Extracto
Los meduloblastomas y los glioblastomas, los tumores cerebrales primarios más comunes en niños y adultos, respectivamente, son extremadamente difíciles de tratar. Los esfuerzos para identificar nuevas proteínas esenciales para el crecimiento de estos tumores pueden ayudar a mejorar nuestra comprensión de la biología de estos tumores, así como, identificar objetivos para futuras terapias. La reciente identificación de los factores de transcripción centradas en múltiples paisajes de interacción de proteínas en las células madre embrionarias ha identificado numerosas proteínas que se han estudiado, que son esenciales para la auto-renovación de estas células madre. Para identificar nuevas proteínas esenciales para el destino de las células tumorales del cerebro, hemos examinado la red de interacción de la proteína del factor de transcripción, Sox2, en las células de meduloblastoma. Para este propósito, tecnología de proteínas multidimensional de identificación (MudPIT) identificó & gt; 280 proteínas SOX2-asociado en la línea celular de meduloblastoma DAOY. Para comenzar a entender las funciones de las proteínas asociadas a SOX2 en el cáncer de cerebro, nos hemos centrado en dos proteínas asociadas a SOX2, Musashi 2 (MSI2) y la proteasa específica de ubiquitina 9x (USP9X). Estudios recientes han implicado MSI2, una proteína de unión de ARN putativo, y USP9X, una enzima deubiquitinating, en varios tipos de cáncer, pero no tumores cerebrales. Demostramos que desmontables de MSI2 reduce significativamente el crecimiento de las células DAOY, así como células U87 y glioblastoma U118. También demostramos que la caída de USP9X en DAOY, U87 y U118 células tumorales del cerebro reduce fuertemente su crecimiento. En conjunto, nuestros estudios identifican un gran conjunto de proteínas asociadas a SOX2 en células de meduloblastoma DAOY e identifican dos proteínas, MSI2 y USP9X, que requieren más investigación para determinar si son posibles dianas terapéuticas para el cáncer de cerebro
Cita.: Cox JL, Wilder PJ, Gilmore JM, Wuebben eL, Washburn MP, Rizzino a (2013) el Sox2-Interactome en células de cáncer de cerebro Identifica la exigencia de MSI2 y USP9X para el crecimiento de células tumorales del cerebro. PLoS ONE 8 (5): e62857. doi: 10.1371 /journal.pone.0062857
Editor: Robert W. Sobol, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de diciembre de 2012; Aceptado: March 26, 2013; Publicado: May 7, 2013
Derechos de Autor © 2013 Cox et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones del Departamento de Salud (2011-29, 2012-33) Nebraska. EW fue apoyado en parte por una beca de formación del NCI (CA009476). JMG y MOP fueron apoyados por el Instituto Stowers de Investigación Médica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los glioblastomas (GB) y meduloblastomas (MB) son muy debilitantes enfermedades que son muy difíciles de tratar. A pesar de la mejora de los regímenes terapéuticos, los pacientes diagnosticados con GB, el tumor cerebral primario para adultos más común, tienen una supervivencia media de 10-14 meses [1]. Tratamiento de pacientes con MB, el cáncer de cerebro pediátrico más común, plantea un problema adicional. Las terapias actuales para MB causan deterioro dramático de la función cognitiva y predisponen a los pacientes a los futuros neoplasmas asociados al tratamiento [2]. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar nuevas proteínas y vías de señalización que pueden servir como nuevos objetivos para el tratamiento mejorado de GB y MB. Relevante para el trabajo que se describe en este estudio, los niveles elevados del factor de transcripción Sox2, que desempeña un papel crítico en el desarrollo del sistema nervioso, se ha demostrado que se correlaciona con un mal resultado clínico para pacientes con tumores cerebrales [3]. El papel fundamental de Sox2 en los tumores cerebrales es apoyada por el hallazgo de que desmontables de Sox2 de interferencia por ARN reduce el
in vitro
y
in vivo
crecimiento de las células GB [4]. Por otra parte, Sox2 se expresa en las células MB [3] y, recientemente, hemos determinado que la caída de Sox2 en las células DAOY MB reduce su proliferación (Cox y Rizzino, resultados no publicados).
