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PLOS ONE: Dll4-Notch de señalización bloqueo sinergia Combinada Ultrasonido estimulada de microburbujas y radioterapia en cáncer de colon humano Xenografts

2013/6/19


Extracto

tumor vasculatura actúa como un medio de vida esencial para la progresión del tumor y facilita la diseminación metastásica. vascular Novel estrategias de focalización con el objetivo de mantener el apagado vascular potencialmente podría inducir daños sustanciales, lo que resulta en un retraso del crecimiento tumoral significativa. Se investigó la combinación de dos agentes vasculares orientación complementarias novedosos con la terapia de radiación en una estrategia destinada a sostener la interrupción vascular. Los experimentos se llevaron a cabo con el ligando delta-4 como (Dll4) bloqueo (angiogénesis desregulador) de tratamiento se administra en combinación con un tratamiento de destrucción vascular basada en la radiación en una línea de tumor de cáncer de colon bien perfundido-altamente agresivo implantados en ratones desnudos atímicos hembra. Los tumores se trataron con permutaciones de la radiación, las microburbujas de ultrasonido estimulada (USMB) y el anticuerpo monoclonal Dll4 (mAb). respuesta vascular del tumor fue evaluada con ecografía tridimensional Doppler para medir el flujo activo e inmunohistoquímica. La respuesta tumoral se evaluó con ensayos histoquímicos y mediciones longitudinales de volumen del tumor. Nuestros resultados sugieren una respuesta significativa del tumor en animales tratados con USMB combinado con la radiación, y Dll4 mAb, que conduce a un retraso del crecimiento tumoral sinérgica de hasta 24 días. Esto está probablemente ligado a la muerte celular rápida dentro del tumor y un cierre vascular tumor sostenida. Llegamos a la conclusión de que los tratamientos de combinación triples causan un cierre vascular seguido por una inhibición sostenida de la angiogénesis y la muerte de las células tumorales, lo que lleva a una basada en vascular "colapso" rápido del tumor y un retraso del crecimiento tumoral significativa

Visto:. El Kaffas a, J Nofiele, Giles a, S Cho, Liu SK, Czarnota GJ (2014) Dll4-Notch de señalización bloqueo sinergia combinada Ultrasonido estimulada de microburbujas y Terapia de Radiación de colon humano en xenoinjertos de cáncer. PLoS ONE 9 (4): e93888. doi: 10.1371 /journal.pone.0093888

Editor: Ramani Ramchandran, Colegio Médico de Wisconsin, Estados Unidos de América

Recibido: 7 Agosto, 2013; Aceptado: March 10, 2014; Publicado: 15 Abril 2014

Derechos de Autor © 2014 El Kaffas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Terry Fox a través de un programa de subvención para el proyecto "Ultrasonido en la terapia del cáncer". El Dr. Gregory Czarnota es un médico-científico y es apoyado por una Cátedra de Investigación en CCO Terapéutica Experimental e Imagen. El Dr. Stanley Liu es un médico-científico y el apoyo de un OICR (Ontario Instituto de Investigación del Cáncer) Premio al Investigador etapa temprana y reconoce el apoyo del PCC (cáncer de próstata Canadá). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Canción Cho es empleado por MedImmune. Esto no altera la adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.

Introducción

Los tumores requieren la activación de un "interruptor" angiogénico para crecer más allá de 1-2 mm
3 en volumen. el desarrollo vascular en los tumores se produce a través de la liberación de diversos factores de crecimiento y reguladores de la angiogénesis endotelial (es decir, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), derivado de plaquetas factor de crecimiento (PDGF), el ligando delta-como 4 (Dll4)), que conduce a neovascularización predominantemente a través de un proceso de germinación reminiscencia de desarrollo embrionario [1] - [3]. vasos de neoformación proporcionan una línea de vida de los nutrientes y el oxígeno que permita un mayor crecimiento del tumor. Los medicamentos anti-angiogénicos, originalmente diseñados para bloquear el desarrollo de la vasculatura del tumor, se han convertido en importantes terapias contra el cáncer. Durante algún tiempo, los agentes anti-VEGF farmacológicas ganaron terreno importante en la selección de la angiogénesis, pero se encontró que eran menos eficaces de lo previsto originalmente, debido a los mecanismos de resistencia del tumor [4], [5]. Sin embargo, estos agentes han mostrado ser útiles cuando se combinan estratégicamente con otras terapias contra el cáncer [6]. En la actualidad, los agentes farmacológicos dirigidos a diferentes aspectos de la angiogénesis tumoral están siendo desarrollados e investigados en relación con diversas modalidades terapéuticas existentes.

