Extracto
débil adhesión de la superficie celular de líneas celulares a las superficies de cultivo de tejidos es un problema común y presenta limitaciones técnicas en el diseño de experimentos. Para superar este problema, diversos protocolos de recubrimiento de superficies se han desarrollado. Sin embargo, una medición en tiempo real comparativa y precisa de su impacto en el comportamiento de las células no se ha llevado a cabo. La línea celular de cáncer de próstata LNCaP, derivada de un paciente metástasis en los ganglios linfáticos, es un modelo de sistema comúnmente utilizado en la investigación del cáncer de próstata. Sin embargo, característicamente débil unión de las células a la superficie de los vasos de cultivo de tejidos y cubreobjetos ha impedido su manipulación y análisis y el uso de cribado de alto rendimiento. Para mejorar la adherencia de las células LNCaP a la superficie de cultivo, se compararon diferentes reactivos de recubrimiento (poli-l-lisina, poli-L-ornitina, colágeno tipo IV, fibronectina y laminina) y las condiciones de cultivo y se analizaron sus efectos sobre la proliferación celular, la adhesión, la morfología, la movilidad y la expresión génica utilizando tecnologías en tiempo real. Los resultados mostraron que la fibronectina, poli-L-lisina y poli-L-ornitina células LNCaP mejora la adherencia y provocaron alteraciones de la morfología celular, tales como aumento del área nuclear y celular. Estos reactivos de recubrimiento también indujeron una mayor expresión de F-actina y la reducción de la movilidad celular. Por el contrario, la laminina y el colágeno de tipo IV no mejoraron la adhesión pero promueven la agregación celular y la morfología celular afectado. Las células cultivadas en presencia de laminina muestran movilidad mayor que las células de control. Todas las condiciones de recubrimiento afectadas significativamente la viabilidad celular; sin embargo, no afectaron a la expresión de genes regulados por el receptor de andrógenos. Nuestros resultados comparativos proporcionan información importante para la selección de las condiciones de reactivos y de cultivo de recubrimiento ideales para las líneas celulares de cáncer con respecto a su efecto sobre la tasa de proliferación, la unión, la morfología, la migración, la respuesta transcripcional y disposición del citoesqueleto celular.
cita: Liberio MS, MC Sadowski, Soekmadji C, Davis RA, CC Nelson (2014) Efectos diferenciales de cultivo de Tejidos de revestimiento a sustratos sobre el cáncer de próstata La adhesión celular, la morfología y el comportamiento. PLoS ONE 9 (11): e112122. doi: 10.1371 /journal.pone.0112122
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Agosto, 2014; Aceptado: 12 Octubre 2014; Publicado: 6 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Liberio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Los fondos para el estudio fue proporcionado por el Instituto Eskitis Universidad Griffith y el australiano cáncer de próstata Centro de Investigación de Queensland-a través de fondos del Departamento de Salud del Gobierno de Australia . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En organismo multicelular tejidos el espacio extracelular que rodea las células se llena con una mezcla compleja de macromoléculas que se hace referencia como la matriz extracelular (ECM). El ECM se compone de polisacáridos y proteínas, tales como laminina, fibronectina, elastina, colágeno, y su cantidad relativa es específica de tejido. Estas proteínas están incrustadas en un gel de polisacárido. [1] A pesar de las ideas iniciales de servir meramente como un andamio para las células, se sabe ahora que el ECM no es sólo estructural sino instructivo, siendo responsable de la regulación del comportamiento celular y que afecta a su proliferación, forma, función, la migración, la supervivencia y el desarrollo [2] - [5].
