Extracto
En los últimos años se ha prestado considerable atención a la utilización de sustancias naturales como medicamentos contra el cáncer. El dipéptido antioxidante L-carnosina naturales pertenece a esta clase de moléculas, ya que se ha demostrado tener una actividad anticancerígena significativa tanto in vitro como in vivo. Estudios anteriores han demostrado que la L-carnosina inhibe la proliferación de células de carcinoma colorrectal humano que afectan a la producción de ATP y especies reactivas de oxígeno (ROS). En el presente estudio hemos identificado el factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) como un posible objetivo de la L-carnosina en la línea celular HCT-116. proteína HIF-1α es sobre-expresa en múltiples tipos de cáncer humano y es la principal causa de la resistencia a los fármacos y la radiación en tumores sólidos. De particular interés son los datos experimentales que apoyan el concepto de que la generación de ROS proporciona una señal redox para la inducción de HIF-1α, y se sabe que algunos antioxidantes son capaces de suprimir la tumorigénesis mediante la inhibición de HIF-1α. En el estudio actual, se encontró que la L-carnosina reduce el nivel de proteína HIF-1α afectar a su estabilidad y disminuye la HIF-1 la actividad transcripcional. Además, hemos demostrado que la L-carnosina está implicado en el sistema de la ubiquitina-proteasoma promoción de la degradación de HIF-1α. Finalmente, se comparó la actividad antioxidante de L-carnosina con la de dos antioxidantes bis-diaminotriazoles sintéticos (es decir, 1 y 2, respectivamente). A pesar de estos tres compuestos tienen la misma capacidad en la reducción intracelular de ROS, 1 y 2 son más potentes carroñeros y no tienen efecto sobre la expresión de HIF-1α y proliferación de células cancerosas. Estos hallazgos sugieren que un análisis de la vía de antioxidante de L-carnosina aclarará el mecanismo que subyace a los efectos anti-proliferativos de este dipéptido en células de cáncer de colon. Sin embargo, aunque el mecanismo molecular por el que se regula la L-carnosina abajo o inhibe la actividad de HIF-1α aún no ha sido aclarada, esta capacidad puede ser prometedora en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la hipoxia-
Visto:. Iovine B, Oliviero G, Garofalo M, Orefice M, Nocella F, Borbone N, et al. (2014) El efecto antiproliferativo de la L-carnosina se correlaciona con una disminución en la expresión del factor inducible por hipoxia 1 alfa en células de cáncer de colon humano. PLoS ONE 9 (5): e96755. doi: 10.1371 /journal.pone.0096755
Editor: Sabato D'Auria, CNR, Italia |
Recibido: 17 Marzo, 2014; Aceptado: 5 Abril 2014; Publicado: May 7, 2014
Derechos de Autor © 2014 Iovine y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el "Finanziamento per l'Avvio di Ricerche Originali", Università degli Studi di Napoli Federico II, GO. "Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale" concesión 2009 de la italiana Ministero della Ricerca e dell'Università, GO NB GP. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
L-carnosina (β-Ala-His) es un dipéptido histidina de origen natural, sintetizado endógenamente y se encuentra ampliamente en el cerebro, músculo, riñón, estómago, y, en grandes cantidades, en el músculo esquelético. Este dipéptido se ha demostrado para realizar un número de funciones biológicas, incluyendo la actividad anti-oxidante, capacidad de quelar iones metálicos, la inhibición de la glicosilación de proteínas, anti-inflamatorio y anti-senescencia [1]. Otro aspecto del efecto de la L-carnosina se refiere a su efecto antiproliferativo en líneas celulares humanas. Recientemente, hemos demostrado que la L-carnosina inhibe la proliferación de células humanas de carcinoma colorrectal HCT-116 al afectar a la producción de ATP y ROS y mediante la inducción de la detención del ciclo celular en la fase G1 [2]. Además, algunos autores, con un enfoque proteómico, apoyan la posibilidad de que este dipéptido afecta el crecimiento de células tumorales en las células de glioma humano y retarda el crecimiento del tumor