Durante los últimos 10 años , un considerable esfuerzo se ha dedicado a la comprensión de los mecanismos por los cuales los factores de transcripción esenciales median sus efectos. Más recientemente, avances se han hecho importantes hacia mapeo proteína-proteína paisajes de interacción de factores de transcripción esenciales en un número de sistemas celulares. Por ejemplo, se han realizado grandes progresos en la determinación del proteoma de factores de transcripción, en particular, Sox2, Oct4 y Nanog, necesaria para el mantenimiento de la auto-renovación y pluripotencia de células madre embrionarias (ESC) [5] - [11]. La integración de interactomes para Sox2, Oct4 y Nanog, sostiene que estas pluripotencia asociada factores de transcripción son parte de un paisaje de la interacción proteína-proteína altamente integrado, que incluye muchos otros factores de transcripción, maquinaria remodelación de la cromatina, la maquinaria de reparación del ADN y las proteínas de unión de ARN [9 ], [11] - [13]. Por otra parte, las pantallas de proteómica imparciales para identificar proteínas que se asocian con Sox2 en el ratón CES han demostrado ser un poderoso método para la identificación de atención en los estudios proteínas, tales como Banf1 y Musashi2 (MSI2), que influyen significativamente en el destino de la CES [11] - [ ,,,0],15]. Dado que los asociados SOX2 con una gran variedad de proteínas esenciales, es probable que el análisis proteómico de la Sox2-interactoma en las células tumorales del cerebro podría ayudar a identificar proteínas adicionales que influyen en el crecimiento de estos tumores.
Para mejorar nuestra comprensión de los tumores cerebrales, el trabajo presentado en este estudio se dispuso a abordar dos cuestiones. ¿Cuál es la composición de la Sox2-interactoma en la línea celular tumoral MB DAOY? ¿Puede la pantalla proteómico de las proteínas asociadas a SOX2 ayudar a identificar proteínas adicionales que son requeridos por las células tumorales del cerebro? Nos informan de que los asociados con SOX2 & gt; 280 proteínas en las células DAOY. Además, se demuestra que dos proteínas SOX2-asociado, MSI2 y específica de ubiquitina peptidasa 9x (USP9X), que han sido recientemente implicados en el crecimiento de otros tipos de cáncer [16] - [21], están obligados a apoyar el crecimiento y la supervivencia de células DAOY y dos líneas de células tumorales GB, U87 y U118.
Procedimientos experimentales
Cell Cultura y
DAOY (HTB-186, ATCC, Manassas, VA), i- SOX2-DAOY, U87 (HTB-14, ATCC), U118 células (HTB-15, ATCC) y HEK293T (CRL-11268, ATCC) se cultivaron, tal como se describe anteriormente [22]. partículas lentivirales se produjeron, y se infectaron las células, como se describe anteriormente [15]. El crecimiento celular se analizó utilizando el ensayo MTT, tal como se describe anteriormente [15] utilizando células se volvieron a sembrar 3-4 días después de la infección lentiviral.
plásmido Producción
se obtuvo FUW-teto-Sox2 (20724) de Addgene (Cambridge, MA). vector pLVX-Tet-On ® avanzada se obtuvo de Clontech (632.162, Mountain View, CA). Vectores para producir lentivirus shRNA para MSI2 (RMM4534-NM_011443) y USP9X (RHS4533-NM_001039590) derribos se obtuvieron de Applied abierto (Huntsville, AL). A shRNA no específica previamente validado (codificado) se utilizó como control negativo en los experimentos desmontables [23]. shRNA secuencias se proporcionan en la Tabla S4 suplementario.
Para realizar ingeniería pLVX-tetO- (fs) Sox2, etiquetas estreptocócica y la bandera se añadieron secuencialmente a la N-terminal de Sox2 por dos rondas de PCR. La primera ronda de PCR utilizado FUW-teto-Sox2 como molde, el cebador aguas arriba: CAAGAAGCTTGCC
AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG
GGCGGAATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAG (subrayado: HindIII, en cursiva: Strep-epítopo, negrita: CDS SOX2, negrita subrayado: mutación silenciosa para destruir un sitio BsrGI endógeno) y el cebador aguas abajo: AGGACTCGAGCGCGGGACCACACCATGAAGG (subrayado: XhoI). Este fragmento se digirió con HindIII y XhoI y se ligó en los sitios de Bluescript KS + (Sratagene, Santa Clara, CA) correspondiente. La segunda ronda de PCR, utilizando el plásmido intermedio como molde, se llevó a cabo con el siguiente cebador aguas arriba: AAGGTCTAGATGTAC
ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG
GGGTCGGCCGCC
AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG gratis (subrayado: XbaI, gris: BsrGI, negrita y cursiva: Flag-epítopo, en cursiva: Strep-epítopo) y el cebador aguas abajo que contiene el sitio XhoI se describe anteriormente. A continuación, este producto de PCR se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en los sitios de Bluescript correspondiente. El Flag-Strep etiquetada 5 'final de SOX2 se aisló de este vector intermedio y se transfiere en el vector FUW-teto-SOX2 usando BsrGI y un sitio RsrII interna, para crear FUW-tetO- SOX2 (fs). (Fs) Sox2 se aisló de Sox2 FUW-tetO- (FS) con EcoRI y se ligó en pLVX-Tight-Puro (632.162, Clontech), para crear pLVX-tetO- (fs) Sox2. Orientación se verificó mediante secuenciación.