Una variedad de factores fisiológicos y biológicos estimular el desarrollo vascular del tumor (es decir, la hipoxia). Estos estímulos actúan como colas externas para angiogénico VEGF (es decir, Dll4) de señalización molecular. La vía de Notch se ha demostrado para regular el surgimiento de nuevos vasos en los tumores [7], [8]. El ligando de Notch Dll4 se encontró para proporcionar señalización de regulación aguas abajo crítico para iniciar estímulos VEGF [9], [10]. Esta vía ha sido identificado como un objetivo prometedor nuevo tratamiento contra el cáncer [9]. Los estudios han demostrado que la inhibición de la señalización Dll4 resultados en la angiogénesis excesiva pero no funcional en el tejido del tumor [11], [12]. Además, Dll4 bloqueo provoca un retraso significativo del crecimiento tumoral en diferentes líneas de células tumorales [11], [12]. Los estudios también han demostrado el potencial de Dll4 bloqueo en combinación con otras terapias contra el cáncer [8], [11] - [15]. Un estudio reciente observó aumento sinérgico de retraso del crecimiento del tumor cuando un anticuerpo monoclonal neutralizante Dll4 (mAb) se combinó con la terapia de radiación [15].

Junto a los numerosos agentes farmacológicos que han sido desarrolladas para la angiogénesis, vascular biofísico emergentes agentes, incluyendo microburbujas de ultrasonido estimulada y nanopartículas de oro de orientación, también se han demostrado para aumentar la eficacia del tratamiento convencional del cáncer [16] - [19]. Estos se han sugerido para causar un rápido inicio de la parada vascular del tumor y /o aumento de la permeabilidad pared del vaso, que actúa para mejorar estratégicamente la eficacia de fármacos contra el cáncer o terapia de radiación. . Más recientemente, Czarnota
et al
[19] - [23] demostraron que las microburbujas de ultrasonidos estimulada (USMB) aumenta la muerte de células tumorales en las líneas de la próstata, la vejiga y de células de cáncer de mama. Se postula que la mejora de la respuesta a la radiación estaba relacionado con el daño de la membrana biofísica de las células endoteliales de tumores asociados con la estimulación de microburbujas, que posteriormente conducen a la señalización de ceramida y un cierre vascular debido a la muerte de las células endoteliales [22]. Las observaciones están potencialmente vinculados a informado recientemente,
asmase
dependiente, la apoptosis endotelial aguda después de grandes dosis únicas de radiación [2], [24], [25].

En este trabajo, hemos investigado Dll4-bloqueo luego de la ecografía de microburbujas combinado y destrucción vascular basada en la radiación en una línea de cáncer de colon altamente agresivo y buena perfusión. Los tumores se dejaron crecer en la pata trasera de los ratones y se trataron con permutaciones de radiación, USMB y el anticuerpo monoclonal Dll4 (mAb). Los animales fueron imágenes en tres dimensiones utilizando la ecografía Doppler-poder para investigar los cambios en la perfusión tumoral (flujo sanguíneo) con el tratamiento.

de alta frecuencia de ultrasonido Doppler de potencia tridimensional es una técnica de imagen ideal para la evaluación preclínica de la vasculatura del tumor en modelos animales [26] - [28]. Se da de alta resolución información estructural y detección de la señal de flujo Doppler mejorada. Además, su uso fácil hace que sea adecuada para los estudios longitudinales, donde los cambios relativos en la vasculatura se pueden evaluar. Doppler resultados se complementaron con densidades vasculares determinados a partir de CD31 tinción de tumor secciones transversales. La respuesta tumoral a Dll4 mAb, ultrasonido-microburbujas y la terapia de combinación de radiación también se evaluó con las mediciones de los ensayos de inmunohistoquímica y el crecimiento tumoral.

