNA ( SKU: SR305331, OriGene Technologies, CO EE.UU.), y el embalaje línea celular HEK293T.. Se seleccionaron las células transducidas y se mantuvieron en un medio que contenía puromicina (3UG /ml).
Matrigel ensayo
50.000 células se sembraron por triplicado en una placa de 24 pocillos con cámaras de Boyden modificadas (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). La cámara inferior contenía 10% de FCS /cultura como quimioatrayente. Las células se incubaron durante 18 horas, se tiñeron con violeta cristal y se contaron bajo un microscopio.
inmunotransferencia
Las células se lisaron con tampón RIPA suplementado con comprimidos completos de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania ) y fosfatasa PhosSTOP Inhibidor de cóctel comprimidos (Roche Diagnostics). Después de la incubación durante 10 minutos en hielo, los lisados celulares se aclararon por centrifugación a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, y la concentración de proteína se determinó por el ensayo de absorbancia Bradford (Sigma Aldrich). Igual cantidad de fueron separadas por SDS-PAGE de lisados de proteínas (40μg), borrados en membranas PVDF (GE Healthcare, Chalfont St Giles, RU), se incubaron con el anticuerpo primario y peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios y se detectó con mejorado sistema de detección de quimioluminiscencia (Pierce ECL Western Blot sustrato, Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Se utilizaron anticuerpos y diluciones siguientes: ß-actina (1: 500, SC-1616, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), TUSC3 (1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, Reino Unido).
animales y ortotópico implantación de células de tumor pancreático
ratones desnudos
Balb /C fueron adquiridos de la Zona de Producción Animal del Centro Nacional Cancer Institute Frederick cáncer de Investigación y Desarrollo (Frederick, MD). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos Estados Unidos actuales, y los Institutos Nacionales de salud. Los ratones se utilizan de acuerdo con las directrices institucionales cuando eran de 8 a 12 semanas de edad.
Para producir tumores pancreáticos, TUSC3 silenciado células PC se recogieron de cultivos subconfluentes mediante una breve exposición a tripsina al 0,25% y 0,02% de EDTA . La tripsinización se detuvo con medio que contiene suero bovino fetal 10%, y las células se lavaron una vez en medio libre de suero y se resuspendió en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Sólo suspensiones que consisten en células individuales con mayor que 90% de viabilidad se usaron para las inyecciones. Un millón de células en suspensión en 50 l de HBSS fueron inyectados en el páncreas de ratones desnudos tal como se describe anteriormente. Los ratones fueron sacrificados después de 5 semanas de la inyección y necropsia. El tamaño y el peso de las metástasis hepáticas se registraron.
El análisis estadístico
Todos los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software Graph Prism 5.0 (San Diego, CA, EE.UU.). regresión de Cox se realizó con el programa SPSS versión 19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La comparación de medias en los datos distribuidos normalmente se realizó mediante la prueba t de Student 'de lo contrario se aplicó la prueba de Mann-Whitney no paramétrico o como se ha dicho. P-valores de igual o inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los gráficos de barras se representan utilizando los medios y las desviaciones estándar como barras de error, a menos que se indique lo contrario.
Resultados
TUSC3 expresión en muestras clínicas
Por inmunohistoquímica, TUSC3 está ausente en el estroma de páncreas células, pero casi todas las células epiteliales de los conductos pancreáticos, células acinares e islotes mostraron inmunoreactividad (figura 1A y 1C). Se evaluó la correlación entre los datos de expresión y los parámetros clínicos, incluyendo la edad del paciente, el sexo, el tamaño del tumor, la ubicación, el grado, la clasificación del tumor primario (PT), metástasis de ganglios linfáticos (PN), metástasis a distancia (PM). expresión TUSC3 se observó en diversos grados en células de carcinoma de páncreas en el citoplasma (Fig 1B y 1C). TUSC3 se detectó en 38/117 (32,48%) pT especímenes con H-puntuación de 83.42 ± 2.882, en 14/58 (24,14%) pN especímenes con H-puntuación de 66.81 ± 4.265, y en 4/11 (36,36%) especímenes pM con H-Resultado 79.55 ± 7.818. La expresión de TUSC3 se disminuye de manera espectacular en los LN metastásicas en comparación con las muestras de tumor primario emparejados (H-score: p & lt; 0,001) (Fig. 1D)
(A) expresión TUSC3 en tejidos pancreáticos no neoplásicas (acinares , el conducto y los islotes). (B) la expresión TUSC3 en las células de cáncer de páncreas. (C) la expresión bajo TUSC3 en las células de cáncer de páncreas en comparación con islotes. (D) Comparación de la tinción TUSC3 en PC primario y la metástasis LN (-test t emparejado, p & lt; 0,001, n = 58). aumento original × 200.
