Extracto
Antecedentes
Otto Warburg observó que las células cancerosas a menudo se caracterizan por una intensa glucólisis en presencia de oxígeno y una disminución concomitante en la respiración mitocondrial. La investigación se ha centrado principalmente en una posible conexión entre el aumento de la glucólisis y el desarrollo del tumor, mientras que disminuyó en gran medida la respiración ha sido dejado sin atención. Por lo tanto, una relación causal entre la disminución de la respiración y la tumorigénesis no se ha demostrado.
Metodología /Principales conclusiones
Para este propósito, las colonias de
Saccharomyces cerevisiae
, que es adecuado para la manipulación de la respiración mitocondrial y muestra la muerte celular mediada por mitocondrias, se utilizó como modelo. La represión de la respiración, así como ROS-barrido a través de glutatión inhibe la apoptosis y confiere una ventaja de supervivencia durante la siembra y el desarrollo temprano de esta población de células en proliferación rápida sólida. Por el contrario, la mejora de la respiración desencadena la muerte celular
Conclusión /Importancia
Por lo tanto, el efecto Warburg podría contribuir directamente a la iniciación de la formación de cáncer -. No sólo por la glucólisis mejorada - sino también a través de la disminución la respiración en presencia de oxígeno, lo que suprime la apoptosis
Visto:. Ruckenstuhl C, S Büttner, Carmona Gutiérrez-D, T Eisenberg, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. (2009) El efecto Warburg Suprime el estrés oxidativo inducido por apoptosis en un modelo de levadura para el cáncer. PLoS ONE 4 (2): e4592. doi: 10.1371 /journal.pone.0004592
Editor: Julian Rutherford, Universidad de Newcastle, Reino Unido
Recibido: 26 Agosto, 2008; Aceptado: 9 Enero 2009; Publicado: 25 Febrero 2009
Derechos de Autor © 2009 Ruckenstuhl et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por conceder FMF FSP-S93 de FM y subvención de la UE STREP 511983 (TransDeath) en KU. F .. Los donantes no participó en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en la década de 1920 Otto Warburg describió el fenotipo bioquímico más común de células tumorales: incluso en la presencia de un nivel normal de oxígeno, la glucólisis es muy elevado y acompañada por la producción de lactato alta, así como reducir drásticamente mitocondrial la respiración [1] - [3]. Aunque este fenotipo es la base para el consumo diagnóstico de tumores de monitorización de glucosa [4], preguntas desafiantes siendo difícil de alcanzar: Por ejemplo cómo las células tumorales adoptan este fenotipo por diferentes mecanismos [5], [6], si los dos fenómenos (alta glicolisis y la disminución de la respiración) tienen una relación causal [7], [8], y, finalmente, su contribución específica a la tumorigénesis [7], [9] - [11].
la rápida proliferación de las levaduras de fermentación muestran valores similares a los de las células tumorales [12], lo que permite el estudio de la relación entre el metabolismo energético y la proliferación máxima. En particular, la muerte celular programada, que protege contra la tumorigénesis, está íntimamente ligada a los procesos mitocondriales en células de mamíferos. Las células de levadura también pueden someterse a la muerte celular programada [13], [14] de una manera mitocondrias dependiente de [15], [16], incluyendo citocromo c y la liberación de AIF, la apertura del canal después de la expresión de Bax humano [17] - [19], despolarización del potencial de membrana mitocondrial [20], y la fragmentación mitocondrial [21].
La habilidad especial de las levaduras Crabtree positivas como
Saccharomyces cerevisiae
de arranque y paro de la respiración en respuesta a los cambios en la fuente de carbono y la posibilidad de producir cepas viables que carecen de DNA mitocondrial (rho
0), permiten la evaluación genética rigurosa del papel de las mitocondrias durante la muerte celular [15], [22]. A continuación, se evalúa la posible relación entre la muerte celular y la fosforilación oxidativa suprimido inhibido, en colonias cultivadas a partir de una sola célula, que se asemeja el crecimiento del tumor.