Los resultados indican que el bloqueo Dll4 seguido de USMB y la radiación produce un retraso en el crecimiento del tumor sinérgico mayor que cuando la radiación se combina con Dll4 mAb solo. Estos resultados también sugieren que USMB y actuar radiación para cerrar de forma aguda por la vasculatura del tumor, como en otros tipos de tumores, pero que debido a la naturaleza agresiva de la línea celular de cáncer de colon, un rebote rápido del tumor sigue. El tratamiento con mAb Dll4 continuación, se desregula neo-vascularización, lo que lleva a la vasculatura tumoral mínimamente funcional y un tumor vascular sostenida "colapso". Por lo tanto, la combinación de bloqueo DLL4 con USMB y la radiación es una novela, enfoque muy eficaz para retrasar el crecimiento del tumor a través de abordaje biológico y biofísica de la vasculatura del tumor.

Materiales y Métodos

xenoinjerto del tumor Model

Todos los experimentos con animales se presentan en este trabajo se llevaron a cabo en cumplimiento de las directrices reconocidas internacionalmente especificados en los protocolos aprobados por el cuidado de animales institucional y el uso Sunnybrook Research Institute. Todos los animales procedimientos se realizaron bajo anestesia, tal como se describe a continuación, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Para este estudio, hasta 90 animales se dividieron al azar en 3 cohortes. Los animales en la cohorte 1 se sacrificaron a las 24 horas, los animales en la cohorte 2 fueron sacrificados a los 7 días y los animales en la cohorte 3 se mantuvieron para la evaluación del crecimiento del tumor de hasta 30 días. Con el fin de iniciar el crecimiento del tumor, LS174T (3 × 10
6) células de cáncer de colon (ATCC, Manassas, VA) se inyectaron por vía subcutánea en la pata trasera derecha de 6 a 7 semanas de edad, los ratones desnudos atímicos hembra (Harlan, Indianápolis, IN). Todos los tumores crecieron durante 9-14 días para llegar a un volumen medio de 200 mm
3. Una media de 5 animales fueron utilizados por condición de tratamiento para cada uno de los métodos de evaluación de tratamiento (es decir, Doppler de potencia, retraso en el crecimiento, la inmunohistoquímica).

Administración Tratamiento

animales portadores de tumor se les dio una de seis tratamientos: (1) sin tratamiento (CTRL), (2) la radiación (XRT), (3) Dll4 mAb, (4) XRT y Dll4 mAB (5) microburbujas de ultrasonidos estimulada (USMB) combinado con XRT, o ( 6) una triple combinación de USMB, XRT y Dll4 mAb. Los animales fueron anestesiados con isofluorano antes de exponer o para la inserción del catéter (cuando se recibe tratamiento USMB). Todos los animales que recibieron la terapia de radiación fueron tratados con una sola dosis de 5 Gy de radiación ionizante se administra usando un gabinete irradiador Faxitron (Faxitron Biópticos, Lincolnshire, IL), el uso de rayos X a una energía de 160 kVp, un SSD de 35 cm, y una velocidad de 200 cGy /min la dosis. Para el tratamiento de radiación, el cuerpo de cada animal se cubrió con 3 mm de espesor blindaje de plomo, exponiendo sólo el tumor. Los animales que recibieron el anticuerpo monoclonal Dll4 (mAb; MedImmune LLC, MD) se les administró el mAb dos veces por semana, a partir del día siguiente de tratamiento de imágenes, a una dosis de 5 mg /kg de peso corporal. Los animales que reciben la radiación en combinación con Dll4 mAb, recibieron el tratamiento anti-Dll4 mAb 1 hora después de la irradiación inicial. tratamiento Dll4 mAb se continuó en los animales hasta el sacrificio (a las 24 horas o 7 días), o hasta un volumen de tumor alcanzó al menos el doble del volumen original. Un esquema del programa de entrega y el tratamiento de imágenes se presenta en la figura S1A.