Disminución de la expresión TUSC3 se asocia con mayor estadificación TNM patológico y mal pronóstico
En general, 69 hombres y 48 mujeres con PC fueron incluidos en este estudio de cohorte. La edad media al diagnóstico fue de 64,6 ± 10,3 años. La mediana de supervivencia fue de 19 meses (rango: 3-78 meses). El estadio del tumor se define como T
1 N
0M
0 en 8 pacientes (6,84%), T
2 N
0M
0 en 20 pacientes (17,09%), T
3N
0M
0 en 24 pacientes (20,51%), T
1 N
1 M
0 en 9 pacientes (7,69%), T
2 N
1 M
0 en 18 pacientes (15,38%), T
3N
1 M
0 en 21 pacientes (17,95%), T
4 N
0M
0 en 2 pacientes (1,71 %), T
4N
1 M
0 en 4 pacientes (3,42%), T
2-3N
0M
1 de cada 5 pacientes (4,27%) y T
1-4N
1 M
1 de cada 6 pacientes (5,13%). 101 pacientes recibieron quimioterapia, incluyendo 75 pacientes que recibieron quimioterapia adyuvante, y 26 pacientes que recibieron quimioterapia paliativa. Para 11 pacientes con metástasis hepáticas descubierto durante el funcionamiento, todas las lesiones metastásicas visibles se han eliminado correctamente.
La relación entre el nivel de expresión TUSC3 y las características clínico-patológicas de los pacientes con PC se muestra en la Tabla 1. Bajo la expresión TUSC3 se asoció con mayor el tamaño del tumor (p = 0,039), mayor nivel de CA 19-9 en suero (p = 0,034), la permeabilidad más linfática (p = 0,031), y una mayor Ki-67 etiquetado índice (p & lt; 0,001) guía empresas
a. investigan si el nivel de expresión de la proteína TUSC3 y otros factores clínico-patológicos están asociados con el resultado clínico de los pacientes con CP, modelos de riesgo proporcional de Cox univariante y multivariante para CSS (la supervivencia del cáncer específico) y se calcularon RFS (supervivencia sin recidiva). Entre los 117 pacientes, la muerte se produjo en 62 de 79 (78,5%) pacientes con bajo nivel de proteínas TUSC3 y en 22 de 38 (57,9%) pacientes con nivel de expresión de proteínas de alta TUSC3 (P & lt; 0,021). La figura 2A muestra las curvas de Kaplan-Meier para la CSS y revela que el bajo nivel TUSC3 es un factor predictivo de mal pronóstico en pacientes con CP (p = 0,0416, prueba de log-rank). Entre los 117 pacientes, la recurrencia ocurrió en 69 de 79 (87,3%) pacientes con bajo nivel de proteínas TUSC3 y en 24 de 38 (63,2%) pacientes con nivel de expresión de proteínas de alta TUSC3 (p & lt; 0,0001). La figura 2B muestra las curvas de Kaplan-Meier para la RFS y revela que el bajo nivel TUSC3 es un factor predictor de mayor riesgo de recurrencia en pacientes con CP (p = 0,0043, prueba de log-rank).
