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PLOS ONE: Docetaxel-Resistencia en el cáncer de próstata: La evaluación de Associated fenotípicas cambios y potencial de transferencia de resistencia a través de exosomas

2014/11/1


Extracto

Antecedentes

hormonorresistente cáncer de próstata sigue siendo obstaculizada por inevitable progresión de la resistencia al tratamiento de primera línea con docetaxel. Estudios recientes sugieren que los cambios fenotípicos asociados con el cáncer pueden ser transferidos de la célula a célula
a través de
microvesículas /exosomas. Aquí el objetivo fue investigar los cambios fenotípicos asociados con docetaxel-resistencia con el fin de ayudar a determinar la complejidad de este problema y para evaluar la pertinencia de los exosomas secretadas en el cáncer de próstata.

Metodología /Principales conclusiones

docetaxel variantes resistentes de DU145 y 22Rv1 se establecieron y se caracterizaron en términos de resistencia cruzada, morfología, proliferación, motilidad, invasión,
anoikis
, la formación de colonias, la secreción de exosomas y su relevancia funcional. También se realizó un análisis preliminar de los exosomas de las muestras de suero pertinentes. Adquirido docetaxel-resistencia conferida resistencia cruzada a la doxorrubicina e indujo alteraciones en la motilidad, invasión, la proliferación y el crecimiento independiente de anclaje. Los exosomas expulsados ​​de DU145 y 22Rv1 variantes docetaxel resistente (DU145RD y 22Rv1RD) confieren resistencia a docetaxel-células DU145, 22Rv1 y LNCaP, que puede ser debido en parte a la transferencia exosomal /P-gp-1 MDR. Los exosomas de sueros de cáncer de próstata pacientes inducen aumento de la proliferación celular y la invasión, en comparación con los exosomas de los controles de la misma edad. Por otra parte, los exosomas a partir de sueros de pacientes sometidos a un curso del tratamiento con docetaxel en comparación con exosomas coincidentes de los mismos pacientes antes de iniciar el tratamiento con docetaxel, cuando se aplica a ambas células DU145 y 22Rv1, mostró una correlación entre la respuesta celular a docetaxel y la respuesta del paciente al tratamiento con docetaxel.

Conclusiones /Importancia

Nuestros estudios indican la naturaleza compleja y multifacética de docetaxel-resistencia en el cáncer de próstata. Además, nuestro
in vitro
observaciones y estudios clínicos preliminares indican que los exosomas pueden desempeñar un papel importante en el cáncer de próstata, en la comunicación célula-célula, y por tanto, puede ofrecer potencial como vehículos que contienen biomarcadores predictivos y nuevas dianas terapéuticas.

Visto: Corcoran C, Rani S, K O'Brien, O'Neill A, Prencipe M, Sheikh R, et al. (2012) Docetaxel-Resistencia en el cáncer de próstata: La evaluación de Associated fenotípicas cambios y potencial de transferencia de resistencia a través de exosomas. PLoS ONE 7 (12): e50999. doi: 10.1371 /journal.pone.0050999

Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América

Recibido: 28 Marzo, 2012; Aceptado: 30 Octubre 2012; Publicado: December 10, 2012

Derechos de Autor © 2012 Corcoran et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado por fondos de Investigación estratégica Cluster, Terapéutica molecular para el cáncer de la Fundación Científica de Irlanda Irlanda (08 /SRC /B1410) con JC, WW, límite de detección; financiación, a nivel de detalle, para apoyar KOB como una beca de la Fundación Marie Keating en el Trinity College de Dublín; y la infraestructura y el soporte del núcleo instalación a través del Programa de HEA de Irlanda para la Investigación de Tercer Nivel Institutos (PRTLI) Ciclo de 5 a LOD entre otros inhibidores de la proteasa del TCD. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Mientras que el docetaxel ofrece una mejora en la supervivencia global de los pacientes con cáncer de próstata refractario a las hormonas (CPRH), como es evidente a partir de dos ensayos de fase III (TAX 327 y SWOG 9916) y la gestión clínica posterior, por desgracia, la recaída es casi inevitable. Las razones del fracaso de docetaxel para aumentar la supervivencia más allá de $ $ 2,5 meses aún no se han aclarado por completo. La resistencia a fármacos se atribuye con frecuencia con la sobreexpresión de las proteínas de transporte, incluyendo P-glicoproteína (MDR-1 /P-gp), asociada con el flujo de salida de muchos agentes contra el cáncer (y otros) [1] - [3]. Además, la quimio-resistencia también ha sido demostrado que contribuyen a las alteraciones en el fenotipo invasivo y movilidad de las células [4] - [7]. Otras características fenotípicas que pueden estar asociados con este problema en el cáncer de próstata aún no se han definido.