En los animales tratados con USMB, microburbujas Definity (cáscara de gas /liposoma perfluoropropano, Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA) se prepararon utilizando una dispositivo Vialmix (Lantheus Medical Imaging) y administrado a través de un catéter en la vena caudal a una concentración en volumen de 3% v /v (1.08 × 10
9 microburbujas en 90 l), que es aproximadamente 300 veces la dosis de diagnóstico por imagen recomendada de 10 UL /kg [19]. Los animales se sumergieron entonces en un baño de agua a 37 ° C con el fin de estar expuestos a ultrasonidos. El sistema de tratamiento está diseñado de tal manera que sólo la parte inferior del cuerpo del animal se sumerge en el baño de agua, dejando al descubierto sólo el volumen del tumor al campo de ultrasonidos en el foco del transductor. El sistema de terapia de ultrasonido involucrado un sistema de micro-posicionamiento, generador de forma de onda (AWG520, Tektronix, Beaverton, Oregón), amplificador de potencia con generador de impulsos /receptor (RPR4000, Ritec, Rochester, NY), y un sistema de adquisición digital (CC103, Agilent, Monroe , NY). Los tumores se expusieron en el medio pico máximo de la señal acústica (-6 dB ancho de haz en el punto focal de 3,1 cm, y se concentraron a 8,5 cm) utilizando un tono de 16 ciclos de ráfaga a 500 kHz frecuencia central con un ultrasonido de 2,86 cm de diámetro elemento transductor (ILO509HP, Valpey Fisher Inc., Hopkinton, MA). Una frecuencia de repetición de impulsos 3 kHz más de 50 ms se utiliza para la sonificación, junto con una presión negativa de pico ajustado a 570 kPa, lo que corresponde a un índice mecánico (MI) de 0,8. El tiempo total de tratamiento con ultrasonidos fue ~ 5 ms dentro de cada ventana de 50 ms. Se empleó un periodo de 1950 ms intermitente entre las ventanas de sonificación para minimizar el calentamiento del tejido biológico en las exposiciones en ecografía. El tiempo total insonificación tumor fue de 750 ms más de 5 minutos para un ciclo de trabajo global de 0,25% [19]. Esta secuencia de impulsos en particular ha sido demostrado que tiene buenos efectos radiosensibilizadores, al tiempo que permite los vasos sanguíneos se vuelva a llenar con las burbujas de 150 veces durante el tratamiento. Los tumores fueron irradiados con una dosis de 5 Gy de radiación ionizante inmediatamente después del tratamiento USMB.

de alta frecuencia de ultrasonido Doppler de potencia Imaging

Todos los animales fueron imágenes con ultrasonido tridimensional de alta frecuencia inmediatamente antes del tratamiento y 24 horas después del tratamiento. Los datos fueron adquiridos utilizando una alta frecuencia dispositivo de ultrasonido de imágenes Vevo 770 (VisualSonics, Toronto, ON) con un transductor de 30 MHz frecuencia central (RMV-707:55 micras de resolución axial, 115 micras resolución lateral, distancia focal de 12,7 mm). Una etapa de exploración motorizada (VisualSonics, Toronto, ON) se utilizó para adquirir imágenes en 3D en modo B y los datos de flujo Doppler de potencia, en un tamaño de paso de 0,2 mm. los datos Doppler de potencia se recogió con la siguiente configuración: un desorden-filtro de corte de 1-2 mm /s, una velocidad de barrido de 1 mm /s, una frecuencia de repetición de impulsos de 5 KHz, una ganancia Doppler de potencia de 20 dB y una velocidad de fotogramas menor de 10 fps. análisis de imágenes Doppler de potencia se llevó a cabo utilizando el software de desarrollo propio en MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). El índice de la vascularidad (VI) se calculó a partir de imágenes Doppler de potencia mediante la obtención del volumen de todos los objetos de color (píxeles de colores) sobre el volumen de la ROI seleccionada. Se utilizó un índice de vascularización relativa para evaluar la respuesta a la terapia vascular global, calculada de la siguiente manera: ((VI
24 Horas /VI
0 horas) × 100) -100) o ((VI
7 Días /VI
0 horas) × 100) -100).

Análisis histológico

Los ratones fueron sacrificados 24 horas, y en otra cohorte, a los 7 días después del tratamiento para histología e inmunohistoquímica. Las secciones transversales de xenoinjertos de tumor se tiñeron con hematoxilina & amp; eosina (H & amp; E) para evaluar la necrosis después de la terapia. El tumor de xenoinjerto secciones transversales se tiñeron también de roturas en el ADN utilizando
In situ
fin de etiquetado (ISEL) mancha como un marcador de la muerte celular, y grupo de diferenciación (CD31) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) para evaluar la densidad vascular. La muerte celular se evaluó cuantitativamente para cada uno de tumor ISEL-manchado secciones transversales. Esto se llevó a cabo utilizando-encargo MATLAB (The MathWorks, Natick, MA) de rutina, que permite al usuario para calcular el número de píxeles de color marrón (ISEL-manchado) sobre el número total de píxeles por sección transversal tumor conjunto. La densidad vascular también se calculó a partir de imágenes de CD31 tumorales manchado secciones transversales. Para cada sección transversal, 4 campos de visión (FOV) se analizaron en un aumento de lente objetivo de 10X para calcular la densidad de la vasculatura. Esto se llevó a cabo usando MATLAB (The MathWorks, Natick, MA) para distinguir las regiones de color marrón de colores (tinción CD31 de las células endoteliales) en el tumor de la mancha de fondo (otras células).