in vivo en un modelo de ratón NIH3T3-HER2 /neu a través de una interferencia con el plegamiento de proteínas /procesamiento y la señalización de HIF-1α [3] - [4]. En realidad, considerables esfuerzos se han dirigido al descubrimiento de las moléculas de químicos o naturales que se dirigen a la proteína HIF-1α y regular vía de señalización de HIF-1α a través de una variedad de mecanismos moleculares, incluyendo la regulación de la transcripción, la estabilización, la degradación y la transactivación. De particular interés es el papel de ROS y moléculas antioxidantes en la regulación de HIF-1α. En efecto, una serie de compuestos, tales como rapamicina y resveratrol, han demostrado ser inhibidores de HIF-1α [5] - [6]. HIF-1α es un componente de HIF-1 complejo que juega un papel central en O
2 homeostasis y, de hecho, se considera un regulador central de las respuestas de adaptación de las células cancerosas a la hipoxia [7]. HIF-1 complejo es un factor de transcripción heterodimérico que consiste en O
2 regulados por el HIF-1α y subunidades HIF-1β expresadas constitutivamente. En condiciones de normoxia la hidroxilasa PHD2 isoforma prolil hidroxila HIF-1α en dos residuos de prolina funcionalmente independientes, Pro
402 y Pro
564, dentro del dominio ODD (degradación dependiente de oxígeno) [8] - [9]. residuos hidroxilados Pro promueven el reclutamiento de HIF-1α por Von Hippel-Lindau proteína supresora de tumor (VHL), un módulo de reconocimiento de la ligasa E3-ubiquitina, responsable de su ubiquitinación y la posterior degradación mediada por proteasoma [10]. Bajo condiciones de hipoxia de la proteína HIF-1α escapa a la proteólisis, es upregulated, y forma un heterodímero con HIF-1β en el complejo HIF-1. El complejo HIF-1 reconoce y se une al elemento de respuesta a hipoxia (HRE) de los genes inducibles por hipoxia, incluyendo genes que influyen en la angiogénesis, el metabolismo del hierro, la modulación del metabolismo de la glucosa, la proliferación celular, la supervivencia, y la invasión, activando de esta manera su transcripción [ ,,,0],11]. En los últimos años, HIF-1 se ha convertido en un objetivo prometedor para la terapéutica del cáncer. De hecho, HIF-1α sobre-expresión es una característica común de los cánceres humanos, en los que media la adaptación al microambiente del tumor hipóxico. De acuerdo con estas observaciones, el propósito de este estudio fue investigar en la línea celular HCT-116 los efectos de la L-carnosina sobre la expresión de HIF-1α y genes HIF-1α-dependientes. Además, en los últimos años de especial interés ha sido el papel de ROS y moléculas antioxidantes en la regulación de HIF-1α [12]. Por lo tanto, para comprender los mecanismos responsables del efecto de L-carnosina también hemos examinado cómo este dipéptido afecta a los niveles intracelulares de ROS en comparación con compuestos de dos nuevos anti-oxidantes bis-diaminotriazol (es decir, 1 y 2 respectivamente) disponible de nuestros laboratorios y cuya antioxidante la actividad no está publicado. A pesar de estos tres compuestos tienen la misma capacidad en la reducción intracelular de ROS, se encontró que 1 y 2 no tienen efecto sobre la expresión de HIF-1α y proliferación de células cancerosas. Suponemos que la actividad antioxidante de L-carnosina funciona con un mecanismo diferente al de los compuestos 1 y 2. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que un análisis de la vía de antioxidante de L-carnosina aclarará el mecanismo que subyace a los efectos de este dipéptido en células de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Cell Culture
HCT-116 línea celular de carcinoma colorrectal humano se adquirió en la American Type Culture Collection (ATCC) EE.UU.. La línea celular se cultivó a 37 ° C y 5% de CO
2 en DMEM (Dulbecco Modificado Medio Eagle) comprado a la célula Bio Whittaker clásico Medios de cultivo, Lonza - VWR International srl, suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) ( Gibco Laboratories, North Andover, Massachusetts) y 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco Laboratories).