Además de esto, estudios recientes sugieren que los cambios fenotípicos asociados con el cáncer pueden ser transferidos de la célula a célula

a través de microvesículas /exosomas. Los exosomas han sido descritos como vesículas unidas a la membrana de tamaño nanométrico de origen endocítica [8]. Dependiendo de su célula de origen, estas pequeñas vesículas se han implicado con varios papeles diferentes algunos de los cuales incluyen su asociación con estados de enfermedad tales como cáncer. La comunicación intercelular es un tal papel, a través de su capacidad para promover la transducción de señales [9] y la transferencia de los receptores de membrana, proteínas, mRNA, y miRNAs [10], [11] a partir de una célula a otra. La relevancia de los exosomas en términos de su potencial para contribuir a la progresión del cáncer de próstata y el desarrollo de la quimio-resistencia aún no se ha determinado.

Debido a la compleja naturaleza de la progresión del cáncer de próstata, líneas celulares de próstata resistente al docetaxel se han desarrollado y caracterizado para representar tanto tumores primarios y metastásicos, así como los andrógenos sensibilidad y andrógenos resistencia en cáncer de próstata. En breve, adquirida en la resistencia a docetaxel, en dos líneas celulares de cáncer de próstata, que confiere resistencia cruzada a la antraciclina, doxorrubicina y alteraciones inducidas en la motilidad, migración, invasión, la proliferación y el crecimiento independiente de anclaje. Aplicación de los exosomas, aisladas de DU145RD docetaxel resistente y células de cáncer de 22Rv1RD, a DU145 docetaxel sensible, las células y de los padres 22Rv1 LNCap confirió un aumento significativo en la resistencia a docetaxel a cada una de estas células receptoras. Esto puede, al menos en parte, debido a la transferencia de la MDR-1 /P-gp por exosomas. Los exosomas de muestras de suero de cáncer de próstata inducidos un aumento significativo en la proliferación celular y la invasión en comparación con exosomas de controles sanos emparejados por edad. Por otra parte, los exosomas a partir de sueros de pacientes sometidos a un curso del tratamiento con docetaxel en comparación con exosomas coincidentes de los mismos pacientes antes de iniciar el tratamiento con docetaxel, cuando se aplica a ambas células DU145 y 22Rv1, mostró una correlación entre la respuesta celular a docetaxel y respuesta al tratamiento con docetaxel tratamiento. Estos estudios traslacionales preliminares apoyan aún más la relevancia clínica de los exosomas en el cáncer de próstata.

Resultados

determinar el grado de resistencia a Docetaxel

Tal como se detalla en la Tabla 1, y DU145RD 22Rv1RD se encontró que las células sean de aproximadamente 108-, y 71 veces resistente al docetaxel en comparación con sus respectivas líneas celulares de edad y los padres.

las células docetaxel resistente Demostrar cierta resistencia cruzada a otros agentes contra el cáncer

Tanto la línea celular resistente variantes exhibido resistencia cruzada (4-8 veces) a doxorrubicina (Tabla 1), mientras que no se observaron diferencias significativas en la sensibilidad a 5-fluorouracilo o carboplatino para DU145RD o 22Rv1RD en comparación con su respectivo células progenitoras.

las variantes resistentes docetaxel no presenten diferencias en morfología, pero tienen diferentes proliferación, motilidad y la invasión de los fenotipos Versus Líneas celulares para padres