tumor Evaluación del Crecimiento

el crecimiento del tumor se evaluó en un promedio de 5 animales por condición de tratamiento. El volumen del tumor se determinó mediante mediciones de la pinza realizada cada 2-4 días y se calcula utilizando la fórmula modificada elipsoidal (volumen = longitud x anchura
2/2). volúmenes de los tumores se normalizaron a su volumen de partida y el crecimiento tumoral de retardo se calcula restando el número medio de días para los grupos de tratamiento para llegar a dos veces su volumen de partida de la del grupo de control.

Análisis estadístico

relativas de tinción y el crecimiento tumoral retrasos VI, ISEL y CD31 cuantificados, se evaluó la significación estadística usando una prueba de Mann-Whitney (dos colas, suponiendo varianzas desiguales; α = 0,05). Cada condición de tratamiento se comparó directamente a la condición de control 0 Gy. Además, los valores de p de pruebas estadísticas de diferentes permutaciones se han resumido en las Tablas S1 a S7 en los datos suplementarios. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando Prism (GraphPad Software versión 5, La Jolla, CA).

Resultados

Hemos llevado a cabo experimentos para evaluar la eficacia de las estrategias de reconocimiento vascular en USMB, la radiación y anti-Dll4 tratamientos se combinaron para interrumpir la vasculatura del tumor y sostener efectos vasculares con el fin de maximizar la respuesta global del tumor (Figura S1B). La respuesta tumoral se evaluó con vasculatura tridimensional de alta frecuencia de ultrasonido Doppler de potencia a las 24 horas y 7 días después del tratamiento, en relación con la línea de base. Figura 1A muestra imágenes representativas de datos tridimensionales Doppler de potencia a las 24 horas después del tratamiento para el control (1), Dll4 mAb (3), USMB + XRT (5) y USMB + XRT + mAb Dll4 (6) condiciones de tratamiento. Una disminución en la señal de flujo fue evidente en los tumores tratados con la combinación triple (6). resultados Doppler de energía cuantificados a las 24 horas y 7 días después del tratamiento se presentan para todas las condiciones de tratamiento de la figura 1B y 1C. Se observaron cambios mínimos en el VI para los animales de control (1) en ambas ocasiones. Se observó un aumento no significativo de la señal Doppler de potencia relacionada con el flujo de sangre a las 24 horas, y 7 días siguientes XRT (2). Los animales que recibieron mAb Dll4 (3) solo se observa que tienen una disminución de la señal de flujo (VI) 24 horas después del tratamiento (p & lt; 0,05). Además, el tratamiento con Dll4 mAb solo (3) causó la VI a gota otros 7 días después de la terapia (p & lt; 0,05). Los tratamientos con USMB + XRT (5) también causaron una rápida (en 24 horas) y significativa (p & lt; 0,05) disminución de la señal Doppler de potencia. Sin embargo, las diferencias de volumen del flujo sanguíneo por Doppler de potencia volvieron a los niveles de referencia de 7 días, lo que indica una interrupción temporal, de corta duración a base de microburbujas vascular. Se observó una disminución rápida VI de casi el 60% para los tratamientos con XRT y Dll4 mAb (4), así como las condiciones de triple combinación (6) (P & lt; 0,05). Sin embargo, la caída VI persistió a 7 días sólo en los animales que recibieron la combinación triple (6) o los que recibieron tratamientos Dll4 solo (3) (p & lt; 0,05). Por el contrario, un aumento de ~ 25% en el VI para XRT + Dll4 mAb (4) los animales tratados indica una reperfusión potencial del tumor.