compuestos químicos Síntesis de Bis-triazol 1 y 2
Los dos compuestos se prepararon mediante una reacción de el ácido correspondiente (ácido trans-trans-mucónico y ácido fumárico, respectivamente) con monoclorhidrato de diaminoguanidina en ácido polifosfórico como el agente deshidratante, siguiendo el procedimiento ya descrito en [13]. Los clorhidratos de 1 y 2 se prepararon como sigue. Cada bis-diaminotriazol se suspendió en agua. Ácido clorhídrico diluido (10 ml HCl conc. En 100 ml de agua) se añadió, se calienta a ebullición hasta que el sólido se disolvió completamente. Después de enfriar a temperatura ambiente, 2 se obtuvo en forma de cristales prismáticos de color marrón. En el caso de 1, el clorhidrato de (pálido cristales prismáticos de color marrón) se obtuvo mediante la adición de etanol a la solución de agua y enfriamiento a temperatura ambiente. La estructura de los clorhidratos y la protonación en el átomo de N-2 del anillo, en lugar de en los grupos amino, fue confirmada por el análisis de un solo cristal (trabajo en preparación) y es consistente con resultados similares reportados en [13].
Tratamientos
L-carnosina, suministrado por Sigma-Aldrich Canadá, se disolvió en DMEM sin rojo de fenol (Sigma-Aldrich). células HCT-116 se sembraron a una concentración de 3,0 x 10
6 células en placas de 100 mm. Después de la incubación durante un día a 37 ° C en 5% de CO
2, se añadió L-carnosina de 0,5 a 100 mM; las células se incubaron a 37 ° C y se recogieron 24 h después. El tratamiento con los compuestos bis-diaminotriazol (1 y 2) se llevó a cabo en las mismas condiciones usando concentraciones de 0,05 a 0,5 mM. Para CoCl2 tratamiento
mM CoCl 100
2 se añadió a HCT-116 durante 6 h. MG132, suministrada por Calbiochem EE.UU. se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se añadió al medio de cultivo. Se incubaron las células HCT-116 para 1 h antes del tratamiento de L-carnosina [14]. 24 h después del tratamiento de L-carnosina se recogieron las células para la inmunoprecipitación de la proteína.
microscopía de fluorescencia
células HCT116 se cultivaron en portaobjetos durante 24 h y se trataron con 100 mM de L-carnosina. Después de 24 h, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído frío al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 10 min y luego se permeabilizaron con 0.4% de Triton X100 en PBS 1X. Después de 10 min, las células se lavaron dos veces con PBS /0,4% de albúmina de suero bovino 1X (BSA) durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se trataron primero con anticuerpos HIF-1a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) en PBS 1X /0,4% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente y posteriormente con ALEXA 568 (Alexa Molecular Probes 'Fluor 568) secundaria de anticuerpos en PBS 1X /0,4% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar con PBS, las células se tiñeron con medio de montaje para la fluorescencia con DAPI (Vector Laboratories). Los resultados se examinaron por microscopía de fluorescencia en un Zeiss Axiophot a 40X resolución.
actividad antioxidante de medición por el método de DPPH
método de enfriamiento
DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) se empleó para la evaluación de la actividad antioxidante de 1, 2 y L-carnosina [15]. La capacidad de las muestras para captar el radical DPPH se midió utilizando el método de Brand-Williams [16]. Se añadieron alícuotas (60 mu l) de solución 1 mM de 1, 2 y L-carnosina a 3 ml de solución de DPPH (6 × 10
-4 M) y la absorbancia se determinó a 515 nm (Philips PU 8620 serie UV /espectrofotómetro Visible) cada 5 min hasta que el estado estacionario. Para cada ensayo antioxidante, se utilizó una alícuota de Trolox para desarrollar una curva estándar de 50 a 500 mM. Todos los datos se expresaron entonces como Trolox equivalentes (mmol TE /L).