Muchas de las proteínas ECM tienen la función importante la adherencia. [1] La mayoría de las células son dependientes de anclaje y la necesidad de adjuntar a la ECM con el fin de sobrevivir y proliferar. [6] Las integrinas son proteínas transmembrana en forma de heterodímeros delta gamma integrales para la fijación ECM de células de proteínas. Esta interacción genera una cascada de señales intracelulares que también pueden controlar la expresión génica diferencial. [7], [8] La respuesta de señalización está relacionada con la composición molecular ECM que cambia de acuerdo con la respuesta de las células a su microambiente. [9], [10] De esta manera, el ECM está en constante cambio para facilitar los requisitos de celulares de la plasticidad del desarrollo. [11] Sin embargo, poco se sabe acerca de los detalles moleculares implicados en la transducción de señales. La respuesta de las células a los componentes de ECM es variable y depende de que las subunidades de integrina se expresan por las células. Muchos grupos de investigación han sido el uso de diferentes proteínas ECM en cultivo de tejidos para modificar el comportamiento celular, principalmente la unión celular. [12] - [15] Sin embargo, además de aumentar la fijación, las proteínas de recubrimiento pueden afectar otros aspectos de la biología celular, influyendo en el resultado final del ensayo [16]
El adenocarcinoma de próstata humano sensible a andrógenos. línea celular, LNCaP, es uno de los sistemas modelo más comúnmente utilizados en la investigación del cáncer de próstata (CaP). Fue derivado de una lesión metastásica en el ganglio linfático de un 50 años de edad, varón caucásico en 1977. [17] débil adhesión de la superficie celular de líneas celulares es un problema común de la investigación de cultivo de tejidos y presenta limitaciones técnicas en el diseño de experimentos . Su característica débil unión a la superficie de recipientes de cultivo de tejido y cubreobjetos han impedido su manipulación, análisis y uso en el cribado de alto rendimiento ya que las células LNCaP pueden ser fácilmente desalojados a través de fuerzas mecánicas modestas como tensión de cizallamiento de fluido. Para mejorar la adherencia de las células LNCaP a la superficie de cultivo, se compararon diferentes reactivos de recubrimiento (poli-L-lisina, poli-L-ornitina, colágeno IV, fibronectina, laminina y) y condiciones de cultivo, por ejemplo, la densidad de células, y se analizó su impacto sobre la proliferación celular, la adhesión, la movilidad y la morfología con un analizador de células en tiempo real (RTCA). Nuestros resultados son una herramienta útil para la selección de los reactivos y condiciones de cultivo de recubrimiento ideales para la línea de células LNCaP con respecto a su efecto sobre la tasa de proliferación, la unión, la morfología y la disposición del citoesqueleto celular.
Materiales y Métodos
cultivo celular
células LNCaP (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) fueron cultivadas de forma rutinaria en medio de crecimiento RPMI sin rojo fenol (Invitrogen) suplementado con 10% (v /v) de FBS (Invitrogen) . células LNCaP fueron propagadas por no más de 40 pasajes.
condiciones de revestimiento
Todos los reactivos de revestimiento se prepararon según lo recomendado por los fabricantes. El volumen y la concentración de las sustancias utilizadas para el recubrimiento de los pocillos eran 1,3 laminina l (LAM, 0,5 mg /ml en H
2O, Invitrogen), colágeno 1 l de tipo placenta IV humana (COL, 1 mg /ml en H
2O, Invitrogen), 0,4 l de fibronectina (FN, 1 mg /ml en H
2O, Invitrogen), y 0,32 l de poli-L-lisina (PLL, 1 mg /ml en H
2O, Invitrogen). Estos reactivos de recubrimiento se mezclaron con H
2O a un volumen total de 50 l por pocillo de una placa de 96 pocillos. 50 l de poli-L-ornitina (OLP, 0,01% en H
2O, Sigma-Aldrich) se añadieron directamente a los pocillos, y las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C en 5% de CO
2. El tiempo de incubación para LAM y FN fue de 4 h usando las mismas condiciones descritas anteriormente. Los pocillos recubiertos se lavaron una vez con DPBS seguida inmediatamente por la siembra de células. El volumen de sustancias de recubrimiento se ajustó de acuerdo con el área de crecimiento cuando se utilizaron diferentes recipientes de cultivo.
analizador de células en tiempo real (Sistema xCELLigence)
El analizador de células en tiempo real del sistema (RTCA) xCELLigence ( Roche Applied Science) se compone de cuatro partes principales: el analizador RTCA, la estación de RTCA SP, que se mantiene dentro de una incubadora de cultivo de tejidos, el equipo RTCA con software integrado, y un 96 pocillos e-placa. La parte inferior de la 96 pocillos E-placa desechable es de aproximadamente 80% cubierto con microelectrodos de oro que monitorean la impedancia electrónica, la detección de cambios fisiológicos de las células. Las células en contacto con el electrodo actuarán como aislantes, lo que lleva a un aumento de la impedancia. Por lo tanto, los cambios de impedancia del electrodo proporcionalmente con alteraciones en el número, el tamaño y la adhesión de las células que crecen en una monocapa [18], [19].