Resultados y Discusión
en una población de células en proliferación máxima sólida , la respiración aumenta la producción de ROS y apoptosis
S. cervevisiae
células heredan un sistema de represión de la glucosa única que sobre el crecimiento en glucosa suprime drásticamente la respiración independientemente de la disponibilidad de oxígeno [23]. Modelización de crecimiento del tumor, hemos probado si influencias de respiración reprimido por células de supervivencia durante el crecimiento de las poblaciones de células a partir de una sola célula en un medio de glucosa. Tres cepas diferentes, incapaces de respiración junto con isogénicas de tipo salvaje
S. cerevisiae
se utilizaron en un ensayo de colonias, donde las colonias aisladas se cultivaron a partir de células individuales. Células retiradas de colonias durante el desarrollo temprano de un rho
0 cepa colonia exposición aumentado significativamente la supervivencia en comparación con la cepa de tipo salvaje (Fig. 1A). Consistentemente, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), un proceso estrechamente conectada con y, a menudo causante de la muerte celular programada, se disminuyó (Fig. 1B).
(A) Las colonias aisladas se cultivan a partir de células individuales, manipulado en placas de agar. ensayo clonogénico de células extraídas de las colonias de la cepa de tipo salvaje, rho
0 (sin ADN mitocondrial) y dos cepas individuales de genes de supresión (
mgm1
y
oxa1
), que se cultiva en SCGlu. Después de 3 días 500 células de colonias enteras, al cabo de 5 días se analizaron 500 células de la colonia-región central (media ± SEM,
n
= 2). La significación estadística de p & lt; 0,006 compara unidades formadoras de colonias (ufc) de cepas mutantes de la cepa de tipo salvaje en respectivos puntos de tiempo. (B) Las células de toda la colonia (3 días), así como de la región central (5 días) se tiñeron para las especies de oxígeno reactivas (ROS) con dihydroethidium y se analizaron por FACSAria citometría de flujo (media ± SEM,
n
= 2; ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 en comparación con las cepas de deleción en los respectivos puntos de tiempo). (C) Aproximadamente 50 (2 días) y 10 (3 días) colonias cultivadas en placas SCGlu se eliminan mediante lavado y ensayos por clonación se realizaron con las células recogidas (media ± SEM,
n
= 5; ** p & lt ; 0,01, *** p & lt; 0,001). (D) Aproximadamente 50 colonias cultivadas en placas SCGlu durante 2 días se tiñeron para la exposición de fosfatidilserina (AnnV) y la rotura del ADN (TUNEL) y se analizaron mediante citometría de flujo FACSAria (media ± SEM,
n
= 3; ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). (E) La microscopia de fluorescencia de la región central y exterior de los 5 días de colonias de células de tipo salvaje de edad, que alberga el plásmido DsRed-MLS.
Para excluir rho
0 deformación efectos específicos no tomar en cuenta las deficiencias de respiración , se investigaron otras dos cepas de respiración deteriorada. cepas supresión de genes individuales de ambos,
MGM1 gratis (homólogo humano de
OPA1
) - una GTPasa situado en el espacio intermembrana mitocondrial [24] - y
OXA1 gratis (un insertase de la membrana interna de la mitocondria - altamente conservada de procariotas a los mamíferos [25], [26]) se comportaron como el (de tipo salvaje) rho
0 cepa. Después de 3 y 5 días,
mgm1
, así como
oxa1
suprimido las células recuperadas de toda la colonia (3 días) o la región central (5 días), y por lo tanto las células, principalmente mayores, mostraron aumentó significativamente la supervivencia (Fig. 1A), así como la inhibición de la generación de ROS en comparación con muestras de la cepa de tipo salvaje (Fig. 1B). Es de destacar que, a diferencia de otros respiración deficiente cepas mutantes (incluyendo rho
0 y Δ
mgm1
) del Δ
oxa1
cepa mostró mismas tasas de crecimiento como la cepa de tipo salvaje en cultivos líquidos y durante el crecimiento de las colonias, respectivamente (Fig. 2A y B). las curvas de crecimiento
(A) de un
oxa1
eliminación cepa y la correspondiente cepa de tipo salvaje. El experimento se realizó por triplicado. El eje se escala logarítmica. (B) Tamaño de las colonias aisladas de las cepas indicadas cultivadas durante 3 y 5 días en placas SCGlu, respectivamente. Diámetros fueron evaluados mediante el procesamiento de las fotos con Metamorph Imaging (media ± SEM,
n
= 2).