Análisis de la viabilidad celular
El ensayo MTT se realizó de acuerdo con el protocolo se informó anteriormente [17]. células HCT-116 se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 células en placas de 96 pocillos. Posteriormente, los compuestos bis-diaminotriazol (1 y 2) se analizaron utilizando concentraciones de 0,05 a 0,5 mM. Después de 24 h de incubación, 10 l de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT) (Sigma Aldrich) (0,05 mg /ml) se añadieron al medio de cultivo. Después de 4 h a 37 ° C se retiró el medio de cultivo y se añadieron 200 l de DMSO para disolver las sales de formazan. La absorbancia se midió con un espectrofotómetro de placas de 96 pocillos a 570 nm. Los experimentos se realizaron de forma independiente tres veces y cada experimento contenían repeticiones triples. Las muestras de control que contienen un medio de cultivo completo exento de células o células de control sin L-carnosina también se incluyeron en cada experimento.
clonogénico Ensayo
células HCT116 se sembraron a una densidad de 500 células /pocillo en placas de 12 pocillos en 500 l de medio de cultivo fresco que contiene DMEM completo con 20-50-100 mM L-carnosina o compuestos bis-diaminotriazol (1 y 2) (de 0,05 a 0,5 mM). Después de 7 días, las células se lavaron dos veces con PBS 1X y se tiñeron con una solución de cristal violeta 0,2%, 50% de metanol y ácido acético al 10% en H
2O durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron con agua desionizada H
2O y se fotografiaron.
Medición de especies reactivas del oxígeno (ROS) guía
La formación de ROS se evaluó por medio de la 2,7-diclorofluoresceno -diacetate sonda (H2DCF-DA) (adquirido de Sigma-Aldrich). células HCT-116 se sembraron a una densidad de 5 × 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos en 100 l de medio de cultivo fresco que contenía DMEM sin rojo de fenol. Se permitió que las células crezcan durante 24 horas a 37 ° C en 5% de CO
2, se añadieron a continuación, L-carnosina (de 0,5 a 100 mM) o compuestos 1 y 2 (de 0,05 a 0,5 mM) al medio de cultivo . La medida de ROS se realizó de acuerdo con el protocolo se informó anteriormente [18]. La fluorescencia se controló usando un Espectrómetro de Fluorescencia 55 LS (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield, Inglaterra). En cada experimento, el aumento de fluorescencia se midió en tres cultivos replicados para cada tratamiento.
Ensayo de transfección y luciferasa reportero de ensayo
Las células se transfectaron con el elemento de respuesta a hipoxia (HRE) reportero -luciferase plásmido o con un vector que contiene el dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) de HIF-1α, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) en el OptiMEM-1 medio libre de suero (Lonza, Verviers, Bélgica), de acuerdo con la especificaciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 24-48 h. La actividad de luciferasa se evaluó mediante el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y con un Promega GloMax 20/20 luminómetro, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Preparación del total, proteína nuclear y citosólico extractos
extractos totales de HCT-116 se prepararon 24 h después del tratamiento con L-carnosina de 0,5 a 100 mM o con 1 o 2 de 0,05 a 0,5 mM. Las muestras se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo 1X y se centrifuga a 240 g durante 10 min a 4 ° C. El sedimento celular se resuspendió en un tampón de lisis frío que contenía 1% de Triton X100, 0,1% de SDS, 0,1% NaN
3, NaCl 100 mM, NaF 50, Na 0,1 mM
3Vo
4, 10 mM Nappi, PMSF 0,5 mM y 10 mg /ml de aprotinina, leupeptina y pepstatina a 4 ° C durante 30 min en hielo. Los lisados celulares se centrifugaron a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C. Para fueron cosechadas citosólica y células HCT116 extractos nucleares, se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo 1X y se centrifugó a 240 xg durante 10 min a 4 ° C. El sedimento celular se resuspendió en 100 l de tampón de lisis hipotónico enfriado con hielo (10 mM HEPES pH 7,9, KCl 10 mM, PMSF 1 mM, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, DTT 1 mM, mM Na 1
3Vo
4, 10 mg /ml cada uno de aprotinina, leupeptina, y pepstatina) y se incubaron con agitación a 4 ° C durante 15 min. A continuación, las células se lisaron mediante la adición de 5% de NP40. El extracto celular se centrifugó durante 5 min a 500 x g y el sobrenadante que contiene la fracción citosólica a continuación, se obtuvo después de centrifugación adicional durante 10 min a 20.000 x g.