i-Sox2-DAOY Ingeniería Celular
DAOY células se sembraron a una densidad clonal y se infectaron con pLVX-Tet-On ® lentivirus avanzada para producir rtTA-DAOY. Las células se volvieron a alimentar medio fresco 2-3 veces por semana. Ocho días después de la siembra a una densidad clonal, las colonias individuales fueron aislados, y dos días más tarde, las colonias aisladas se expusieron a G418 (300 ug /mL). clones rtTA-DAOY se ampliaron para ~ 2 semanas bajo selección con G418. células rtTA-DAOY se sembraron a una densidad clonal y se infectaron con pLVX-tetO- (fs) Sox2. Las células se volvieron a alimentar medio fresco 2-3 veces por semana. Ocho días después de la siembra, las células fueron expuestas a la puromicina (5 mg /ml) durante 72 horas, después de lo cual se aislaron 6 clones. Cada clon se cultivó en medio suplementado con doxiciclina (0,1 mg /ml) durante 24 horas, y se aislaron las proteínas nucleares. expresión inducible de SOX2 (fs) se verificó por análisis de transferencia Western (datos no presentados). Un solo clon, denominado como i-Sox2-DAOY, se utilizó para el análisis proteómico.
El aislamiento de proteínas e inmunoprecipitación
homogeneización Dounce se utilizó para aislar las proteínas nucleares para el análisis MudPIT como se describe anteriormente [ ,,,0],24]. Para la inmunoprecipitación, los extractos nucleares se cargaron en M2-cuentas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se lavaron, y se eluyeron complejos de proteínas usando 3X péptido Flag (Sigma-Aldrich), como se describe anteriormente [9]. pulldown diferencial entre las muestras inducidas (+ Dox) y no inducidas (-DOX) se verificó por tinción de plata [9].
MudPIT Identificación de SOX2 asociada a proteínas
Proteína Multidimensional Tecnología de identificación (MudPIT se llevó a cabo) el análisis como se describe anteriormente [9]. Los conjuntos de datos de MS /MS fueron examinadas usando SEQUEST y el
Homo sapiens
de datos de proteínas (NCBI, 2010-11-22 liberación). Distribuidos Factores Abundancia Normalized espectrales (dNSAF) se calcularon para cada proteína detectada, como se describe en otra parte [25]. Tres experimentos independientes y análisis estadísticos se realizaron como se describe anteriormente [9]. Se determinó la tasa de falso descubrimiento espectral como se describe anteriormente [9], [26].
Análisis de Western Blot
Western blot se realizó como se describió anteriormente [9]. extractos de proteínas nucleares y citoplasmáticas se prepararon usando NE-PER kits (Thermo-Scientific, Rockford, IL) fue utilizado de acuerdo con el protocolo del fabricante para aislar proteínas para el análisis de transferencia Western, como se describe anteriormente [9]. Los niveles relativos de proteínas detectadas se determinaron como se describe anteriormente [11]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: a-MSI2 (ab83236, Abcam, Cambridge, MA), α-USP9X (ab56461, Abcam), α-USP7 (A300-033A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), α-Flag (F3165, Sigma -Aldrich), α-GAPDH (G8795, Sigma-Aldrich), α-NUMB (ab4147, Abcam), α-SOX2 (abl5830, Abcam), α-MCL1 (sc-819, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , α-β-catenina (9562, Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA).