La tinción inmunohistoquímica de TUSC3 es asociado con la supervivencia global (A) y la supervivencia libre de recurrencia (B) después de la resección curativa del cáncer de páncreas
El análisis univariante estadio tumoral alto identificados (etapa I + II vs vs III IV P & lt; 0,001)., nivel de CA 19-9 en suero elevada (CA 19-9 & lt; 300IU /ml vs /ml, p = 0,034 CA199≥00IU), la administración de la quimioterapia (quimioterapia versus ningún tratamiento, p = 0,025), y la disminución del nivel de expresión TUSC3 (p = 0,015) como pobre pronóstico factores de RFS en esta cohorte de estudio. Y estos factores también son predictivos de mala supervivencia global en esta cohorte. El género, la edad al momento del diagnóstico y el grado tumoral no se asociaron significativamente con el resultado clínico (Tabla 2).
Para determinar el valor pronóstico independiente de la TUSC3 para CSS y RFS, un análisis multivariante mediante un proporcionales de Cox se realizó un modelo de riesgos. En el análisis multivariante que incluía la edad, el grado del tumor, el estadio tumoral, la administración de la quimioterapia, el nivel de CA 19-9 en suero y el nivel de expresión TUSC3, identificamos el estadio del tumor, la administración de la quimioterapia, y el nivel de expresión de proteínas de bajo TUSC3 como factores pronósticos independientes para CSS y RFS ( TUSC3 expresión de RFS, p = 0,020; TUSC3 expresión de CSS, p = 0,027, Tabla 2)
TUSC3 expresión está disminuida en líneas celulares de cáncer de páncreas mediadas por NF-kB
para caracterizar.
in vitro
función de TUSC3, en primer lugar, hemos examinado la expresión TUSC3 de diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas. PCR en tiempo real reveló TUSC3 se redujo a nivel de mRNA en todas las 11 líneas de células tumorales pancreáticas ensayadas (Fig 3A). Western Blotting reveló que también estaba deprimido a nivel de proteína en estas líneas celulares (Figura 3B).
TUSC3 se reduce en las líneas celulares de cáncer de páncreas, tanto a nivel de ARNm (A) y el nivel de proteína (B).
Para explorar si la expresión TUSC3 se correlaciona con la actividad de NF-kB, hemos examinado la expresión TUSC3 tanto a nivel de ARN y proteínas en tres pares de líneas celulares de cáncer de páncreas con diferente actividad de NF-kB. AsPC-1 mu es una célula hija fabricada por Paul J. Chiao et al transfectando IκBαM (S32,36A) en la línea celular de cáncer de páncreas parental AsPC-1, lo que resulta en una línea de células tumorales con una disminución de la actividad de NF-kB y la disminución de hígado potencial metástasis [27]. En este par de modelo de células, se demostró que la expresión de TUSC3 AsPC-1 mu es mayor que la de AsPC-1 (Fig 4A), lo que sugiere que TUSC3 está regulada por la actividad de NF-kB. El mismo patrón de expresión se encuentra en otro par de líneas celulares, MDA p28 y MDA mu p28 (Fig 4B). MDA p28 mu es una línea celular hija también producida en el laboratorio del Dr. Paul J. Chiao mediante la transfección mu IκBαM (S32, 36A) Iκ en la línea celular MDA p28, dando como resultado la actividad de NF-kB atenuada y suprime la metástasis del hígado (datos no publicados). expresión TUSC3 se mejora en MDA mu p28 en comparación con MDA p28. L3.6pl es una línea de células hija con mucho más potencial de metástasis hepáticas de inyecciones consecutivas de los padres Colo357 en ratones desnudos. Se demostró previamente que L3.6pl exhibe mayor actividad de NF-kB de Colo357 [30]. Y curiosamente, la expresión es mayor en TUSC3 Colo357 que en L3.6pl tanto a nivel de ARNm y proteínas (figura 4C). Todos estos tres pares de líneas celulares parecían mostrar el mismo patrón de expresión TUSC3 en relevancia para la actividad de NF-KB que implica que TUSC3 se correlaciona negativamente con la actividad de NF-kB.
(A) AsPC-1 y AsPC -1 mu con la actividad de NF-kB deprimida. (B) p28 MDA y MDA mu p28 con la actividad de NF-kB deprimido. (C) Colo357 y la línea celular L3.6pl hija con la actividad de NF-kB mejorada. Para cada figura, gráfico de la izquierda representa resultado de RT-PCR, gráfico de la derecha representa Western blot para TUSC3.