El sedimento nuclear se resuspendió en tampón de extracción de alta sal ( 20 mM HEPES pH 7,9, 0,4 M NaCl, mM PMSF 1 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1, 10 mg /ml cada uno de aprotinina, leupeptina, y pepstatina) y se incubaron con agitación a 4 ° C durante 15 min . El extracto nuclear se centrifugó durante 15 min a 20.000 x g, y el sobrenadante se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C. La concentración de proteína se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Para los análisis de transferencia de Western, las proteínas obtenidas fueron desafiados con anticuerpos contra HIF-1α (anticuerpo policlonal de conejo de Santa Cruz Biotechnology), aldolasa A (Abnova), aldolasa C (anticuerpo policlonal de conejo de Santa Cruz Biotechnology) y β-actina (mouse monoclonal de Santa Cruz Biotechnology). Las señales se detectaron utilizando el kit ECL (GE Healthcare).
inmunoprecipitación
células HCT-116 se lisaron en tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 250 mM, 0,1 % de SDS, 1% NP-40, 1% desoxicolato de sodio, EDTA 5 mM, y DTT 1 mM) suplementado con inhibidores de proteasa. Las muestras (800 mg) se precleared con 30 l de proteína A /G PLUS-agarosa (Santa Cruz Biotechnology) durante 2 horas a 4 ° C. Se añadió el (anticuerpo policlonal de conejo de Santa Cruz Biotechnology) de anticuerpos anti-HIF-1α a lisado y se incubaron durante la noche a 4 ° C y después se añadieron 30 l de proteína A /G PLUS-agarosa al lisado. Después de 1 hora a 4 ° C, las proteínas se recuperaron en tampón de Laemmli, se resolvió en gel de desnaturalización del 8% y después se sometieron a inmunotransferencia.
-PCR en tiempo real de ensayo
El ARN total se preparó a partir HCT -116 células usando el kit RNeasy mini (Qiagen) y fue usado para sintetizar el ADNc con cebadores de hexanucleótidos aleatorios y transcriptasa inversa MultiScribe (Invitrogen) a 48 ° C durante 1 h. El cDNA se amplificó en un tiempo real sistema de detección de PCR iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories) usando IQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). La PCR reacciones y gen cuantificación relativa de expresión en tiempo real se realizaron como se informó en [19]. Las proporciones entre 2
-ΔΔ
CT
antes del tratamiento con L-carnosina y los calculados para las muestras incubadas con L-carnosina de 5 a 100 mM se expresan como cambios veces.
Análisis estadístico
los resultados se expresaron como la media ± desviaciones estándar (desviaciones estándar) de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante análisis unidireccional de varianza ANOVA y el valor de p para una prueba de comparación múltiple. El nivel de significación estadística se definió como ** p & lt; 0,001, *** p & lt; 0,0001 [2]. Los análisis se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 3.0; GraphPad Software, Inc .: La Jolla, CA, EE.UU., 2002) en una plataforma Windows
Resultados
L-carnosina Reduce HIF. niveles de proteína -1α que afectan a su estabilidad en células HCT-116
con el fin de establecer el efecto del dipéptido L-carnosina sobre la expresión del factor de transcripción HIF-1α, células de carcinoma de colon humano (HCT-116) se trataron con diferentes concentraciones de L-carnosina (de 0,5 a 100 mM). En particular, el análisis de RT-PCR, 24 h después de la adición de L-carnosina, revelaron un estado de equilibrio de los niveles de ARNm de HIF-1α, en comparación con células control sin tratar (Figura 1A). A continuación, se evaluaron los efectos de la L-carnosina sobre la expresión de la proteína HIF-1α en las células HCT-116 por Western blot. Los niveles de proteína se evaluaron tanto en la hipoxia y normoxia, así como en la presencia (de 0,5 a 100 mM) y ausencia de L-carnosina. En las células de normoxia HCT-116, 50 a 100 mM de L-carnosina reduce la expresión de HIF-1α en comparación con una muestra de control no tratados con L-carnosina (Figura 1B). También observamos que el (