En un enfoque complementario, colonias sembradas (10 y 50 por placa) de de tipo salvaje y Δ
oxa1
cepas, respectivamente, se lavó de placas SCGlu después de 2 y 3 días y se evaluó la supervivencia clonogénico. Una vez más, la cepa incapaz de respiración mostró una mejor supervivencia que la cepa de tipo salvaje que respiran (Fig. 1C). Además, la ventaja de supervivencia de la Δ
oxa1
cepa se produjo ya después de 2 días, que es de buena acuerdo con los datos anteriores que las colonias de tipo salvaje cultivan en los medios habituales de glucosa en donde se muestra a abandonar la fase de crecimiento logarítmico después alrededor de 36 horas [27].
para evaluar el tipo de muerte celular inducida hacen pruebas de marcadores de apoptosis utilizando ensayos AnnexinV y TUNEL. La apoptosis se redujo significativamente en una respiración deficiente
oxa1
supresión mutante en comparación con el control de tipo salvaje (Fig. 1D). Cabe señalar que la digestión de la pared celular de las células de tipo salvaje fue menos eficiente. Por lo tanto cantidades más bajas de células teñidas positivamente se obtuvieron en comparación con la supervivencia celular observado en ensayos clonogénicos después de 2 días. Esto significa que la supresión observada de marcadores de apoptosis en el
oxa1
cepa eliminada es probablemente incluso más alto que se muestra en 1D. En esta línea cuando se trata con 30% más de mezcla de enzimas para mejorar la digestión de la pared celular, aproximadamente el 37% de las células de tipo salvaje mostró una tinción positiva TUNEL (datos no mostrados). la fragmentación mitocondrial es un requisito previo para la apoptosis en la levadura. Por lo tanto, la morfología mitocondrial de las células de las colonias de tipo salvaje (y no para rho
0 células, ya que carecen de la respiración) se controló usando DsRed que lleva una secuencia de localización mitocondrial. Después de 5 días, las células de la región central (por lo tanto, las células más viejas) mostraron un aumento drástico fragmentación de las estructuras de las mitocondrias y más pinchados mientras que recién alimentado células más jóvenes desde el borde exterior muestra una estructura tubular normal de las mitocondrias (Fig 1E).
concluimos que la abrogación de la respiración suprime la apoptosis y la producción de ROS en una población de células fuertemente la proliferación en medios sólidos.