Observación de la morfología celular no reveló diferencias sustanciales en la morfología de las células después de adquirido docetaxel-resistencia (Figura 1), aunque las células resistentes proliferan más lentamente que sus poblaciones padres docetaxel sensible (Tabla 2). Los ensayos de curación de heridas se utilizaron para evaluar los efectos de docetaxel-resistencia en la motilidad celular (Figura 2). Después de 24 horas, las células DU145RD demostraron significativamente (p & lt; 0,05) aumentó cierre de la herida en comparación con DU145. Docetaxel resistente 22Rv1RD mostró marginal, pero significativo (p & lt; 0,05), disminución de cierre de la herida en comparación con 22Rv1. Teniendo en cuenta la migración celular (Figura 3A) y la invasión (Figura 3B), DU145RD se encontró que tienen aumento de la motilidad (p & lt; 0,01) y las capacidades invasivas (P & lt; 0,05) en comparación con DU145. 22Rv1RD comparación con las células 22Rv1, sin embargo, muestra una tendencia disminuida de la migración (p & lt; 0,01) y la invasión (p & lt; 0,05).

Imágenes de padre sensible y variantes docetaxel resistente de las líneas celulares DU145 y 22Rv1. (Olympus CKX4, 20 aumentos).

Se llevaron a cabo ensayos de cicatrización de heridas para evaluar la motilidad celular. Las monocapas se rascaron con una punta de pipeta y las áreas heridas resultantes se controlaron mediante microscopía de contraste de fases durante 24 horas (DU145) y 48 horas (22Rv1). Los resultados se muestran como n = 3 ± SEM, donde * = p & lt;. 0.05 (prueba t de Student)

Migración ensayos se realizaron con 8 micras de tamaño de poro de 24 pocillos Transwell cámaras; B: Para la invasión Ensayos de los insertos se pre-recubiertas con ECM. Las células se dejaron migrar /invadir durante 48 horas (DU145) y 72 horas (22Rv1). Los resultados se muestran como n = 3 ± SEM, donde * = p & lt; 0,05, ** = p. & Lt; 0,01 (prueba t de Student)

Adquirida Docetaxel resistencia Influencias independiente de anclaje la supervivencia y el crecimiento

Investigar si la resistencia a los medicamentos adquiridos también puede conferir
anoikis
resistencia, se observó resistencia a los medicamentos que se asociaron significativamente con una disminución de la muerte celular en
anoikis
condiciones para ambos fármacos variantes resistentes a
es decir
DU145RD (p & lt; 0,05) y 22Rv1RD (p & lt; 0,05); en comparación con sus respectivas células de control (Figura 4A). Posteriormente evaluar si estas células viables también son capaces de proliferar en suspensión, se encontró que la formación de colonias en agar blando para ser aumentado significativamente en DU145RD (
P
& lt; 0,05) y 22Rv1RD (
P & lt
;. 0,05) en comparación con sus respectivas células progenitoras (Figura 4B)

en
anoikis
ensayos, las variantes de la línea de células se sembraron en poli (hidroxietil methactylic) placas de 24 pocillos recubiertos con ácido - o 95% de etanol placas con recubrimiento, como los controles - y se cultivaron durante 24 horas. 100 l de colorante azul de Alamar a continuación, se añadió a cada pocillo, se incubaron durante 4 horas y se midió la absorbancia a 570 nm; B: ensayos de formación de colonias se realizaron utilizando Cytoselect ™ 96-Bueno kit de transformación celular. Las células se incubaron durante 8 días en medio de agar semisólido antes de ser lisadas y se detectó con CyQuant GR tinte en un lector de placas de fluorescencia. Los resultados se muestran como n = 3 ± SEM, donde * = p & lt;. 0.05 (prueba t de Student)

Los exosomas son secretadas por las células del cáncer de próstata y pueden influir en la respuesta a docetaxel, pero no lo hacen alterar significativamente proliferación, motilidad y la invasión

microscopía electrónica de transmisión identificó la presencia de exosomas aislados del medio de toda la línea celular variantes (Figura 5A) acondicionado. Por otra parte el Western Blot para ambos TSG101 y PDC6I /Alix (Figura 5B), proteínas comúnmente asociado con la formación de los exosomas y por lo tanto considera que es un marcador importante de éxito en el aislamiento de exosomas [12], [13], se detectaron en los aislados del medio de acondicionado toda la línea celular variantes. Las cantidades de exosomas expulsados ​​de las variantes emparejados en edad docetaxel resistente y no difirieron significativamente (Figura S1 A). Como adquirida docetaxel-resistencia en las células DU145RD se asoció con un aumento de la migración y la invasión, el próximo investigó si autólogo (DU145) o exosomas resistentes (DU145RD) podría alterar la motilidad evaluado por la capacidad de curación de heridas (Figura 5C) y la invasión (Figura 5D ( i)) de DU145. No se encontró diferencia significativa entre el cierre de la herida de las células en presencia de DU145 o DU145RD exosomas. Del mismo modo, cuando se aplica a 22Rv1 células, ni exosomas DU145- ni derivados de DU145RD confieren un efecto sustancial en la invasión (Figura 5D (ii))