Análisis de ARN
El aislamiento de ARN y síntesis de ADNc se realiza como se describe anteriormente [9]. La expresión de genes de MSI2 y USP9X en DAOY, U87, o células U118 tratadas con la orientación o revueltos shRNA fueron analizados por SYBR Green (SuperArrayBioscience Corporation, Federick, MD) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) [9]. Los cebadores usados para la etapa de PCR en el análisis de MSI2 ARN eran h-MSI2-F (AAGTATTAGGTCAGCCCCAC) y h-MSI2-R (TTCTCAAAAGTGACAAAGCC). Los cebadores usados para la etapa de PCR en el análisis de USP9X ARN eran h-USP9X-F (CAGATGACCAAGATGCTCC) y h-USP9X-R (GGGGATACTTCTTCACTGCC). Los cebadores para la expresión de GAPDH control se han descrito anteriormente [15].
Resultados
Ingeniería de la I-Sox2-DAOY Células y Análisis MudPIT de Sox2 asociada a proteínas
Para ayudar identificar nuevas proteínas esenciales para el crecimiento de las células MB, se analizó el Sox2-interactoma en las células MB DAOY. Es importante destacar que los factores de transcripción, como Sox2, no funcionan de manera aislada, sino que funcionan como parte de grandes complejos de proteínas. A este respecto, estudios anteriores realizados con ESC experimentar diferenciación han mostrado que Sox2 está presente en múltiples complejos de proteínas de gran peso molecular, algunos superior a 880 kDa [27]. Para examinar la SOX2-interactome, células fueron diseñados DAOY para la expresión inducible de SOX2 epítopo de etiquetado (i-SOX2-DAOY), ya que los anticuerpos dirigidos contra SOX2 no son adecuados para el aislamiento altamente específica y sensible de los complejos SOX2-proteína. Esto nos permitió aislar sistemáticamente Sox2 y sus proteínas asociadas utilizando M2-cuentas. Para diseñar i-SOX2-DAOY, las células DAOY se infectaron de forma secuencial con un lentivirus de introducir un transactivador inverso-tet expresado constitutivamente y un segundo vector lentiviral que expresa una doble epítopo Flag-Strep etiquetada forma de [SOX2 (fs)] SOX2 bajo la control de un promotor inducible Dox-(Fig. 1A).
(a) diagrama esquemático del sistema lentiviral utilizado para introducir un Dox-inducible, etiquetado con epítopo en células SOX2 DAOY MB. Dos vectores de lentivirus se utilizaron para introducir expresado constitutivamente transactivador inverso-tet (rtTA) e inducible (fs) Sox2 [etiquetada: Bandera-Sox2]. (B) Protocolo utilizado para aislar complejos de Sox2 en proteínas de las células DAOY MB para el análisis MudPIT aguas abajo. (C) Análisis de transferencia Western sondeo de Sox2 con un anticuerpo Sox2. El nivel de (fs) SOX2 se comparó con el nivel de SOX2 endógena, que se establece en 1. (D) Silver mancha que demuestra el enriquecimiento de las proteínas después de la inducción de (fs) SOX2 con Dox y inmunoprecipitación con M2-cuentas. La banda prominente observada a ~ 45 kDa es un contaminante común cuando se utilizan M2-cuentas para la inmunoprecipitación. * La posición estimada de SOX2 (fs) se indica mediante una punta de flecha. (E) Análisis de transferencia Western de sondeo para la bandera-Sox2 para verificar la inmunoprecipitación usando M2-cuentas.
Para aislar (fs) Sox2 y sus complejos de proteínas asociadas a partir de células i-Sox2-DAOY, (fs) se indujo la expresión de Sox2 durante 24 horas (0,1 mg /ml dOX), y (fs) complejos de proteínas SOX2 se aislaron a partir de extractos de proteínas nucleares por inmunoprecipitación usando M2-perlas (Fig. 1B). Como control, se prepararon extractos nucleares a partir de células i-SOX2-DAOY sin exposición a Dox (muestras no inducidas). Después de la inducción con Dox, el nivel de SOX2 (fs), que migra ligeramente más lento que SOX2, se encontró que era ~ 2,5 veces mayor que la de SOX2 endógeno (Fig. 1C). Sin embargo, si la expresión de Sox2 exógena reduce la expresión de Sox2 endógeno como lo hace en ESC [11], los niveles totales de SOX2 en las células tratadas-Dox era de menos de 2,5 veces mayor que el de las células DAOY no tratados. Es importante destacar que el análisis de tinción de plata de los eluidos inmunoprecipitadas demostró un significativo enriquecimiento de las proteínas aisladas cuando (fs) Sox2 fue inducida (Fig. 1D). Como se esperaba, (fs) SOX2 se pudo detectar fácilmente por análisis de transferencia Western en el inducido, pero no en los eluatos no inducidos (Fig. 1E). La banda prominente observada a ~ 45 kDa (Fig. 1D) es un contaminante común cuando se utilizan M2-cuentas para la inmunoprecipitación [9], [11].