Disminución TUSC3 promueve la proliferación celular, la migración y la invasión
Para estudiar la función supresora de tumores de TUSC3, shRNAs fueron diseñados para derribar la expresión de TUSC3 en
in vitro
modelo de cáncer de páncreas en. Como padres línea celular de una célula hija altamente metastásico con actividades NF-? B comparables, Colo357 fue elegido para el siguiente experimento. Ambos ARNm y los niveles de proteína se detectaron para confirmar la eficacia del silenciamiento (Fig 5A y 5B). Investigamos el efecto de silenciar TUSC3 sobre la proliferación celular, la formación de colonias, la migración, y de las condiciones de invasión. Cabe destacar que, después de 72 horas en cultivo, las células TUSC3 silenciada ganaron una ventaja de supervivencia significativa en contraste con los controles (Figura 5C y 5D). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011). Cada vez son más grandes colonias formadas por células tumorales TUSC3 silenciadas (Figura 5E y 5F). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001). A continuación, se utilizó ensayo basado en Matrigel para analizar los efectos de la caída TUSC3 sobre la migración y la matriz extracelular (ECM) invasión de células de cáncer de páncreas. Con 10% de FCS como atrayente, TUSC3 silenciado células muestran una mayor migración y la invasión a través de la membrana de inserción en contraste con las células de control (Fig 5 g, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001 Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001; Fig 5H y 5I, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001)). Un ensayo de cicatrización de la herida apoyada además estos resultados, lo que demuestra el aumento de la migración y el consiguiente cierre mejorado de la monocapa epitelial de las células en condiciones de bajo suero (5% FCS) después de 18 horas (Figura 5J).
(A, B ) TUSC3 efectivamente es derribado en líneas de células Colo357 mostradas por (a) RT-PCR y (B) transferencia de Western. (C, D) La proliferación se ve reforzada con TUSC3 caída, el recuento de número de células son significativamente diferentes a las 72 horas (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011) (D). (E, F) La formación de colonias se ve reforzada con TSUC3 desmontables (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001). (G) Prueba de Migración (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001). (H, I) Prueba de Invasión (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p & lt; 0,0001). (J) Ensayo de la cicatrización de heridas mostró más rápida de cierre de la brecha en TUSC3 células silenciadas. Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces con figuras representativas se muestran como anteriormente.
Disminución TUSC3 promueve la metástasis de hígado ortotópico en ratones modelo implantado
Para explorar aún más el efecto de TUSC3 sobre la metástasis PC, nos inyectada TUSC3 silenciado células tumorales de forma ortotópica en el páncreas en ratones desnudos y modelos animales establecidos. Cinco semanas después de la inyección de las células Colo357 shRNA2 y Colo357 shRNA3, todos los ratones enfermaron y fueron sacrificados. De las imágenes podemos ver aparentemente la metástasis hepática de TUSC3 silenciada tumor es más grande que la de control (Fig 6A). A continuación, las metástasis hepáticas fueron ponderados y se compararon con t-texto, Colo357 shRNA2 vs Colo357 Scramble (p = 0,0444), Colo357 shRNA3 vs Colo357 Scramble (p = 0,0443). Tomados en conjunto, TUSC3 silenciado células expuestas fenotipo más agresivo con más metástasis que aparece en el hígado después de que los ratones fueron sacrificados. Se realizó IHC, así como RT-PCR para comparar el nivel TUSC3 entre los focos primario y lesiones metastásicas de las muestras ortotópico modelo inyectados. En comparación con las muestras de los ratones inyectados con líneas celulares TUSC3 revueltos, los de TUSC3 shRNA2 y TUSC3 shRNA3 muestran una disminución de los niveles de expresión de TUSC3 ambos con IHC (S1 figura) como a nivel de mRNA (Figura S2).
(A) aspecto macroscópico de las muestras de hígado resecado de ratones inyectados con dos grupos de TUSC3 silenciada PC (Colo357 shRNA2 y Colo357 shRNA3) y el control (Colo357 Scramble). metástasis hepáticas grandes son visibles en el grupo Colo357 shRNA2 y Colo357 shRNA3. (B) Las metástasis hepáticas fueron ponderados y se compararon mediante la prueba t.