A:. Microscopía Electrónica de Transmisión se realizó para investigar el tamaño y la estructura de exosomas ; B: Western Blot se realizó para evaluar la expresión de marcadores comunes en exosomas 30 mg (Tsg101) y 8 mg (PDC6I /Alix) exosomas aislados de DU145 y la línea celular 22Rv1 variantes; C: DU145 de cicatrización de heridas ensayos en presencia de exosomas (5 g) de las variantes de la línea celular DU145; D (i): ensayos de invasión DU145 en la presencia de exosomas (15 mg) a partir de la línea celular DU145 variantes; D (II): 22Rv1 ensayos de invasión en presencia de exosomas (15 g) de la línea celular DU145 variantes

Un ligero aumento en la proliferación de las células DU145 en presencia de exosomas derivados-DU145 se observó. . Este acercó a la significación (p = 0,053); sin embargo, los exosomas DU145RD no alteraron significativamente la proliferación de células DU145 (Figura 6A (i)); posiblemente como consecuencia de la tasa de crecimiento más lento de las células de las que se obtuvieron estos últimos exosomas. Tras el tratamiento con el IC
50 concentración de docetaxel, la presencia de exosomas DU145 (p & lt; 0,05) y en mayor medida exosomas DU145RD (p & lt; 0,01) (Figura 6A (ii)) se encontraron para inducir un nivel significativo de insensibilidad docetaxel (resistencia) a las células. Para investigar más ampliamente si exosomas DU145RD pueden inducir similares afecta cuando se aplica a otras líneas celulares, el próximo investigó estos exosomas en tanto 22Rv1 y células LNCaP (Figura 6B y 6C). Ni DU145- ni exosomas derivados de DU145RD afectados significativamente la proliferación de células 22Rv1 o LNCap (Figura 6B (i) y 6C (i)). Después del tratamiento con docetaxel, se observó ningún cambio sustancial en la respuesta de las células 22Rv1 o LNCap para docetaxel en presencia de exosomas DU145 en comparación con el efecto del fármaco en la presencia de PBS en lugar de exosomas (Figura 6B (ii) y 6C ( ii)). Sin embargo, en la presencia de exosomas DU145RD, la capacidad de las células 22Rv1 y LNCaP para sobrevivir en esta concentración de docetaxel fue significativamente mayor (p & lt; 0,001) (Figura 6B (ii) y 6C (ii)). Para determinar si esto es probable que sea específico para los exosomas de una variante de línea celular (DU145RD) o más en general a exosomas de células docetaxel de resistencia, se evaluaron posteriormente exosomas de variantes 22Rv1 y 22Rv1RD. Aquí encontramos la misma tendencia que se produzca
es decir.
No hubo un aumento significativo en la proliferación de células LNCaP DU145 o en presencia de cualquiera de los exosomas 22Rv1RD (Figura 6D (i) y la Figura 6E (i)) o 22Rv1. No hubo ningún cambio significativo en la respuesta a docetaxel, por cualquiera de las células DU145 o LNCap, en presencia de edad y los padres exosomas derivados de 22Rv1. Sin embargo, en la presencia de exosomas de la variante resistente 22Rv1RD, tanto en células DU145 (p & lt; 0,01) (Figura 6D (ii)) y las células LNCaP (p & lt; 0,01) (Figura 6E (ii)) mostraron un aumento significativo en la resistencia a docetaxel

AC (i):. DU145, 22Rv1 y LNCaP proliferación en presencia de exosomas (20 mg) a partir de la línea celular DU145 variantes; A-C de respuesta (ii) de las células DU145, 22Rv1 y LNCaP a docetaxel en presencia de exosomas (20 g) de la línea celular DU145 variantes; D-E (i): DU145 y la proliferación LNCap en presencia de exosomas (20 g) de la línea celular 22Rv1 variantes; D-E (II): La respuesta de las células DU145 y LNCaP al docetaxel en presencia de exosomas (20 mg) a partir de variantes de línea celular 22Rv1; F: Western Blot se realizó para evaluar la expresión de MDR-1 /P-gp en la proteína celular total (50 g) y exosomas correspondientes (30 g) de DU145 y 22Rv1 variantes de líneas celulares. Los resultados se muestran como n = 3 ± SEM, donde * = p & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p. & Lt; 0,001 (prueba t de Student)