Para identificar proteínas que se asocian con Sox2 en i-Sox2 células -DAOY, complejos SOX2-proteína a partir de células i-SOX2-DAOY no inducidos e inducidos se sometieron a análisis MudPIT. Para ayudar a minimizar la variación experimental y para el análisis estadístico, el análisis MudPIT se realizó en tres pares independientes de muestras. La tasa de falso descubrimiento espectral de nuestras pantallas proteómicos eran 0,27% ± 0,16 y 0,37 ± 0,08% para las muestras no inducidas e inducidas, respectivamente, como se determina por el método de Elias et al [26]. Las proteínas identificadas como proteínas SOX2 asociada se agruparon en tres categorías principales en un esfuerzo para reducir al mínimo la exclusión de SOX2 asociada a las proteínas de buena fe: 1) las proteínas identificadas sólo en nuestras muestras inducidas en tres MudPIT análisis con el más estricto significado POR ajustados p & lt; 0,05 (Fig. 2A, la Tabla suplementaria S1); 2) las proteínas identificadas sólo en muestras inducidas en tres MudPIT análisis sin importancia ajustado-BY (p & gt; 0,05), pero con una significación de la prueba t (p & lt; 0,05) (Figura 2B, Tabla suplementaria S2).; y 3) las proteínas que se enriquecieron en la muestra inducida por más de 6 veces (Fig. 2C, Tabla suplementario S3). Categorías 1 y 2 fueron de 156 y 39 proteínas, respectivamente. Todas las proteínas de la categoría 1 se reunieron el requisito estadístico utilizado para la categoría 2. Juntos, con la categoría 3, que incluye 88 proteínas, un total de 283 proteínas asociadas a SOX2 fueron identificados cuando se combinaron las tres categorías.
(A ) las proteínas que se identificaron en los tres eluidos M2-talón inducidos, pero no se identificaron en las muestras no inducidas, como proteínas asociadas a SOX2 por análisis MudPIT, que eran estadísticamente significativas según el método ajustado-BY (p & lt; 0,05). valores NSAF de las tres réplicas se promedian y las barras de error representan la desviación estándar. La trama se divide en dos; los 'Valores promedio NSAF' de la mitad izquierda ascienda de izquierda a derecha, y los "Valores promedio NSAF 'de la derecha ascienda mitad derecha a izquierda. (B) Las proteínas identificadas en 3 de 3, Dox-inducida, pero no en, repeticiones DAOY MudPIT no inducidas que fueron estadísticamente significativas según la prueba t de Student (p & lt; 0,05), pero no fueron significativas según el BY-ajuste ( p & gt; 0,05). (C) Las proteínas que se identificaron en los tres inducida, pero al menos una muestra no inducida MudPIT, están trazadas en función de plegar el enriquecimiento (valores NSAF) en muestras inducidas-Dox en comparación con los no inducido. Sólo las proteínas con valores de enriquecimiento & gt; 6 veces fueron incluidos. Las proteínas que aparecen con una barra de negro tenían valores de enriquecimiento que fueron estadísticamente significativas según el BY-ajuste (p & lt; 0,05). Las proteínas representan con barras grises fueron estadísticamente significativas según la prueba t de Student (p & lt; 0,05), pero no significativo de acuerdo con la A-ajuste (p & gt; 0,05).
Para entender mejor lo biológico funciones de las proteínas asociadas a SOX2, se realizó la clasificación de genes ontología con base de datos para la visualización de anotación integrada Discovery (DAVID). Teniendo en cuenta la ubicación y función de SOX2 nuclear, no es sorprendente que la transcripción es una de las categorías funcionales más grandes (Fig. 3). Sin embargo, las proteínas SOX2 asociada se han relacionado con muchos otros procesos celulares. Esto es similar a la conclusión de que las proteínas asociadas-Sox2 en ESC ratón y en el ratón ESC se someten a diferenciación están involucrados en una amplia gama de funciones [9], [11]. En estos contextos celulares, un porcentaje similar de proteínas SOX2 asociada participó en las categorías de procesamiento del ARN (6% a 9%) y el desarrollo (10% a 11%). Sin embargo, hay varias diferencias notables. El porcentaje de proteínas asociadas a SOX2 que entran en la categoría de reparación del ADN representaba un 11% en CES experimentar diferenciación [9], pero sólo el 1% de las células DAOY. La clasificación para cada proteína Sox2-asociado se proporciona en la Tabla S5 suplementario.