mejora forzada de respiración activa la muerte celular durante la siembra de una población celular
cáncer Novel terapias se basan en la suposición de que la reconstitución o la mejora de la respiración forzada dentro de los tumores sólidos puede conducir a la inhibición del crecimiento y la muerte celular [10], [28], [29]. Para probar si la aplicación de genética de las influencias de respiración la muerte celular durante la siembra de una población de células (que es el paso cronológico antes de una colonia establece), los experimentos de los medios de desplazamiento de utilizando glucosa (SCGlu), galactosa (SCGal), y glicerol (SCGly) medios de comunicación como se llevaron a cabo alternando únicas fuentes de carbono. De este modo, la respiración o bien se suprime (SCGlu), en cooperación activa con fermentación (SCGal), o que representa la fuente de energía exclusiva (SCGly). Cuando (no proliferantes) poblaciones líquidos estacionarios de células de tipo salvaje de levadura cultivadas en SCGlu se cambiaron a SCGal sólido o SCGly, sólo el 65% o 44%, respectivamente, de las células sembradas fueron capaces de formar una colonia (Fig. 3A). Utilizando cultivos altamente proliferativos de tipo salvaje cepa BY4741 (desde la fase de crecimiento exponencial), este efecto fue aún más pronunciado con casi ninguna de supervivencia tanto en los medios de comunicación respiratoria (Fig. 3A). Se obtuvieron resultados comparables con cultivos altamente proliferativos de otras cepas de tipo salvaje como AH22, TB50, y DBY746 (datos no mostrados) en nuestras condiciones. Incluso una transferencia de la misma alta medios respiratoria (de líquido a SCGly SCGly sólido) dieron lugar a una disminución de la formación de colonias de ~ 70% (en comparación con un cambio del estado líquido al SCGly SCGlu sólido), subrayando que específicamente la iniciación del crecimiento de la colonia es negativa afectada por un aumento de la respiración (Fig. 3B)
.
(a) ensayo clonogénico de las culturas pre-cultiva en SCGlu líquido. 500 células se sembraron en SCGlu, SCGal, y SCGly placas de agar, respectivamente (media ± SEM,
n
= 3; *** p & lt; 0,001). (B) ensayo clonogénico de las culturas pre-cultiva en líquido SCGly. Se sembraron 500 células en placas de medio SCGly y SCGlu, respectivamente (media ± SEM,
n
= 2; ** p & lt; 0,01). (C) Las células de toda la colonia (3 días), así como de la región central (5 días) se tiñeron para las especies de oxígeno reactivas (ROS) con dihydroethidium (DHE). Los valores de las unidades fluorescentes relativas (RFU) se normalizaron a valores de deformación de tipo salvaje (media ± SEM,
n
= 2; ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). (D) Tamaño de colonias aisladas de tipo salvaje cultivadas en placas de medio SCGlu y SCGal se controló tomando fotos a la hora indicada puntos. Diámetros fueron evaluados mediante el procesamiento de las fotos con Metamorph Imaging (barra blanca representa 1 cm) (media ± SEM,
n
= 3; * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01).
mejora la respiración forzada de suprime el crecimiento y aumenta la producción de ROS de colonias
los efectos observados de siembra colonia suprimida cuando la respiración es alta también se reflejaron en un mayor crecimiento de la población celular: Después de dos días de crecimiento en sólido SCGal, las colonias muestran sólo la mitad del tamaño de las cultivadas en SCGlu sólido, aunque un mayor aumento de tamaño (después del retardo inicial) es comparable (Fig. 3D). El retraso inicial podría estar asociado con un ROS inmediata de ráfaga, como se subraya adicionalmente por elevado drásticamente los niveles de ROS en las colonias cultivadas en SCGal o SCGly (Fig. 3C, también véase más adelante y la Fig. 4C).
(A) Aproximadamente 100 colonias se hicieron crecer durante 36 horas en placas de SCGlu con o sin GSH 5 mM, se lavaron apagado y ensayos clonogénicos se realizaron con las células recogidas (media ± SEM,
n
= 3; ** p & lt; 0,01) . Además cantidades iguales de células se tiñeron para las especies de oxígeno reactivas (ROS) con dihydroethidium (DHE) y se cuantificaron usando un lector de microplacas de fluorescencia (Genios-Pro). se muestran los valores de las unidades fluorescentes relativas (RFU) (media ± SEM,
n
= 3; ** p & lt; 0,01) (B). (C) de ensayo clonogénico de las culturas pre-cultiva en SCGlu líquido. 500 células se sembraron en SCGlu, SCGal, o SCGly placas de agar, respectivamente, con o sin GSH 1 mM (media ± SEM,
n
= 2; *** p & lt; 0,001).
por lo tanto, el establecimiento de una población de células en proliferación sólida fuertemente requiere la respiración a ser reprimida.