Tenemos previamente informaron que tanto DU145RD -y 22Rv1RD en mayor medida- expresan MDR-1 /P-gp, mientras que la MDR-1 /P-gp no fue detectado en las células control emparejados por edad, DU145 y 22Rv1 [14] (Figura 6F). Para investigar si la MDR-1 /P-gp es posiblemente llevada a
a través de
exosomas de células DU145RD o 22Rv1RD, se determinó la presencia de esta bomba de salida en exosomas aisladas de estas variantes resistentes. Aquí mostramos que la MDR-1 /P-gp es, de hecho, presentes en las extracciones exosomal correspondientes (Figura 6F).

Los exosomas son detectados en el suero de pacientes con cáncer de próstata y pueden influir en la proliferación celular, invasión y Respuesta a Docetaxel

Western blot para ambos TSG101 y PDC6I /Alix (Figura 7A) demostró el aislamiento exitoso de exosomas de sueros de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos. Las cantidades de exosomas detectados en el suero de pacientes con cáncer de próstata y controles emparejados por edad no difirieron significativamente (Figura S1B). Cuando se añade a las células DU145, exosomas de pacientes con cáncer de próstata docetaxel-naïve (n = 6) demostraron una disminución significativa (
P
& lt; 0,001) aumento en la invasión en comparación con exosomas de controles sanos emparejados por edad (Figura 7B ). Además, cuando se aplica a 22Rv1 células, hubo un aumento significativo en la proliferación en presencia de exosomas de cáncer de próstata en comparación con los de los controles sanos (
P
& lt; 0,01) (Figura 7C). Con el propósito de evaluar el potencial relevancia de hacer circular los exosomas con respecto a la forma en que pueden ayudar a predecir o, de hecho, afectar la respuesta de los pacientes al tratamiento con docetaxel, las influencias de los exosomas aisladas de tratamiento de los pacientes pre-docetaxel (n = 8) en comparación con los exosomas emparejados se evaluaron aislado de los mismos pacientes durante el curso de sus 10 ciclos de tratamiento con docetaxel. Para el propósito de este estudio piloto, los pacientes (n = 6) que alcanzó la disminución de los niveles de PSA con el tratamiento en comparación con sus niveles de PSA pre-tratamiento se consideraron como "respondedores", mientras que los (n = 2), cuyos niveles de PSA aumentaron durante el curso del tratamiento fueron considerados como "no respondedores". Como se indica en la Figura 7D, las células DU145 22Rv1 y se expusieron a sus aproximados de IC
50 concentraciones de docetaxel y la viabilidad de células resultante se le asignó posteriormente un valor arbitrario de 1. Los exosomas aisladas durante el curso del tratamiento de pacientes con el aumento de PSA no se han encontrado para proteger tanto a las células DU145 22Rv1 y de los efectos de docetaxel niveles ( "no respondedores" los pacientes a & amp; b). Por el contrario, para los "respondedores" 6 docetaxel, los exosomas aisladas durante el ciclo de tratamiento parecían aumentar los efectos inhibitorios de docetaxel en tanto las células DU145 y 22Rv1.

Western Blot se realizó para evaluar la expresión de exosomas comunes marcadores en 30 g exosomas aislados de sueros de pacientes no tratados previamente con docetaxel (paciente#1-6) y controles sanos emparejados por edad de control (# 1-6). B: DU145 invasión en presencia de exosomas de pacientes no tratados previamente con docetaxel y controles sanos emparejados por edad (25 mg), la imagen aparece con la invasión representante. C: la proliferación 22Rv1 en presencia de exosomas de pacientes no tratados previamente y controles sanos emparejados por edad (25 mg). Los resultados se muestran como n = 6 ± SEM, donde ** = p & lt; 0,01, *** = p & lt; 0,001 (prueba t de Student). D: La respuesta, a docetaxel, de las células 22Rv1 y DU145 en presencia de exosomas derivados del suero de pacientes con niveles elevados de PSA (n = 2; Los pacientes de A & amp; B) y en presencia de exosomas de pacientes con disminución de los niveles de PSA ( n = 6; pacientes C-H) guía empresas
Discusión