Los cambios en la impedancia se traducen como el término sin unidades
índice de células
(IC). CI = (Zi-Z0) /15, donde Zi es la impedancia en el punto de tiempo individual durante el experimento y Z0 es la impedancia en el inicio del experimento. Por lo tanto, el CI es una medida cuantitativa y compuesta del estado general de las células en un pocillo que contiene electrodo-[18], [19].
En primer lugar, 100 l de medio completo, se añadieron a cada pocillo durante medición de la de fondo. A continuación, las células LNCaP fueron sembradas en un 96 pocillos E-placa no recubiertas o con los reactivos indicados como se ha descrito anteriormente a una densidad entre 9,4 × 10
3 y 6,25 × 10
4 células /cm
2 por triplicado. El E-placa se dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 min y se coloca en el lector en la incubadora para la grabación continua del índice celular. El E-placa se incubó durante 96 horas a 37 ° C en 5% de CO
2, y la fijación de las células se controló a través de la CI para 4 h cada 2 min. Después de este período, el CI se midió cada hora para 92 h.
proliferación celular y la viabilidad
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas o con los reactivos indicados a una densidad de 1,25 × 10
4 células /cm
2. El crecimiento como una función del aumento de confluencia se midió usando el sistema en vivo de imágenes de células contenido IncuCyte HD (Essen BioScience). Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de 10x cada 2 h durante de 3 pozos separados por el estado del revestimiento, y la media ± SD se calcula porcentajes de confluencia. La actividad metabólica de las células cultivadas en los diferentes revestimientos se midió con alamarBlue después de 96 h de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). El análisis cinético se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software). Los valores promedio de los triplicados se calcularon después de la corrección de fondo.
La adhesión y la cuantificación de los parámetros morfológicos
células LNCaP fueron sembradas en una placa de 96 pocillos, recubiertas o con los reactivos indicados a una densidad de 3.12 × 10
4 células /cm
2. Después de 24 h, 48 h, 72 h y 96 h las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 20 min en hielo, se permeabilizaron con 0,2% (v /v) de Triton X-100 /PBS durante 10 min, y se tiñó con CellMask profunda mancha roja de plasma de membrana (2,5 mg /ml, Invitrogen) y 1 mg /ml DAPI (Invitrogen). La evaluación de la adhesión celular se realizó midiendo el número de células que se encuentre en la placa después de las etapas de lavado utilizando el sistema de imágenes de contenido de alta Opereta (PerkinElmer). El área de la celda parámetros morfológicos y la zona de núcleos fueron cuantificados.
Time-lapse de imágenes
Las superficies de un pozo /placa 6 se recubrieron como se ha descrito anteriormente. células LNCaP se sembraron a una densidad de 1,58 × 10
4 células /cm
2 y monitoreados para 96 h. Cada 15 minutos una imagen fue tomada con un microscopio óptico Zeiss Axio Observer (objetivo × 20) para seguir los cambios de forma y la migración durante el tiempo. Los videos se pueden encontrar como vídeo S1-S6.
Distribución de F-actina
células LNCaP fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio con y sin revestimiento con los reactivos indicados para 24 hy 96 h. Las células fueron fijadas y se permeabilizaron como se describe anteriormente, seguido por tinción con rodamina-faloidina (1:40, Invitrogen) y 1 mg /ml DAPI (Invitrogen). Los complejos de inmunofluorescencia se visualizaron con una Olympus (FV1000 espectral) microscopio confocal utilizando una lente de 60 aumentos. seccionamiento óptico se llevó a cabo mediante la adquisición de una pila de imágenes en diferentes posiciones focales a lo largo del eje z.
arañazos herida ensayo
células LNCaP (3.12 × 10
4 células /cm
2) se sembraron en una placa de 96 pocillos ImageLock Essen (Essen BioScience) no recubiertas o recubiertas como se describe anteriormente, y se hicieron crecer hasta la confluencia en un CO
2 incubador humidificado. Después de 24 h, el cero se realizó utilizando el WoundMaker 96 pines (Essen BioScience). imágenes fueron tomadas de la herida cada 1 h durante 36 h, y los datos fueron analizados por la parte herida densidad relativa del métrica integrada del contenido en vivo IncuCyte sistema de imágenes de células de alta definición (Essen BioScience). El experimento se realizó por triplicado.