la respiración mediada por la muerte celular en las células y colonias recién sembrados se suprime eficiente a través de ROS barrido
a fin de probar que la respiración y acompañando la producción de ROS es una de las principales causas de la apoptosis durante el desarrollo de la colonia que usa el glutatión reducido (GSH) como reactivo de eliminación: Las colonias de tipo salvaje y
oxa1
supresión cepas fueron cultivadas en placas de agar SCGlu con o sin GSH y la supervivencia celular se determinó después de 36 horas en un ensayo clonogénico. Mientras que el
oxa1
supresión cepa no mostraron alteración de supervivencia tras la adición de GSH, la supervivencia de las células de tipo salvaje se ha mejorado drásticamente (Figura 4A). Esto fue acompañado por los niveles de ROS disminuyó significativamente (Figura 4B). Curiosamente, la ampliación de la fase de crecimiento fermentativo con la duplicación de la concentración de glucosa en las placas de medio condujo a una mayor ligeramente la supervivencia celular (datos no presentados).
Además, el efecto del glutatión como ROS scavenger se probó en un ensayo de desplazamiento, donde de tipo salvaje células altamente proliferativas crecidas con anterioridad en medios líquidos SCGlu se sembraron en placas SCGal y SCGly con o sin GSH. Sorprendentemente, la supervivencia se ha mejorado para 50% y 55%, respectivamente, en comparación con & lt; 1% de supervivencia en placas sin GSH (Fig 4C.). Un cambio similar de células estacionarias produjo un aumento de la supervivencia de 50% y 60% a 75% y 77%, respectivamente, en GSH que contiene placas (datos no mostrados). Se concluye que la basura ROS a través de glutatión aumenta la supervivencia celular durante el desarrollo de la colonia, así como durante la siembra en medios altamente respiratorias. Curiosamente, se ha informado recientemente de que en las células cancerosas y en las neuronas (que también muestran el efecto Warburg), el citocromo
c
se reduce y se mantiene inactivo por GSH [30].
Hasta ahora , la investigación sobre el efecto Warburg ha centrado principalmente en el alto flujo glucolítico, mientras que la represión de acompañamiento de la respiración mitocondrial a menudo se deja desatendido [8], [9]. Nuestros datos demuestran que la respiración desencadena la apoptosis durante la siembra y el desarrollo de una población de células, proporcionando evidencia experimental directa en apoyo de la hipótesis de Warburg durante la iniciación de la tumorigénesis. La disminución de la fuerza de la capacidad respiratoria puede ser crucial para la malignidad del tumor [12] y para la resistencia contra la oxigenación fluctuante inevitable en tumores [31], [32]. Curiosamente, se ha demostrado que la levadura rho
0 cepas presentan una mayor resistencia frente a ciertos estímulos apoptóticos externos, tales como ácido acético, lo que desencadena la muerte a través de la vía mitocondrial [15], [17]. Una resistencia similar contra la muerte celular también puede desempeñar un papel para las células tumorales en un alrededores ácido. Los autores especulan que la reprogramación de las células cancerosas sigue un antiguo mecanismo presente en
S. cerevisiae
colonias de tipo salvaje: alta glucólisis en presencia de oxígeno
Materiales y Métodos
Cepas y medios
Los experimentos se llevaron a cabo en BY4741 (Mata
his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
) y los respectivos mutantes nulos de
mgm1
y
oxa1
, respectivamente, obtenidos a partir de Euroscarf. Strain BY4741 rho
0 fue construido por varias rondas de tratamiento con bromuro de etidio como se describe anteriormente [33]. Para llevar a cabo la microscopía de fluorescencia de las estructuras mitocondriales el plásmido DsRed-MLS (DsRed que lleva una secuencia de localización mitocondrial) [34] se transformó en la cepa BY4741. Para los recubrimientos de supervivencia YEPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona y glucosa 2%) medios de comunicación fue suplementado con 2% de agar. Para todos los ensayos, las cepas se cultivaron en medio SC que contiene base 0,17% de nitrógeno de levadura (Difco), 0,5% (NH