Mientras que el docetaxel se mantiene como el estándar de oro actual para el tratamiento CaPHR, que sólo aumenta la supervivencia global en un promedio de 2,5 meses y aquellos. los pacientes que inicialmente responden finalmente desarrollan resistencia a este fármaco. En este estudio, se demuestra la naturaleza compleja de docetaxel-resistencia a través del uso de
y modelos de línea celular de cáncer de próstata humano in vitro. Tanto la línea celular resistente a docetaxel variantes en este estudio demostró una resistencia cruzada a la doxorrubicina, que es consistente con estudios previos de células resistentes a docetaxel cáncer de páncreas [15] y las células de cáncer de mama [16]. Además, paclitaxel, del que se deriva sintéticamente-docetaxel, se ha asociado con la resistencia cruzada a la doxorrubicina en líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a paclitaxel [2]. Curiosamente, las células DU145RD y 22Rv1RD, en comparación con su población de edad y los padres, también compartieron una serie de otros cambios fenotípicos característicos, además de la resistencia y resistencia cruzada. Entre ellos disminuyeron la tasa de proliferación, el aumento de
anoikis
la resistencia y el aumento de la formación de colonias; pero DU145RD y 22RV1RD diferían con respecto a los cambios en su motilidad y la invasión

El aumento de la migración y la invasión previamente se han relacionado con la quimio-resistencia [4] -. [6], que se refleja en los resultados de nuestro modelo DU145. Mientras que las variantes de células 22Rv1 muestran los efectos opuestos con respecto a la migración y la invasión, es de destacar que para los ensayos de la motilidad del nivel de cierre de la herida fue mínima siguiente 48 horas y ensayos de invasión /migración se sembraron a una densidad sustancialmente mayor que la requerida para DU145 las células para alcanzar los resultados observados. Es posible que estas diferencias identificadas podría estar asociado con diferencias ya conocidas entre las líneas de células (como las células detallados, 22Rv1 son de un tumor primario y se sensibles a los andrógenos, mientras que DU145 son de una metástasis cerebral y se andrógeno-insensible). Esto enfatiza aún más la necesidad de este tipo de estudios y la inclusión de paneles grandes de modelos de línea celular, cuando sea posible, a la forma más óptima posible reflejar otras diversidades de paciente a paciente y así aumentar nuestra comprensión de la complejidad de docetaxel-resistencia en Cancer de prostata. La caída de beta catenina en las células osetocarcinoma aumentando la resistencia a la doxorrubicina ha sido previamente asociado con la invasión suprimido [7]. Además, las líneas celulares resistentes a múltiples fármacos derivadas del modelo Dunning R3327 de carcinoma prostático de rata se ha demostrado que perder el potencial metastásico en animales huésped en comparación con sus células parentales [17].

Estudios anteriores utilizando cáncer colorrectal ( HT29), cáncer de mama (T47D) y cáncer de colon (H630) de las células, de acuerdo con nuestra propia, han encontrado que adquirió quimio-resistencia puede reducir la tasa de crecimiento [18], [19]. la proliferación celular reducida debido a la presencia de inestabilidad cromosómica, que se asocia con la resistencia a múltiples fármacos, recientemente se ha demostrado en células de cáncer de colon [20]. Así, el aumento de la capacidad de las variantes de docetaxel resistente para resistir la muerte celular en
anoikis
condiciones de nuestro estudio no se puede atribuir a un simple aumento de la tasa de proliferación. La asociación entre el aumento de la supervivencia clonogénico y quimio-resistencia, observada tanto en nuestra DU145RD y células 22Rv1RD, es consistente con otros estudios [18], [21], [22].