Sensibilidad a la simvastatina
Se investigó la influencia de la FN, OLP y recubrimiento de PLL sobre la sensibilidad de las células a la simvastatina. células LNCaP se sembraron por triplicado y se cultiva en un 96 pocillos E-placas como se describió anteriormente. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con diferentes concentraciones de simvastatina (Sigma-Aldrich) y monitoreados cada 1 h durante 60 h utilizando el sistema de RTCA. El IC
50 durante 24 h, 48 hy 72 h de tratamiento se calcularon utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).
QRT-PCR
Las superficies de un 6 bienestar placa se revistieron como se describe anteriormente, y las células LNCaP se sembraron a una densidad de 1,05 × 10
4 células /cm
2. Después de 72 h, el medio de crecimiento fue sustituido por los medios RPMI suero (andrógeno-agotado) con carbón vegetal (CSS, Invitrogen, EE.UU.) suplementado con 5% (v /v) CSS y las células se cultivaron durante 48 h. Finalmente, las células LNCaP se trataron con 20% (v /v) de etanol como control o los andrógenos R1881 (1 nM) y DHT (10 nM) durante 30 h.
El ARN total se obtuvo usando el kit RNeasy mini (Qiagen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La cantidad y la calidad del ARN se midieron usando un espectrofotómetro NanoDrop UV (ThermoFisher Scientific, EE.UU.). Las muestras con una relación mayor que 2,0 260/280 se utilizaron para los procedimientos posteriores. Las muestras se trataron con DNasa Amp grado I, y 2 g de ARN total se transcrito de forma inversa usando el método de síntesis de ADNc para el kit de qPCR (Invitrogen). QRT-PCR se realizó con SYBR verde mezcla maestra (Invitrogen) usando el sistema de PCR en tiempo real Fast 7900HT (Applied Biosystems). Los datos se analizaron con el software SDS2.3 (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de ARNm se calcularon por el método ΔΔCt y relativa normalizada para la expresión de la gen de mantenimiento (GAPDH o RPL32) del tratamiento respectivo y se calculan con respecto al control sin recubrimiento etanol. Las secuencias de los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S1.
Resultados
FN, OLP y PLL mejorar la adherencia de las células-sustrato
El analizador de células en tiempo real (RTCA) xCELLigence es una metodología libre de etiquetas que mide la tasa de proliferación, adhesión y morfología basado en cambios de impedancia. Los cambios en la impedancia se traducen como el término sin unidades
Índice celular gratis (CI). Se realizó el análisis de las células LNCaP RTCA sembradas en pocillos tratados previamente con los diferentes recubrimientos a densidades celulares entre 9,4 × 10
3 a 6,25 × 10
4 células /cm
2 en una placa de 96 pocillos, y investigado tanto en la fase de fijación (24 h después de la siembra) (Fig. 1) y la fase de proliferación (24 h a 96 h después de la siembra) del cultivo de células (Fig. 2). Se supuso que la unión de las células de la suspensión sobre el sustrato y los cambios en la morfología celular asociados con este proceso fueron los principales contribuyentes a la CI durante las primeras 24 h del experimento (Fig. 1). Por lo tanto, la contribución de la proliferación a la CI para este período se consideró marginal, que fue apoyada además por el hecho de que las células LNCaP cultivadas bajo condiciones similares muestran un tiempo de duplicación de 36 h. [20] De hecho, la comparación de las diferentes densidades de siembra de la inspección y los reactivos de recubrimiento a 3,12 × 10
4 células /cm
2 en una placa de 96 pocillos después de 24 h reveló que PLL aumentó el CI a un similares medida como la duplicación del número de células sembradas, es decir, de 3.12 × 10
4 a la 6.25 × 10
4 células /cm
2 (Fig. S1). En todas las densidades de células, recubrimiento con fibronectina (FN) dio como resultado el más alto CI después de 24 h, seguido de poli-L-lisina (PLL) y poli-L-ornitina (OLP). PLL y PLO aumentaron el CI a tasas muy similares hasta 3,12 × 10
4 células /cm
2, mientras PLO disminuyó la pendiente en todas las densidades de células (Fig. 2). El recubrimiento (LAM) laminina no afectó a la CI en comparación con el control, mientras que el colágeno de tipo IV (COL) causó la CI aumentando más lento. Curiosamente, esta orden no se vio afectada por el aumento del número de células sembradas. Estos resultados sugirieron que FN, PLL y PLO mejoraron notablemente la unión de las células LNCaP, siendo superior a los ácidos poli-amino de la proteína ECM.