Discusión
El presente estudio muestra que la expresión TUSC3 se disminuye en las muestras primarias de cáncer de páncreas y su regulación a la baja es pronóstico de mal pronóstico a largo plazo.
in vitro
estudio de línea celular y
in vivo
modelo animal proporciona una evidencia directa que sugiere su papel de la función supresora de tumores en la iniciación y progresión del cáncer pancreático. Además, el estudio revela expresión TUSC3 se reduce con una mejora de la actividad de NF-kB, indicativo de un nuevo modelo de regulación para esta molécula
.
Aunque se ha informado de TUSC3 mRNA se disminuye en las muestras de cáncer de páncreas en comparación con la vecina no tejido cancerosa, y la pérdida recurrente de 8p22, que contiene gen TUSC3 se encuentra en el cáncer de páncreas [17, 18], ningún estudio previo ha detectado nunca expresión TUSC3 a nivel de proteína en la enfermedad. Esto es de hecho muy necesario dado que la proteína es el ejecutor real de gen y la información genética. En este estudio, no sólo se detectó TUSC3 ARNm utilizando líneas de células, pero también detectó su expresión a nivel de proteínas con inmunohistoquímica en muestras clínicas y el Western Blot en líneas celulares. Los resultados son consistentes y confirmaron que TUSC3 es dramáticamente deprimida en el cáncer de páncreas, tanto en las muestras primarias y en líneas celulares tumorales, tanto a nivel de ARNm y proteínas. Más interesante, TUSC3 tenía correlación inversa con la actividad de NF-kB por lo menos en algunas líneas de células tumorales pancreáticas y está en coherencia con los distintos grados de malignidad. transfectadas con IκBαM AsPC-1 y MDA mu mu p28 son menos malignos con la actividad de NF-kB atenuada, y se aumenta su expresión TUSC3. Es de destacar que esta relación negativa también se encuentra en otro par de líneas celulares, para el que se adquirió la línea de célula hija a través de inyecciones consecutivas de la línea celular parental en ratones desnudos en lugar de por manipulación de la transfección. Todos estos resultados sugieren expresión TUSC3 puede estar regulada por la actividad de NF-kB, al menos en algunas líneas celulares de tumor. Anteriormente, TUSC3 baja regulación ha demostrado debido a la eliminación homocigotos y heterocigotos en el cáncer de próstata, la hipermetilación del promotor en el cáncer de ovario [25]. A pesar de que se encuentra con frecuencia que ser borrado en el cáncer de páncreas [16-18], nuestros resultados sugieren una regulación transcripcional novedoso para esta molécula en esta entidad cáncer. Es posible que los mecanismos TUSC3 baja regulación varían de acuerdo con diferentes tipos de tumores. Por ejemplo, los primeros estudios mostraron TUSC3 no se hypermethylated en el carcinoma colorrectal [31], sin embargo hipermetilación es el principal mecanismo para TUSC3 baja regulación en cáncer de ovario e incluso tiene un valor pronóstico [25]. También es posible que la expresión TUSC3 puede ser regulado por diferentes medios, incluso en el mismo tipo de tumor en función de los diferentes pacientes o líneas celulares. No se descarta otro posible mecanismo de regulación, tales como mediada por silenciamiento de micro-ARN. La activación de NF-kappa B y la expresión de sus genes diana aguas abajo tales como la citocinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral-α e IL-1 son enlaces mecánicas entre la inflamación y la tumorigénesis [32]. La pérdida de TUSC3 puede desestabilizar el sistema RE rugoso e inducir inflación del sistema de cisternas y altera la señalización de la respuesta de estrés ER en el cáncer de próstata [23] y el cáncer de ovario [33]. Teniendo en cuenta la participación de NF-kB en el cáncer [34] y la participación de TUSC3 en N-glicosilación, la posible correlación inversa entre TUSC3 y NF-kB puede tender un puente sobre NF-kappa B y N-glicosilación en la patogénesis del cáncer, que merece más estudio.
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