La evidencia reciente de que las células pueden comunicarse con los vecinos "o células secundarias" a través de la secreción de vesículas micro o nanométricas (conocido como exosomas) que llevan información celular ha destacado recientemente la importancia de estas entidades [23]. Nosotros, por lo tanto, investigamos el potencial de estas vesículas a ser expulsado y transferir los cambios fenotípicos, asociados con docetaxel-resistencia, a las células secundarias. No se observaron diferencias sustanciales en la motilidad, invasión o la proliferación de las células DU145 y 22Rv1 en presencia de DU145- o exosomas derivados de DU145RD. Estudios limitados, hasta la fecha, han demostrado que los exosomas que expresan anfirregulina [24] y HSP90α [25] pueden aumentar la motilidad de células de cáncer y la migración. Sin embargo, este no parece ser el caso de los exosomas derivados de células de cáncer de próstata evaluados aquí.

Es interesante que encontramos inducidos docetaxel-resistencia con células DU145 en presencia de exosomas DU145RD (aprox. 22%), en comparación a cuando estas células se expusieron a sus propios exosomas. Esto sugiere que los exosomas DU145RD son, de hecho, la transferencia de la resistencia a docetaxel. Además, se encontró un patrón similar cuando DU145- y exosomas derivados de DU145RD se añadieron a las células 22Rv1 y LNCaP. En concreto, un aumento significativo de docetaxel-resistencia (aprox 15% para 22Rv1;. 16% para LNCap), independiente de las influencias de proliferación, dio como resultado. Esto, por primera vez, sugiere que los exosomas pueden ser un medio de comunicación docetaxel-resistencia entre células. Para confirmar que el observado efectos de exosomas derivados de DU145RD no se limita a esta variante línea celular, se realizó una investigación similar con 22Rv1 y 22Rv1RD exosomas. De acuerdo con los resultados de nuestros ensayos exosomas DU145RD iniciales, se observó una tendencia similar de docetaxel-resistencia conferida (
es decir
un aumento de aprox. 11-12%) para ambas células DU145 y LNCaP en presencia de exosomas 22Rv1RD.

MDR-1 /P-gp se expresa por tanto nuestras células DU145RD y 22Rv1RD pero es indetectable en las células madre, lo que implica que como implicados en el docetaxel-resistencia adquirida (esta observación es algo acorde con la situación clínica en la mayoría de los cánceres de próstata son MDR-1 /P-gp-positivas [26]). Es importante destacar que se encontró que el patrón de expresión en los exosomas correspondientes refleja la de las células de las que se derivaron, apoyando aún más el potencial de la transferencia de la resistencia y nuestra sugerencia de que MDR1 /P-gp podría ser potencialmente, al menos partly- involucrado en el resistencia conferida por los exosomas recién adquirido. Sin embargo, la diferencia en los niveles /P-gp-1 resistentes a múltiples fármacos entre los exosomas de variantes resistentes a docetaxel en comparación con sus células parentales no implica necesariamente un papel causal para MDR1- /P-gp en la resistencia a las drogas observado.

Para investigar más a fondo el potencial de los exosomas en un entorno clínico, como un estudio piloto hemos aislado exosomas de pacientes con cáncer de próstata tratados previamente con docetaxel y controles sanos de la misma edad. Investigamos afecta de estos exosomas en la invasión y proliferación de células cancerosas. El aumento de la proliferación e invasión de células en presencia de exosomas de pacientes con cáncer sugiere un papel causal para estos exosomas. Si bien este es un pequeño estudio piloto, en conjunto con nuestros estudios de línea exosomas derivados de células, que apoya la hipótesis de que los exosomas pueden tener un papel en la comunicación de las células del cáncer de próstata.

En el contexto de docetaxel-resistencia, posteriormente, se determinó la pertinencia de los exosomas derivados de pacientes pertinentes. Específicamente este estudio piloto (n = 8 pacientes) incluido corresponde exosomas de suero obtenidas antes y durante el tratamiento curso docetaxel. A continuación se evaluó la respuesta de las células DU145 y 22Rv1 a su IC
50 concentraciones de docetaxel (como se muestra en la Tabla 1
es decir
1,7 nM para células DU145; 4 nM para 22Rv1 células) en presencia de éstos exosomas poblaciones. El docetaxel-resistencia observada conferido a las dos líneas celulares por exosomas aisladas de pre-ciclo de 7 sueros (n = 2 pacientes) se correlacionó con el aumento de los pacientes en los niveles de PSA. Los exosomas de los 6 pacientes restantes parecían conferir una mayor sensibilidad a las dos células DU145 y 22Rv1, en correlación con los pacientes (n = 6) disminución de los niveles de PSA durante el ciclo de tratamiento.