Se monitorizaron las células durante 24 h para analizar la adherencia celular-sustrato a partir de se añadieron las células a los pocillos de tiempo (t = 0) usando un analizador de células en tiempo real (xCELLigence, Roche). Cada punto de datos está representado por sus medios (n = 3) ± SD.
Se monitorizaron las células durante 72 h para analizar los efectos de los revestimientos en las células LNCaP a partir 24-96 h utilizando un verdadero analizador de células -tiempo (xCELLigence, Roche). Los datos se normalizó a las 24 h para la comparación de las pistas. Cada punto de datos está representado por sus medios (n = 3) ± SD.
La fase de proliferación se controló de 24 horas después de la siembra de las células a las 96 horas (Fig. 2). Los principales contribuyentes de esta fase a los cambios de la IC son la proliferación celular, la adhesión y la morfología. En todas las densidades celulares ensayadas, las células LNCaP cultivadas en LAM muestran una tasa de aumento de CI que era indistinguible de la de control. En contraste, las células LNCaP cultivadas en sustrato COL mostraron una fase de retardo en el que el CI no aumentó hasta 48 h después de la siembra, y una tasa global reducido de aumento CI (Figs. 2B-E). Estos efectos fueron independientes del número de células sembradas. En todas las células densidades sustrato PLL provocó una desaceleración en el aumento detectable CI. El mismo efecto fue visible sobre el sustrato OLP al más alto densidad de siembra (6,25 × 10
4 células /cm
2, Fig. 2E), mientras que el CI aumentó más rápidamente en el sustrato recubierto de PLO a densidades de siembra más bajos (Fig . 2A y B). Aparte de la densidad celular más baja (9,4 × 10
3 células /cm
2), el aumento de la tasa de CI de las células cultivadas en sustrato FN fueron consistentemente más altos que el control (figuras 2B-E.); un efecto que parecía no estar afectada por los aumentos en el número de células sembradas. En conjunto, las altas densidades de células (& gt; 4,69 × 10
4 /cm
2) afectado negativamente a la CI cuando se hicieron crecer células LNCaP sobre sustratos revestidos con ácidos poli-amino (PLL y OLP), pero no se vieron afectados con ECM proteínas (COL, LAM y FN). Esta observación es de particular importancia para los experimentos de cultivo de células donde una confluencia celular elevada es deseable. Por otra parte, una densidad de siembra de 9,4 × 10
3 células /cm
2 fue en general perjudicial para el cultivo celular de las células LNCaP, resultando en la falta de proliferación de células, que era probablemente debido a la escasez de los contactos célula-célula.
Todas las condiciones de recubrimiento reduce la proliferación celular pero no afectó fuertemente la viabilidad celular LNCaP
el índice de células es una medida combinada de la tasa de proliferación, la adhesión y la morfología de las células. Por lo tanto, los efectos de los reactivos de recubrimiento en cada uno de estos parámetros se investigaron por separado. La densidad celular de los pocillos revestidos aumentó más lento que los pozos no recubiertos. Las células cultivadas en FN, PLL, OLP y LAM muestran tasas de crecimiento similares (Fig. 3A). El colágeno tipo IV era la sustancia de recubrimiento que impactó negativamente la proliferación celular al máximo. El examen de la viabilidad actividad /metabólica de las células LNCaP cultivadas por 96 h en los diferentes sustratos de recubrimiento por ensayo alamarBlue reveló que todos los reactivos de recubrimiento reducen la viabilidad celular, con COL ligeramente peor que los otros revestimientos (Fig. 3B). Este efecto fue similar a los resultados obtenidos para confluencia bien en diferentes recubrimientos (Fig. 3A). En conjunto, estos resultados mostraron que los reactivos de recubrimiento afectadas la proliferación celular y la actividad de metabolismo de las células LNCaP.