A) Imágenes representativas de proyección de intensidad máxima tridimensional de potencia Doppler señal en las 24 horas posteriores al tratamiento, y Doppler de energía cuantificada en B) 24 horas y 7 días C), se muestran. Los animales que recibieron mAb Dll4 solo tuvieron una disminución de la señal de flujo (VI) 24 horas después de la administración del tratamiento; el VI se redujo aún más de 7 días después de la terapia. USMB + XRT causó una disminución rápida de la señal Doppler de potencia. Sin embargo, el volumen de sangre activa volvió a los niveles basales a los 7 días. Se observó una disminución rápida VI de casi el 60% de XRT y Dll4 mAb así como las condiciones de triple combinación. Sin embargo, la caída VI persistió a 7 días sólo en los animales que recibieron el tratamiento de triple estado. Cada condición experimental se representa un promedio de 5 animales. Las barras de error representan un error estándar de la media. Cambios estadísticamente significativos están marcados con * (p = 0.05). La barra de escala representa 2 mm

Figuras 2A, S2A y S2B representante pantalla H & amp;. E y ISEL tumorales manchado secciones transversales para cada uno de los tratamientos. Los datos demuestran la muerte celular a las 24 horas en la XRT combinado y Dll4 mAb (4) de tratamiento, así como la combinación triple (6) la condición de tratamiento. regiones de muerte celular en los tumores persistieron a los 7 días después del tratamiento en ambas condiciones. zonas de muerte celular cuantificados de ISEL tumorales manchado secciones transversales se presentan en las Figuras 2A y 2B. se observó muerte celular en los tumores tratados con USMB + XRT + Dll4 mAb (6), mientras que se observó un aumento no significativo en la muerte celular para los animales tratados con radiación combinada con Dll4 mAb (3); significativa (0,05 p & lt). A los 7 días después del tratamiento inicial, se observó significativa (p & lt; 0,05) cantidades de la muerte celular tanto en la XRT + Dll4 mAb (4) y el USMB + XRT + Dll4 mAb (6) condiciones de tratamiento. Además, tumor único H & amp; E morfología, que consiste en múltiples regiones necróticas y células rojas de la sangre se filtró, se observó en los tumores que recibieron la combinación triple en el momento de la punto final (10-30 días después de la terapia) sacrificio (Figura S3).

A) Representante 24 horas H & amp; E tumorales manchado secciones transversales de las condiciones de tratamiento especificadas a bajo aumento. La fila inferior es de imágenes de gran aumento del representante de H & amp; E tumorales manchado secciones transversales de los tratamientos especificados. La barra superior escala fila representa 2 mm y la barra inferior escala fila representa 50 micras. Cuantificada ISEL tinción en B) 24 horas y C) de 7 días. Se observó muerte celular significativa (p = 0.05) en los tumores tratados con USMB + XRT + mAb Dll4, mientras que se observa una cantidad no significativa de muerte celular por los animales tratados con XRT y Dll4 mAb. A los 7 días después del tratamiento inicial, señalamos (p≤0.05) una cantidad significativa de muerte celular, tanto en el tratamiento de condiciones Dll4 MAB y USMB + + mAb XRT XRT Dll4 + combinado. La significación estadística se indica con * para p = 0.05.

Doppler de potencia y la muerte celular resultados se complementaron con los resultados de la tinción de CD31. Representante inmunohistoquímica CD31 se muestra en la figura 3A y S2C. A las 24 horas después de la terapia (Figura 3B), se observó una no significativa, pero cerca de la duplicación de la tinción de CD31 en los animales tratados con mAb Dll4 (3) solamente. Mientras tanto, se observó una disminución significativa en la tinción de CD31 en los animales tratados con USMB + XRT (5), así como los tratados con las condiciones de tratamiento triples (p & lt; 0,05). A los 7 días después del tratamiento (Figura 3C), se observó un aumento significativo en la tinción CD31 para todos los animales que reciben tratamiento Dll4 mAb, ya sea solos (3) o en combinación con USMB y /o XRT (4 y 6). También observamos que los animales tratados con XRT solo (2), o en combinación con USMB (5), tenían niveles de tinción CD31 similares a los animales control.

A) Imágenes representativas de CD31 tinción de tumor secciones transversales. Las imágenes son de cuatro de las condiciones de tratamiento obtenidos a las 24 horas y 7 días después de la terapia. La barra de escala representa 100 micras. B) tinción CD31 normalizada por retorno de la inversión a las 24 horas y C) a los 7 días después del inicio del tratamiento. Se observó una duplicación no significativa, pero cerca de la tinción de CD31 en los animales tratados sólo con Dll4 mAb. Hubo una disminución significativa en la tinción de CD31 en los animales tratados con USMB + XRT, así como los tratados con las condiciones de tratamiento triples. A los 7 días después del tratamiento, hubo un aumento significativo en los vasos CD31 teñidas para todos los animales que recibieron tratamiento Dll4 mAb, ya sea solos o en combinación con USMB y /o XRT. Los animales tratados con XRT solo, o en combinación con USMB, habían cuantificado recuentos de CD31 manchadas similares a los animales control. significación estadísticamente se indica con * indica una p = 0.05.