2 por CoCl) la expresión inducida por hipoxia HIF-1α del disminuyó después del tratamiento con 50 o 100 mM de L-carnosina (Figura 1C). Las transferencias se volvieron a sondar con anticuerpos contra β-actina para confirmar la equivalencia carga de proteína. Para confirmar la reducción de HIF-1α se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Se encontró que el inmunoprecipitado HIF-1α-anticuerpo contenía niveles significativos de proteína HIF-1α sólo en la muestra de control (Figura 2A). Además, se investigó el efecto de la L-carnosina sobre la síntesis de proteínas HIF-1α en las células tratadas con cicloheximida (CHX). El análisis de estabilidad de la proteína HIF-1α en células CHX-tratado mostró que el nivel de HIF-1α disminuyó en las células L-carnosina tratados (50-100 mM), lo que sugiere que la L-carnosina afecta a la estabilidad de la proteína HIF-1α (Fig. 2B). Por otra parte, hemos examinado si este dipéptido podría estar implicada en la degradación del proteasoma de HIF-1α. Por lo tanto, se evaluaron mediante análisis de transferencia western del efecto de la MG132 inhibidor del proteasoma en los niveles de proteína HIF-1α después del tratamiento con 50 a 100 mM de L-carnosina. Como se muestra en la Figura 2C, el tratamiento con MG132 1 mM y L-carnosina durante 24 h aumentó el nivel de proteína HIF-1α comparación con las células de control sin tratar o a las células tratadas con MG132 solo. Una indicación adicional de la implicación de L-carnosina en la degradación del proteasoma HIF-1α se obtuvo por transfección de un vector que contiene el dominio ODD de HIF-1α. Como se muestra en la Figura 2D, la actividad de la luciferasa disminuyó notablemente 24 h después del tratamiento con L-carnosina (100 mM).
(A) ARNm de HIF-1α fueron medidos por PCR en tiempo real en una preparación de ARN total de HCT -116 células 24 h después del tratamiento de L-carnosina. Las barras blancas indican cambios veces de ARNm con respecto a la cantidad de HIF-1α mRNA en células no tratadas reportadas como valor de 1; (B) análisis de transferencia de Western de extractos de proteína total a partir de células HCT-116 24 h después de
2 de tratamiento de L-carnosina y (C) L-carnosina y CoCl probaron con HIF-1α y anticuerpos beta-actina. histogramas relacionados informan los valores densitométricos de relación de HIF-1α /β-actina. Los valores densitométricos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron significativas a ** p & lt; 0,001, *** p & lt; 0,0001
(A) análisis de transferencia Western sondado con anticuerpos anti-HIF-1α de las proteínas inmunoprecipitadas en HCT-116.; (B) análisis de transferencia de Western de extractos de proteína total a partir de células HCT-116 24 h después de la L-carnosina (100 mM) o L-carnosina (100 mM), además de cicloheximida 10 mM (CHX) de tratamiento probaron con HIF-1α y β-actina anticuerpos. histogramas relacionados informan los valores densitométricos de relación de HIF-1α /β-actina; (C) análisis de transferencia de Western de extractos proteicos totales de HCT-116 células 24 h después de L-carnosina (100 mM) o L-carnosina (100 mM) más el tratamiento con 1 mM MG132 probaron con HIF-1α y anticuerpos beta-actina. Los valores densitométricos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron significativas a ** p & lt; 0,001, *** p & lt; 0,0001; (D) Representación esquemática de ODD-LUC reportero de vectores. ODD-LUC vector contiene el dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) de HIF-1α clonado aguas arriba del gen de la luciferasa. La actividad de luciferasa se midió 48 h después de la transfección y representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Los valores han sido reportados como porcentajes de la actividad de luciferasa en comparación con el 100% de las células no tratadas.