células LNCaP se sembraron a 1,25 × 10
4 células /cm
2 en un poliestireno de 96 pocillos -plate sin revestir o revestidas con poli-L-ornitina, poli-L-lisina, colágeno tipo IV, laminina o fibronectina. (A) Wells confluencia se controló cada 2 h durante 96 h usando el sistema IncuCyte. (B) Metabolic viabilidad actividad /celular se midió mediante el ensayo de alamarBlue después de 96 h. Cada punto de datos está representado por sus medios (n = 3) ± SD. Los resultados significativos (p & lt; 0,05). están marcados con un asterisco
COL y las células LNCaP inducida LAM se agreguen
IncuCyte imágenes revelaron que las células LNCaP fueron unidos a la superficie en todo el recubrimiento condiciones después de 24 h (Fig. 4a). Las células cultivadas en pozos de pre-recubiertas con FN, PLL, PLO, LAM, así como el control muestra una forma similar a fibroblastos típico para las células LNCaP. [21] En contraste, las células LNCaP cultivadas en COL tenían una forma más redonda. Las células cultivadas en COL y LAM también tendían a agregarse. Además, los pocillos recubiertos con LAM y FN contenían más células redondas cuando se compara con los otros sustratos de recubrimiento (Fig. 4A). Lo mismo se observó después de 96 h (Fig. 4B). Después de 96 h, la mayoría de las células adquirieron una forma de huso en todas las condiciones de recubrimiento. Las células en COL crecieron en los agregados a las 96 h (Fig. 4B).
células LNCaP fotografiados después de 24 h (A) y 96 h (B) con sistema IncuCyte, 10 ×. Barra de escala = 300 micras. disparos (C) de la Snap 96 h de lapso de tiempo de vídeo microscopia de células LNCaP. Las flechas indican lamellipodia de las células polarizadas. Barra de escala = 50 micras (20 ×, Zeiss Axio Observador).
Con el fin de investigar el efecto de los reactivos de revestimiento sobre la movilidad y la morfología celular más detallada en tiempo real, las células LNCaP fueron estudiados por gran aumento de microscopía de lapso de tiempo. Al igual que en el experimento IncuCyte, microscopía de lapso de tiempo mostró que COL y LAM (Fig. 4C) hizo que las células LNCaP a formar agregados. Además, las células cultivadas en pozos de LAM-recubiertos muestran la presencia de numerosas células polarizadas, que se caracteriza por la presencia de células asimétricas. Las muestras tratadas con PLO PLL- y muestran una morfología similar cuando se compara con el control. Sin embargo, LNCaP sembró en estos sustratos parecían unir más rápido que las células de control y migrar menos. Videos de la microscopía de lapso de tiempo durante un período de 96 horas, se pueden encontrar en vídeo S1-S6.
células LNCaP agarrar mejor a las superficies recubiertas con FN, OLP y PLL, que también afectan la morfología celular
Adjunto y celular morfología, que componen parte de la CI, fueron investigados por el alto contenido de cribado (HCS). HCS de células LNCaP midió una densidad de células sustancialmente mayor (mejor fijación) después del tratamiento previo de los pocillos con PLO o PLL en comparación con el control, FN, COL o LAM en todos los puntos de tiempo (Fig. 5A). Las células cultivadas en presencia de FN unidos mejor que las células de control a las 72 h y 96 h. En lo que respecta a cambios en la morfología celular, la zona del núcleo y el área total de células se vieron afectadas por todos los revestimientos (Figs. 5B y 5C). Las células cultivadas en PLO, PLL y FN para 96 h mostraron un aumento de las zonas nucleares y celulares de al menos 8% y 18%, respectivamente, en comparación con el control. En relación con el control, COL y LAM disminuyeron las áreas nucleares y celulares por 7% y 10%, y 15% y 14%, respectivamente.