Figura 4A muestra la curva de crecimiento del tumor normalizado para cada uno de las condiciones de tratamiento. Mientras que los animales de control (1) se duplicaron en volumen en menos de 5 días después del inicio del tratamiento, se observó un retraso en el crecimiento tumoral en todas las demás condiciones de tratamiento. Las curvas de crecimiento siguieron tendencias similares para el crecimiento del tumor tratado con XRT solo (2), Dll4 mAb solo (3), y el tratamiento USMB + XRT (5). Los tumores tratados con XRT y continuaron terapia Dll4 mAb (4) demostraron un retraso significativo y sinérgica el crecimiento tumoral (véase la figura 4B) de 14 días (p & lt; 0,05). tratamientos de combinación triple (6) causó el mayor retraso en el crecimiento del tumor, con una ligera disminución en el tamaño del tumor evidente a los 5 días después del inicio del tratamiento, seguido de una interrupción en el crecimiento de una duración de cerca de 15 días. Se observó un retraso medio de crecimiento tumoral de 24 días (p & lt; 0,05). para el tratamiento de combinación triple
) Normalizados curvas de crecimiento tumoral
A. Se observó una crecimiento tumoral retrasado en todas las condiciones de tratamiento. curvas de crecimiento tumoral siguieron tendencias similares para hablar de la XRT, el mAb Dll4 solo, y los tratamientos USMB + XRT. Combinado USMB + XRT + Dll4 mAb se observó para inducir la mayor respuesta, con una disminución en el tamaño del tumor a los 5 días después del tratamiento, seguido de inhibición del crecimiento que dura casi 15 días. B) cuantificado de retraso del crecimiento del tumor para llegar a dos veces el volumen de partida. Los tratamientos con XRT y continuó mAb Dll4 experimentaron un retraso del crecimiento tumoral sinérgica significativa de 14 días. Mientras tanto, el tratamiento de combinación triple (USMB + XRT + Dll4 mAb) provocó un retraso en el crecimiento tumoral de 24 días. diferencias estadísticamente significativas en el retraso del crecimiento tumoral se indican con * para p = 0.05.

Discusión

En este estudio, nos propusimos investigar la eficacia de la combinación estratégica de un biofísico, la radiación tratamiento con base, vascular interrumpir seguido de un agente farmacológico angiogénesis desregulación. Se postuló que esto sería optimizar la respuesta al tratamiento. Con el fin de maximizar la destrucción vascular, la terapia de microburbujas de ultrasonidos estimulada se utilizó para las células endoteliales del tumor primera radiosensibilizar, seguido de una dosis única de radiación ionizante (XRT) para inducir efectos vasculares rápidos. Dll4 mAb Posteriormente se administró como terapia de "mantenimiento". Un ejemplo de postulada USMB, XRT combinada y los efectos Dll4 mAb en las células endoteliales de tumores se presentan en la figura 5. También se investigaron diferentes permutaciones de las tres modalidades de tratamiento combinado. Los resultados sugieren una respuesta de crecimiento del tumor sinérgico 1.4X en animales tratados con una sesión de terapia de combinación triple (6), en donde se logró un retraso del crecimiento tumoral ~ 24 días (Figura 4). Esto está probablemente vinculado a un cierre vascular tumor sostenida inducir la muerte celular en el tumor. Anti-Dll4 tratamiento con mAb entonces actúa para mantener el cierre vascular. En comparación, la radiación y la combinación de Dll4 mAb (4) causada un retraso en el crecimiento significativo de ~ 14 días. Ningún otro significado se observó en ensayos de retraso en el crecimiento. Los tumores que recibieron radiación sola experimentaron el menor retraso del crecimiento tumoral (~ 3 días), probablemente relacionado con el daño del ADN radiobiológica no vascular convencional.

Postulamos que el pre-tratamiento de tumores con microburbujas de ultrasonido activado por primera vez pueden radiosensibilizar las células a través de un proceso biofísico. Tras la administración de la radiación, las células endoteliales se primera sufrir apoptosis, lo que lleva a la muerte de las células tumorales. la entrega continua de un desregulador angiogénesis podría prevenir la reperfusión tumor, que actúa como una terapia de mantenimiento.