4)
2SO
4, y 30 mg /l de todos los aminoácidos (excepto 80 mg /l de histidina, 200 mg /l de leucina (sin leucina cuando se trabaja con el plásmido DsRed-MLS)), 30 mg /l de adenina, y 320 mg /l de uracilo con 2% de glucosa (SCGlu), 2% de galactosa (SCGal), y 3% de glicerol (SCGly), respectivamente, suplementado con agar al 2%, cuando sea necesario. Se añadió; (Sigma-Aldrich GSH) a concentraciones de 1 o 5 mM, cuando sea necesario
monocolony aislado ensayo
Seis petridishes centímetro, suministrados con 13 ml de medio SC sólido (glutatión reducido. se han usado con o sin leucina). Se colocaron las células individuales de 16 a 20 horas cultivos de una noche en placas de medio SC sólidos usando un micromanipulador (Serie 200, Singer Instruments). Para reducir al mínimo la deshidratación de las placas sólidas, la incubación se realizó a 28 ° C en una cámara de cría cerrada, humidificado (KBF115, Carpeta). Para la determinación de diámetro, fotos fueron tomadas en los puntos de tiempo indicados (Microbiología de colonias de venta libre, Lemnatec) y se procesan utilizando imágenes Metamorph.
Curvas
chapado de supervivencia, los experimentos medios de turno y para el crecimiento
Para determinar la supervivencia de las células dentro de la colonia, ya sea colonias enteras aisladas (en el caso de 3 días) y las muestras de las regiones centrales de las colonias aisladas (en el caso de los 5 días) se retiraron a indicados los puntos de tiempo, o SCGlu placas con aproximadamente 100 colonias (después de 36 horas), 50 colonias (después de 2 días) o 10 colonias (después de 3 días) se lavaron fuera. Los recuentos de células se determinaron por un dispositivo de recuento de células CASY (scharfe Systems) y 500 células se sembraron en placas de agar YEPD. unidades formadoras de colonias (ufc) se determinaron después de 2 o 3 días (en el caso de cepas deficientes en respiración rho
0 y Δ
mgm1
) con una Microbiología-Colonia-Contador (Lemnatec) y procesadas mediante SAWmicrobio versión 3.1.
para los experimentos de medios improvisados, los cultivos se cultivan en SCGlu y SCGly medios líquidos a logarítmica (6 h) y estacionaria (24 h) fase, respectivamente, y 500 células se sembraron en placas de medio sólido respectivos así como en las placas SCGlu en cualquier caso.
Para la evaluación de las tasas de crecimiento en medios líquidos, cultivos de una noche se hicieron crecer en SCGlu. Los cultivos se inocularon con 5 × 10
5 células en SCGlu y el crecimiento celular se monitorizó durante 12 horas utilizando un dispositivo contador de células CASY.
La tinción para marcadores de apoptosis y microscopía de fluorescencia
La tinción de se realizaron las especies de oxígeno reactivas (ROS) con dihydroethidium (DHE), anexina V-tinción, y TUNEL-tinción como se describe anteriormente [34]. En cada muestra se evaluaron 30.000 células por medio de citometría de flujo (FACS-Aria, BD) y se procesaron utilizando el software FACSDiva. Alternativamente cantidades iguales de células teñidas DHE se midieron en un lector de fluorescencia de microplacas (Genios-Pro, Tecan).
morfología mitocondrial fue inspeccionado por microscopía de fluorescencia utilizando un filtro de DsRed en un microscopio Zeiss Axioskop. Las células del centro, así como la región externa de monocolonies aisladas de células de tipo salvaje que alberga el plásmido DsRed-MLS fueron controlados después de 5 días.
El análisis estadístico
Se realizaron todos los análisis estadísticos utilizando Estudiantes T-test (una cola, sin pareja), con * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001, respectivamente
Reconocimientos
gracias Ulrike Potocnik para asistencia técnica.