Una posible explicación de la forma por lo que los exosomas están afectando el fenotipo de las células "objetivo" es que ellos están transfiriendo ARNm, los miRNAs y /o proteínas de las células de la resistencia adquiridos que son moléculas causales en cambiar el fenotipo celular de las células receptoras secundarias. Esto está de acuerdo con la acumulación de pruebas de que los exosomas jugar un papel importante en la comunicación de célula a célula. Por ejemplo, en 2007 Valadi et al. demostraron que mRNAs realizadas a través de los exosomas de los mastocitos se traducen en proteínas en su transferencia a las células diana [10]. La absorción exitosa de exosomas de células secundarias también se demostró por Skog et al. [11] cuando exosomas de glioblastoma marcados con fluorescencia se incubaron con células endoteliales. Muchos ejemplos más recientes de estas observaciones han sido reportados y un reciente dictamen por Mittelbrunn y Sánchez-Madrid [27] describe con más detalle cómo se puede producir esta transferencia de información genética, con los efectos de los exosomas de células secundarias que posiblemente contribuyen al crecimiento de la carcinogénesis y el tumor; moldear el microambiente tumoral; promoción de la angiogénesis; y modulación de la respuesta inmune [28], [29]. Específicamente en relación con la modulación de la respuesta a la terapia anti-cáncer, exosomas con sobreexpresión de HER2 a partir de células donantes se han demostrado para disminuir la sensibilidad de las células receptoras para Trastuzumab [30]. Así, mientras que no podemos especular sobre las moléculas particulares que pueden llevarse a
a través de
exosomas de nuestras células resistentes para inducir cambios fenotípicos en las células diana (excepto para sugerir que la transferencia de MDR-1 /proteína P-gp puede, en parte, ser un factor contribuyente), es razonable sugerir que puede ser una sola combinación -o de- mRNAs, miRNAs y /o proteínas que tienen un papel causal en docetaxel-resistencia. Por lo tanto, ahora que relevancia funcional se ha asociado con estos exosomas en que confiere un nivel de docetaxel-resistencia, de perfiles del contenido de estos exosomas se justifica para comprender mejor la molécula precisa (s) y el mecanismo (s) en cuestión.

en conclusión, este estudio corrobora que docetaxel-resistencia en el cáncer de próstata es altamente complejo y puede estar asociada con variada afecta celular en términos de resistencia a otros fármacos quimioterapéuticos, motilidad, invasión y crecimiento independiente de anclaje. Está claro, sin embargo, que dada la naturaleza polifacética de docetaxel-resistencia que no uno, sino varios factores pueden mediar sus efectos en el cáncer de próstata. Aquí nos muestran, por primera vez, que la comunicación celular
a través de
exosomas puede, en parte, como resultado conferido docetaxel-resistencia a las células secundarias. Los futuros estudios sobre cohortes más grandes de muestras de suero, tanto de los pacientes no tratados previamente con docetaxel y también de los pacientes tras el tratamiento con docetaxel, están garantizados -assessing tanto los efectos de y el contenido molecular de la exosomes- para ampliar nuestra comprensión de los exosomas y su relevancia para celular comunicación y docetaxel-resistencia en el cáncer de próstata

Materiales y Métodos

líneas celulares y cultivo celular

líneas celulares de cáncer de próstata, 22Rv1 (ATCC CRL-2505;. andrógeno-sensibles ; a partir de un tumor humano primario), DU145 (ATCC HTB-81; andrógenos insensible; a partir de una metástasis cerebral) y LNCaP (ATCC CRL-1740; andrógeno-sensibles; de los ganglios linfáticos metástasis) se adquirieron de la American Type Culture Collection ( ATCC). células 22Rv1 y DU145 se mantuvieron en medio RPMI (Sigma-Aldrich), complementado con 10% de suero bovino fetal (PAA), 1% de L-glutamina (Sigma-Aldrich) y a 37 ° C /5% de CO
2. células LNCaP se mantuvieron en avanzado RPMI (Biosciences) suplementado con 10% de suero bovino fetal (PAA), 1% de L-glutamina (Sigma-Aldrich) y 1% Hepes (Sigma-Aldrich) y a 37 ° C /5% de CO
2.

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