Las células se analizaron para la densidad de células (A), el área nuclear (B ) y el área celular (C) en cuatro momentos diferentes usando un instrumento de cribado de alto contenido (Opereta).
los diferentes reactivos de recubrimiento afectados organización de la actina F
Para investigar los cambios en la morfología celular y la movilidad de las células LNCaP con más detalle, se realizó la microscopía de fluorescencia confocal y se investigó la organización F-actina de células LNCaP, tales como la presencia de lamellipodia a las 24 h (Fig. 6A) y 96 h (Fig. 6B) después de la siembra. Estas estructuras consisten en filamentos de actina en paralelo incluido que indagan sobre el sustrato para decidir dónde y cómo deben establecerse las adhesiones focales para la unión. Además, estos filamentos contribuyen a la formación de fibras de estrés de actina. [22], [23] La adhesión y la propagación de las células implica la remodelación del citoesqueleto. estructuras dinámicas llamados contactos focales se forman alrededor de las integrinas en los sitios de adhesión. Las integrinas se unen a componentes de ECM en un lado, y para los filamentos de actina llamadas fibras de estrés en el otro lado. La aplicación de la fuerza en una reacción causa lado por el otro, y esto, junto con las vías de señalización de integrina, determina la forma de la célula. [3] De acuerdo con los resultados observados en el experimento de la microscopía de lapso de tiempo, se observó muchas células polarizadas después de 24 h en FN y cubreobjetos de vidrio tratados con LAM (Fig. 6A). Además, después de 96 h se observó que las fibras se hicieron más desorganizado con alguna acumulación de actina cortical alrededor del cuerpo de la célula y un número reducido de fibras de estrés en presencia de FN (Fig. 6B). Además, FN causó un aumento sustancial en la tinción de actina, y las células perdieron su polaridad (Fig. 6B).
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio sin revestimiento (control), o recubiertos de fibronectina (FN), laminina (LAM), poli-L-lisina (PLL), poli-L-ornitina (OLP), o colágeno de tipo IV (COL IV). Después de 24 h (A) o 96 horas (B), las células se tiñeron para F-actina con rodamina-faloidina, contratinción con DAPI, y se analizaron por microscopía de fluorescencia confocal (60 ×, Olympus). Las flechas indican lamelipodia de las células polarizadas y puntas de flechas marcan filopodios. Barra de escala = 50 m.
Las células cultivadas en la presencia de PLL y PLO (Fig. 6) muestran un patrón más difuso de actina con alguna tinción de actina concentrada en la periferia celular en 24 h y 96 h . se observó la presencia de muchos haces de actina y los filamentos de actina extendidas radialmente alrededor de las células, que se llaman filopodios,. Los núcleos de las células cultivadas en PLL muestran una intensidad DAPI fuerte a las 24 h (Fig. 6A), que se redujo a las 96 h (Fig. 6B). Por otra parte, los núcleos incrementaron en tamaño después de 96 h.
A las 24 h, las células en los pocillos recubiertos con COL (Fig. 6A) mostraron un patrón similar a la actina de control. Sin embargo, después de 96 h de crecimiento, los filamentos de actina se volvieron más organizados que en el control (Fig. 6B).
PLL, OLP, o FN-revestido pozos aumentan la unión de las células LNCaP y ligeramente disminución de la movilidad celular , mientras que aumenta la migración LAM
Los cambios morfológicos se asocian generalmente con alteraciones de otras características de las células, incluyendo la motilidad, la diferenciación y la actividad metabólica. [24] Para hacer frente a esta posibilidad, la motilidad de las células LNCaP cultivadas en poliestireno tratado con los diferentes reactivos de recubrimiento se evaluó en un ensayo de cicatrización de la herida (Fig. 7). células LNCaP fueron sembradas durante 24 h en pocillos recubiertos con FN, LAM, PLL, PLO o COL, y la monocapa de células se raspó usando una WoundMaker 96 pines. La calidad de las heridas generados en PLL, PLO, o pocillos recubiertos con FN fueron superiores a la de control (sin recubrimiento) y LAM, como se juzga por la suavidad relativa de los bordes de la cero, así como un área de la herida muy similar (Fig . S2). Otra observación fue que las células LNCaP cultivadas en PLO o pozos tratados con PLL colonizaron el bien en un patrón semi-organizado, en donde los cuerpos celulares alargados fueron alineadas en paralelo (Fig. S2). Pre-tratamiento con LAM no mejoró la adherencia de las células LNCaP en comparación con el control, y la WoundMaker generado heridas con bordes irregulares y de área diferente. células LNCaP desalojados como hojas grandes de las células de los pocillos tratados con COL cuando se procesa con el WoundMaker (datos no presentados), lo que indica que COL era inferior a los pozos no recubiertos y no es adecuado para esta aplicación. Análisis de la densidad relativa de la herida mostró que las células cultivadas en presencia de LAM migraron 62% más rápido en el área de la herida de las células de control después de 36 h (Fig. 7). En comparación, PLL, PLO y FN causados células LNCaP a migrar más lento que el control, mostrando una reducción de la densidad de las heridas en un 15%, 33% y 20% crecido en estas condiciones, respectivamente. En particular, las células LNCaP muestran un tiempo de duplicación de alrededor de 36 h, como se observa en los experimentos RTCA, [20] lo que sugiere que los efectos observados en la densidad de heridas fueron causadas predominantemente por la migración celular y no proliferación.