Se realizó un análisis de ontología de genes de las proteínas asociadas a SOX2 identificados en las células DAOY MB utilizando la base de datos para anotación, y Visualización Integrada Discovery (DAVID). descripciones ontología específicos para proteínas SOX2 asociada se agruparon en 14 categorías amplias.
MudPIT es un método altamente sensible que es capaz de detectar proteínas en las muestras que no se detectan fácilmente por análisis de transferencia Western. Por esta razón, hemos utilizado un enfoque bioquímico más tradicional y proteínas seleccionadas con valores modestos NSAF para validar nuestra identificación de las proteínas asociadas a SOX2. En concreto, MSI2, una proteína que se encuentra sólo en nuestras muestras inducidas (Fig. 2A), y USP7, enriquecidos ~ 20 veces (Fig. 2C), fueron confirmados a asociarse con Sox2 través de la co-inmunoprecipitación utilizando extractos nucleares preparados a partir de células DAOY ( suplementario Fig. S1A). También se determinó que Sox2 es capaz de asociarse con MSI2 y USP7 en otros contextos celulares. En este sentido, MSI2 y USP7 fueron identificados como proteínas SOX2 asociada en una sola pantalla proteómico de las proteínas asociadas a SOX2 en células U87 GB (Wilder y Rizzino, resultados no publicados). Además, se determinó que ectópica expresó asociados Bandera-SOX2 con endógena USP7 encuentran en las células HEK293T (suplementario Fig. S1B). También confirmó que ectópica expresó Bandera-MSI2 co-inmunoprecipitados expresan ectópica de Sox2 en células HEK293T (Supplemental Fig. S1C).
Integración de Sox2 proteína interactomes revela una serie de proteínas que asocian comunes
Además de la pantalla proteómico SOX2 llevado a cabo en células DAOY, hemos llevado a cabo recientemente análisis MudPIT para identificar proteínas SOX2 asociada en varios otros contextos celulares, incluyendo indiferenciada ESC [11] y ESC experimentar diferenciación [9]. Es importante destacar que las tres SOX2-interactomes identificados se determinaron utilizando los mismos métodos para el aislamiento de proteínas y análisis proteómico, y una tasa de falso descubrimiento similar espectral (& lt; 0,4%) se determinó en cada contexto independiente [9], [11]. En cada caso, la bandera de epítopo etiquetado SOX2 y sus proteínas asociadas fueron aislados utilizando M2-cuentas a partir de extractos nucleares preparados por homogeneización Dounce, seguido de análisis MudPIT utilizando la misma plataforma proteómica. Por lo tanto, se compararon SOX2-interactomes identificados en cada uno de estos contextos celulares (suplementario. Fig 2, complementario S6 Tabla), porque las proteínas que se asocian con SOX2 en múltiples contextos celulares son también propensos a jugar un papel esencial en el comportamiento de las células tumorales del cerebro. En este sentido, las células humanas y de ratón MB ESC tenía varias proteínas SOX2 asociada en común, a pesar de diferencias dramáticas en contexto celular. De 283 proteínas identificadas en el SOX2-interactome en las células MB DAOY, 19 asociado con SOX2 en al menos otro contexto celular, incluyendo MSI2 y USP9X, y dos asociado con SOX2 en los tres contextos celulares (suplementario. Fig S4, Tabla suplementaria S6 ). Recientemente, hemos demostrado que Msi2 es necesario para la auto-renovación y pluripotencia de ESC de ratón [14] y, más recientemente, se ha determinado que desmontables de Usp9x en el ratón CES aumenta sustancialmente la diferenciación de ESC (resultados no publicados). Además, MSI2 y USP9X se han implicado en otros tipos de cáncer [16] - [21], pero su papel en los tumores cerebrales no se han examinado. Por lo tanto, hemos ampliado nuestro análisis de las proteínas asociadas a SOX2 determinando si la disminución de MSI2 y USP9X expresión influye en el comportamiento de las células tumorales del cerebro.