Se observó una disminución en el tamaño del tumor dentro de los 5 días siguientes del tratamiento de combinación triple (6), lo que demuestra una respuesta aguda y lo que sugiere un tumor vascular rápido a base de "colapso". Hemos observado una disminución VI Doppler de potencia de más de 50% a las 24 horas en ambos XRT + Dll4 mAb (4) y (6), (2), donde no se observó disminución de la VI tratamientos triples de combinación en comparación con la radiación sola ( Figura 1). La disminución VI solamente se mantuvo a 7 días en los tratamientos de combinación triples. recesión El volumen del tumor se asocia probablemente con amplia apagado vascular, que conduce a la rápida formación de regiones necróticas en el núcleo del tumor. Postulamos que las células muertas se desintegran y borran en los tumores tratados con la terapia de combinación triple, lo que explicaría la menos extensa tinción ISEL cuantificado para los tratamientos de combinación triples (Figura 2), y la reducción del tamaño del tumor rápidamente. También hemos observado una cantidad significativa de la muerte celular 24 horas después de esta terapia de combinación triple (6), mientras que ninguna otra significación se encuentra en otras condiciones de tratamiento (Figura 2). Aquí áreas de muerte celular, cuantificado por ISEL sección transversal del tumor persistieron en el largo plazo (más de 24 horas) y alcanzaron cerca de una media de 30% de la sección transversal del tumor a los 7 días después de la terapia. La radiación combinada con Dll4 mAb (4) también causó una muerte celular significativa 7 días después de la terapia, sin embargo volúmenes de los tumores en esta condición se observaron a ser más grande que el tumor tratado con la terapia de combinación triple. H & amp; E imágenes teñidas indicaron un microambiente tumoral necrótico heterogéneo y persistente de los 30 días después del tratamiento (Figura S3). Estos resultados demuestran claramente la potencia de la combinación de USMB, radiación y Dll4 mAb anteriormente (6) y más allá de cualquier terapia sola.

Para los animales tratados con XRT + Dll4 mAb (4) o USMB + XRT + Dll4 mAb (6 ), una disminución significativa y rápida en el índice vascular se observó a las 24 horas después de la terapia (Figura 1). Sin embargo, postulamos que el cierre vascular que resulta en algunos de estos tratamientos es de diferente naturaleza. En USMB + XRT + mAb Dll4 (6) animales tratados, las células endoteliales probablemente sufren apoptosis rápida asociada a una perturbación de la membrana debido a los efectos mecánicos de microburbujas, y que resulta en la producción de ceramida [29], [30]. Retorno de los vasos funcionales en los tumores tratados es entonces suprimida por los tratamientos Dll4 MAB. En contraste, los tratamientos con XRT + Dll4 mAb (4) son probablemente causando algunos la muerte de células endoteliales (como se sugiere en la tinción de CD31), lo que lleva a un cierre vascular temporal [15]. A los 7 días siguientes XRT + Dll4 MAB (4) tratamientos, el índice vascular parece estar volviendo al nivel basal, mientras que el índice de depresión vascular persiste en la combinación triple-animales tratados.

El tratamiento con mAb solos Dll4 (3) indujo una respuesta similar a los descritos anteriormente [9] - [12]. Como se preveía, la tinción CD31 cuantificado aumentó después del inicio del tratamiento, mientras que el flujo de sangre activa, como se evaluó mediante ecografía Doppler de potencia, disminuyó (Figura 3). Esto es característico de Dll4 bloqueo, donde se produce una angiogénesis excesiva, pero disminuye de perfusión paradójicamente vasculares. En este estudio, el apagado de la función vascular se mantuvo durante hasta 7 días después del inicio del tratamiento con mAb Dll4 (3) (Figura 1). Sin embargo, un retraso del crecimiento tumoral similar a la radiación sola (2) se observó, lo que indica que el cierre vascular basado Dll4 mAb no es suficiente para inducir daño sustancial del tumor (Figura 4).

investigaciones recientes han demostrado que el pretratamiento de tumores con USMB pueden radiosensibilizar células endoteliales a la radiación, aumentando posteriormente la respuesta general de los tumores [19]. Hemos encontrado que el tratamiento USMB seguido de XRT (5) provoca una disminución aguda y significativo en la VI, medido con ultrasonido Doppler de potencia (Figura 1).

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