Influencia de L-carnosina HIF-1α translocación nuclear La reducción de la actividad transcripcional de la hipoxia de elemento de respuesta (HRE) y la expresión de sus genes aguas abajo
estabilizada de proteína HIF-1α se transloca desde el citoplasma al núcleo donde se dimeriza con la formación de HIF-1β la transcripcionalmente activo HIF-1 complejo. Por lo tanto, la localización nuclear de HIF-1α es esencial para la actividad transcripcional de HIF-1α. El efecto de L-carnosina en la localización intracelular de HIF-1α se analizó en un primer paso por el ensayo de Western Blot utilizando fracciones de proteínas citoplasmáticas y nucleares, y posteriormente por el análisis de inmunofluorescencia. Como se muestra en las figuras 3A y 3B, las influencias de L-carnosina la translocación de HIF-1α desde el citoplasma al núcleo. De hecho, cuando las células HCT-116 se trataron con L-carnosina los niveles de proteína nuclear de HIF-1α disminuyeron notablemente, mientras que los niveles citosólicos no se vieron afectados. Las células también en el análisis de inmunofluorescencia (Figura 3C) la señal de HIF-1α en L-carnosina tratados fue débilmente detectable en comparación con las células control no tratadas o células CoCl
2-tratados. En las células cancerosas, la activación del complejo de HIF-1 implica su asociación con el motivo EDH en las regiones reguladoras de los genes diana implicados en el proceso glucolítico. Por esta razón, las células HCT-116 se transfectaron transitoriamente con el plásmido informador de luciferasa-HRE. Como se muestra en la figura 3D, el tratamiento con 100 mM de L-carnosina causó disminución apreciable de la actividad de la luciferasa (24 h después del tratamiento). Posteriormente, se evaluaron los ARNm de algunos genes HIF-1a-dependiente. Se midió por análisis RT-PCR de los efectos de diferentes concentraciones de L-carnosina (0,5, 5, 50 y 100 mM) en los niveles de mRNA de la aldolasa A y PDK-1. Como se muestra en la Figura 4B, aldolasa A y los niveles de PDK-1 mRNAs disminuyeron después del tratamiento con L-carnosina, especialmente entre 50 y 100 mM. El análisis de transferencia Western de la aldolasa A demostró también una reducción del nivel de proteínas (Figura 4C). Además, se observó que la expresión de la proteína GLUT-1, así como de la proteína aldolasa C, disminuyó después del tratamiento de L-carnosina (Figura 4D y 4E). La aldolasa C es una isoforma específica del cerebro de aldolasa, pero recientemente se ha demostrado que el nivel de mRNA de aldolasa C es 30 veces mayor en líneas celulares de cáncer gástrico humano. Las secuencias de oligonucleótidos utilizados en el análisis RT-PCR se presentan en la Figura 4A.
(A) análisis de transferencia de Western de citosólica y (B) los extractos de proteína nuclear a partir de células HCT-116 24 h después de 20-50-100 mM tratamiento de L-carnosina probaron con HIF-1α, β-actina y los anticuerpos de la histona H3. histogramas relacionados informan los valores densitométricos de HIF-1α /β-actina y la relación A /H3 HIF-1α. Los valores densitométricos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron significativas a *** p & lt; 0,0001; (C) HCT-116 tratadas con CoCl
2 y 100 mM de L-carnosina durante 24 h examinados con microscopio de fluorescencia a un aumento de 40x utilizando filtros para anticuerpo secundario frente a la proteína HIF-1α y de 4 '6' diaminodino-2 -phenylindole (DAPI); (D) Representación esquemática de la EDH-LUC reportero de vectores. HRE-LUC vector contiene nueve secuencias de repetición del elemento de respuesta a la hipoxia (HRE) clonado aguas arriba del gen de la luciferasa. La actividad de luciferasa se midió 48 h después de la transfección y representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Los valores han sido reportados como porcentajes de la actividad luciferasa en comparación con el 100% de las células no tratadas
(A) La tabla muestra las secuencias de los cebadores utilizados en los experimentos de PCR en tiempo real.; (B) aldolasa A y PDK-1 mRNA
S fueron medidos por PCR en tiempo real en una preparación de ARN total a partir de células HCT-116 24 h después del tratamiento de L-carnosina. Las barras indican los cambios de mRNA doblar