Musashi-2 es necesaria para la proliferación de las células cancerosas del cerebro
informes anteriores demostraron que MSI2 es esencial para la progresión de la LMC [16] - [18], y la caída de otro miembro de la familia, Musashi-1 (MSI1), altera la viabilidad de las células DAOY MB y células GB [28], [29]. Para determinar si MSI2 es necesaria para la proliferación de células MB DAOY, construcciones shRNA se utilizaron para derribar endógena MSI2. En concreto, los lentivirus que se utilizaron constitutivamente expresa ARNhc contra MSI2 para infectar células MB DAOY. Dos construcciones shRNA independientes se utilizaron para desmontables MSI2, y se usó un shRNA no específica previamente caracterizado (codificado) como un control [15], [23]. Después de la selección de las células infectadas con puromicina, análisis de transferencia Western demostró que MSI2 isoformas 1 y 2 fueron sustancialmente derribado (Fig. 4A). Esta reducción en MSI2 se verificó en los niveles de ARN por RT-qPCR (Supplemental Fig. S3 A). Además, en comparación con el crecimiento de células DAOY infectadas con los vectores lentivirales de ARNhc revueltos, se observó una gran reducción en el crecimiento cuando las células se infectaron con MSI2 shRNA vectores lentivirales (Fig. 4B). Por otra parte, las microfotografías tomadas de 7 días después de la infección demostraron que las células en las que MSI2 había sido derribado eran más plano y más grande, que recuerda a las células post-mitóticas, en comparación con el control mezclado (Fig. 4C).
(A ) Western blot de los niveles MSI2 en su conjunto de células DAOY extractos de 96 horas después de la infección con huevos revueltos o lentivirus shRNA MSI2. Se detectaron dos isoformas: isoforma 1 (MSI2-1) y la isoforma 2 (MSI2-2). GAPDH se sondeó como control de carga. niveles MSI2 se cuantifican, con los niveles encontrados en el control revueltos establece en 1,00. (B) El crecimiento celular se examinó por triplicado mediante el ensayo de MTT 6 días después de haber sido chapada a 10
4 células por pocillo de una placa de 12 pocillos. Los datos mostrados son medias relativas al control Scramble. Las barras de error representan la desviación estándar. Los valores de p se determinaron mediante test t de Student y se encontró que & lt; 0,01 para ambos MSI2 shRNA 1 y 2. (C) Las microfotografías de células DAOY MB después de la infección, ya sea con no específica (codificado) o MSI2 focalización (Nº 1 , N ° 2) lentivirus shRNA. Las células se infectaron en el Día 0, seleccionado usando el medio suplementado con puromicina en el Día 1 y volvieron a alimentar medio fresco en el Día 2. Las células se fotografiaron en el día 7 después de la infección. (D) Western blot de extractos de adormecimiento en DAOY MB utilizado en la figura 4A.
En la actualidad, se sabe relativamente poco acerca de las funciones de MSI2, pero en modelo murino de la leucemia se cree que Down- regular la proteína Numb [16], que se ha demostrado que regulan tanto Notch y Wnt de señalización [30], [31]. Por lo tanto, hemos examinado si la caída de MSI2 en las células DAOY influye en la expresión de NUMB. Se determinó que la caída de MSI2 con ARNhc lentiviral vectores#1 y#2 provocado un aumento en los niveles de proteína de NUMB (Fig. 4D). Por lo tanto, desmontables de MSI2 provoca tanto una gran reducción en el crecimiento de células tumorales DAOY MB y aumenta la expresión de NUMB.
También se examinaron las consecuencias de derribar MSI2 en las células tumorales GB, debido MSI2 se identificó también como una proteína asociada a Sox2 en células U87 GB (Wilder y Rizzino, resultados no publicados). Para este propósito, inicialmente infectados células tumorales GB U87 con los mismos vectores lentivirales MSI2 shRNA descritos anteriormente. Una vez más, un shRNA revueltos se utilizó como control. Tres días después de la infección con los vectores lentivirales, análisis de transferencia de Western determinó que MSI2 isoforma 1 y isoforma 2 fueron ambos sustancialmente reducida (Fig. 5A) y la reducción en MSI2 se verificó en los niveles de ARN por RT-qPCR (suplementario. Fig S3B) . Como en el caso de las células DAOY, las células GB U87 infectadas con construcciones MSI2 shRNA mostraron una marcada disminución en la proliferación celular (Fig. 5B) y un aumento significativo en el tamaño celular (Fig. 5C). Para ampliar estos resultados, las células U118 GB fueron infectadas con lentivirus shRNA MSI2. De manera similar a las células DAOY y U87, desmontables de MSI2 en células U118 resultó en una disminución de la proteína MSI2 y ARN, una gran reducción en el crecimiento celular, y un aumento significativo en el tamaño celular (suplementario. Fig S4 y la Fig. S3C). En conjunto, nuestros datos indican que MSI2 se requiere para mantener la supervivencia de las células DAOY MB, y la capacidad proliferativa de las células U87 y U118 GB.