densidad relativa herida en diferentes puntos temporales de células LNCaP en un período de 36 h. Las mediciones son realizadas por las heridas en una monocapa de células LNCaP cultivadas en presencia de diferentes tratamientos y el control de revestimiento.
PLL sensibiliza a las células LNCaP para el inhibidor HMGCR simvastatina
Los estudios anteriores han muestra que el pre-revestimiento con componentes de ECM puede afectar a la sensibilidad de las células a diversos fármacos. Por ejemplo, LAM y FN se han reportado para aumentar la resistencia a la radiación ionizante y para el fármaco citotóxico Ucrania en tumores humanos y células normales
en
in vitro
. [25] Además, se informó de que la adhesión a una síntesis de colesterol sustrato FN inducida por la activación de HMGCR y síntesis de ácidos grasos también aumentó en los fibroblastos humanos y células de hepatoma de rata, mientras que un sustrato de PLL o FN en solución no tuvieron efecto sobre estas vías [ ,,,0],26].
por lo tanto, el efecto de los reactivos de recubrimiento de PLL, PLO y FN en la sensibilidad de las células LNCaP a la simvastatina inhibidor HMGCR fue investigado por RTCA, y la IC
50 se calculó para los períodos de tratamiento de 24 h, 48 h, y 72 h (Fig. S3). Lam y COL efectos no fueron analizados debido a que estos agentes bloqueadores tuvieron efectos adversos sobre la superficie celular LNCaP adherencia y causaron la agregación celular. Mientras que el IC
50 para simvastatina fue relativamente similar entre las cuatro condiciones de revestimiento en 24 h, PLL aumentó la sensibilidad de las células LNCaP al inhibidor HMGCR por de dos veces después de 48 h de tratamiento en comparación con el control (Fig. S3) . A las 72 h, las células LNCaP cultivadas en un sustrato PLL muestran un máximo de tres veces menor IC
50. Del mismo modo, la OLP y FN aumentaron la sensibilidad de las células LNCaP a simvastatina por la relación de dos veces al control a las 72 h. Sin embargo, se ha observado que OLP, PLL y FN redujeron la viabilidad celular en un tercio a las 96 h (Fig. 3B). Por lo tanto, la sensibilización de las células LNCaP por OLP y FN a la simvastatina podría ser en realidad el efecto de estos revestimientos sobre la viabilidad celular. En este caso, sólo el PLL puede sensibilizar las células LNCaP significativamente para la simvastatina inhibidor HMGCR de una manera dependiente del tiempo.
andrógenos capacidad de respuesta y la señalización AR fueron, en general, no se ven afectados por las condiciones de recubrimiento
el epitelio de próstata humano adulto sano, la expresión de AR y la adhesión celular al sustrato se produce en capas de células separadas, a saber, en luminal y células basales. Por lo tanto, las vías de señalización de AR y la adhesión celular es poco probable que interactuar directamente. [29] Durante el desarrollo de cáncer de próstata, células epiteliales luminales malignas cambiar de adhesión célula-célula de la adhesión celular-sustrato, y las señales de la adhesión celular y AR son co-expresada. [27] La línea celular LNCaP es un importante sistema modelo para estudiar los receptores de andrógenos (AR) mediada por la señalización en el cáncer de próstata. Se demostró recientemente que los cambios en los contactos célula-célula y la matriz extracelular alterada la respuesta de las células LNCaP a los andrógenos.