S con respecto a la cantidad de aldolasa A y PDK1 mRNAs en células no tratadas reportadas como valor de 1; (C), (D) y (E) análisis por transferencia Western de extractos de proteína total a partir de células HCT-116 24 h después del tratamiento de L-carnosina probaron con aldolasa, anticuerpos beta-actina A, aldolasa C GLUT-1 y. Histogramas informan los valores densitométricos de aldolasa relación A /β-actina, aldolasa /relación de β-actina C y GLUT-1 /β-actina relación. Los valores densitométricos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron significativas a ** p & lt; 0,001, *** p & lt; 0,0001
El efecto antioxidante de los compuestos 1 y 2 en comparación con L-carnosina
La generación de. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la hipoxia proporciona una señal redox para la inducción de HIF-1α. De hecho, algunos autores definen ROS como reguladores positivos de HIF-1α [20]. La observación de que otras sustancias antioxidantes pueden influir en el nivel de proteína HIF-1α nos llevó a evaluar la actividad antioxidante de dos nuevos compuestos bis-diaminotriazol (1 y 2) (Figura 5A), en comparación con la de L-carnosina, por DPPH ensayo. En primer lugar, se midió el porcentaje de DPPH inactivación utilizando una concentración de 1 mM para todos los compuestos, y hemos demostrado que los compuestos 1 y 2 poseen una actividad importante como eliminadores de ROS en comparación con L-carnosina (véase la tabla en la figura 5B). A continuación, se examinó la generación de ROS intracelular inducida por L-carnosina (100 mM) en las células HCT-116 y la comparó con la cantidad de ROS generados por el tratamiento de la misma línea celular con diferentes concentraciones (de 0,05 a 0,5 mM) de los compuestos 1 y 2. Como se muestra en la Figura 5C, el tratamiento con, 0,1 y 0,5 mM de 1 y 2 reduce la generación de ROS intracelular en HCT-116 en alrededor de 40 a 50%, de manera similar a 50-100 mM L-carnosina. Finalmente, también se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de 1 y 2 (de 0,05 a 0,5 mM) sobre la expresión HIF1-α y la viabilidad celular. Como se muestra en las figuras 6A y 6B, la adición de 1 y 2 no afectó los niveles de proteína HIF-1α ni la proliferación celular. Además, se evaluó mediante el ensayo de supervivencia clonogénico la capacidad de las células HCT-116 para proliferar y formar una gran colonia o un clon en presencia de L-carnosina o 1 o 2 (Figura 6C). 50 mM de L-carnosina redujo significativamente el número de colonias con respecto a la muestra de control sin tratar, mientras que los compuestos 1 y 2 no influyeron en la capacidad de las células para formar colonias a la concentración ensayada. Una citometría de flujo de ensayo (FACS) confirmó que 1 y 2 no afectó a la del ciclo celular y no indujo apoptosis en las células HCT-116 (datos no mostrados). La tasa de muerte apoptótica temprana en las células HCT-116 tratadas con los dos compuestos no fue significativamente diferente de la muestra de control
(A) Estructuras químicas de los compuestos 1 y 2.; (B) La actividad antioxidante de L-carnosina, 1 y 2 medida por el método de DPPH como se describe en la Sección 1.2.4; (C) ROS producción evaluó 24 h después de la adición de L-carnosina, 1 y 2 en las células HCT-116 por la sonda 2 ', 7'-diclorofluoresceína-diacetato (H2DCF-DA). Todos los valores representan la media ± DE de tres experimentos independientes y se expresan como un porcentaje en comparación con el 100% de las células control. Las diferencias se consideraron significativas a ** p & lt; 0,001, *** p & lt;.
0,0001
(A) Análisis de transferencia Western de los extractos de proteínas totales de células HCT-116 después del tratamiento con los compuestos 1 y 2 se sondearon con HIF-1α y anticuerpos beta-actina. Histogramas informan los valores densitométricos de relación de HIF-1α /β-actina. Los valores densitométricos representan la media ± DE de tres experimentos independientes; (B) la proliferación celular se midió mediante el ensayo de MTT en las células HCT-116 24 h después del tratamiento con los compuestos 1 y 2. Todos los valores representan la media ± DE de tres experimentos independientes y se expresan como porcentaje en comparación con el 100% de las células de control ; (C) ensayo de supervivencia clonogénico en HCT-116 después del tratamiento con L-carnosina (50 mM) o los compuestos 1 y 2 (0,5 mM) con respecto a las células no tratadas.
Discusión
en este estudio, se evaluó el efecto del tratamiento con L-carnosina sobre la actividad de HIF-1α en células de cáncer de colon humano. [28].