(A) análisis de transferencia de Western de los niveles de MSI2 en U87 nuclear extractos 96 horas después de la infección por lentivirus revueltos o MSI2 shRNA. niveles MSI2 se cuantifican, con los niveles encontrados en el control revueltos establece en 1,00. (B) El crecimiento celular se examinó por triplicado mediante el ensayo de MTT 5 días después de haber sido chapada a 1,5 × 10
4 células por pocillo de una placa de 12 pocillos. Los datos mostrados son medias relativas al control Scramble. Las barras de error representan la desviación estándar. Los valores de p se determinaron mediante test t de Student y se encontró que & lt; 0,01 para ambos MSI2 shRNA 1 y 2. (C) Las microfotografías de células U87 GB después de la infección, ya sea con no específica (codificado) o MSI2 focalización (Nº 1 , N ° 2) lentivirus shRNA. Las células fueron infectadas en el día 0, seleccionado con el medio suplementado con puromicina el día 1 y volvieron a alimentar medio fresco en el día 3. Las células fueron fotografiados en el día 6 después de la infección.
Desmontables de USP9X reduce la viabilidad de cerebro las células cancerosas
también se examinó si se requiere USP9X para la supervivencia de células de cáncer de cerebro. Con este fin, hemos utilizado shRNA mediada desmontables de USP9X. Más específicamente, los lentivirus tres independientes se utilizan para entregar constitutivamente activa shRNA construye contra las transcripciones USP9X en células DAOY MB. Al igual que con nuestros estudios desmontables-MSI2, revueltos shRNA se utilizó como control. Desmontables de USP9X se confirmó mediante análisis de transferencia de Western de ambos extractos nucleares y citoplasmáticos (Fig. 6A) y comprobó en los niveles de ARN por RT-qPCR (suplementario Fig. S5A). Aunque no hubo efectos mínimos de derribar USP9X durante los tres primeros días de cultivo, se observó una gran reducción en el número de células que podrían volver a adjuntar (datos no mostrados). Por otra parte, las pocas células de la población caída USP9X que reatadas después del subcultivo exhibió poca o ninguna proliferación (Fig. 6, B y C). Además, se examinó si la caída de USP9X afecta a la expresión de varios de sus objetivos conocidos en las células DAOY. USP9X se ha informado que deubiquitinate un gran número de proteínas, incluyendo MCL1 y β-catenina [19], [32] - [35]. Sin embargo, desmontables de USP9X no parece alterar la expresión de MCL1 o β-catenina en los compartimentos nucleares o citoplasmáticos (Fig. 6D).
(A) análisis de transferencia Western para verificar la caída de USP9X en DAOY células MB después de la infección con lentivirus para introducir shRNA constitutivamente activa contra transcripciones USP9X. fracciones de proteínas nucleares y citoplasmáticas se prepararon 4 días después de la infección de células con lentivirus. niveles USP9X se cuantifican y niveles en el control revueltos se establecen en 1,00. (B) El crecimiento celular se examinó por triplicado mediante el ensayo de MTT 6 días después de haber sido chapada a 10
4 células por pocillo de una placa de 12 pocillos. Los datos mostrados son medias relativas al control Scramble. Las barras de error representan la desviación estándar. Los valores de p se determinaron mediante test t de Student y se encontró que & lt; 0,01 para ambos USP9X shRNA 1, 2 y 3. (C) Las microfotografías de células DAOY MB siguientes desmontables de USP9X utilizando lentiviral entrega shRNA construye contra las transcripciones USP9X. En el día 0, las células fueron infectadas con lentivirus USP9X shRNA. A partir del día 1, se seleccionaron las células infectadas usando puromicina durante 48 horas.