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PLOS ONE: El descubrimiento de nuevos genes en el cáncer de próstata hypermethylated el kit Genomic CpG Island Microarrays


Extracto

Antecedentes

Promotor y "regulación metilación 5 fin de genes supresores de tumores es una característica común de muchos tipos de cáncer. Este tipo de situaciones a menudo conducen a la silenciamiento de estos genes clave y por lo tanto pueden contribuir al desarrollo de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata.

Metodología /Principales conclusiones

Con el fin de identificar los cambios en la metilación de próstata cáncer, se realizó un análisis de todo el genoma de la metilación del ADN utilizando Agilent arrays humanos isla CpG. Uso de validación computacional y de genes específicos de enfoques que hemos identificado un gran número de potenciales biomarcadores epigenéticos de cáncer de próstata. Además validación de genes candidatos en una cohorte independiente de los cánceres de próstata de bajo y alto grado por el análisis cuantitativo MethyLight ha permitido confirmar la hipermetilación del ADN de
HOXD3
y
BMP-7
, dos genes que pueden desempeñar un papel en el desarrollo de tumores de alto grado. También se muestra que la hipermetilación del promotor es responsable de la expresión regulados a la baja de estos genes en la línea de células DU-145 del CP.

Conclusiones /Importancia

Este estudio identifica nuevos biomarcadores epigenéticos de cáncer de próstata y el cáncer de próstata progresión, y proporciona una evaluación global de la metilación del ADN en el cáncer de próstata

Visto:. Kron K, Pethe V, L Briollais, Sadikovic B, H Ozcelik, Sunderji a, et al. (2009) El descubrimiento de nuevos genes en el cáncer de próstata hypermethylated el kit Genomic CpG Island microarrays. PLoS ONE 4 (3): e4830. doi: 10.1371 /journal.pone.0004830

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América

Recibido: 24 Noviembre 2008; Aceptado: February 17, 2009; Publicado: 13 Marzo 2009

Derechos de Autor © 2008 Kron et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Próstata canadiense Iniciativa de Investigación del cáncer, Instituto Nacional del cáncer de Canadá (# 18568). Fondo Ontario Student Opportunity Trust, Scace cáncer de próstata Fellowship. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda causa principal de cáncer asociado con muertes en el [1] de Estados Unidos. Los estudios han demostrado que la PCa es una enfermedad compleja impactado por factores epidemiológicos genéticos y no genéticos, y el diagnóstico precoz es crítica en el manejo clínico de la enfermedad. Una variable patológica común da durante del tumor de próstata, con una puntuación más alta que reflejan carcinoma pobremente diferenciado. puntuación de Gleason ≤ 6 se consideran carcinomas de bajo grado, Gleason 7 es de nivel medio, y aquellos con una puntuación de Gleason 8 y superior son considerados como de alto grado (para una revisión reciente sobre el sistema de clasificación, véase [3]).

epigenética modificaciones han sido demostrado que afectan a los patrones de expresión de genes y, a menudo contribuir a la patogénesis de muchos tipos de cáncer [4]. Ejemplos de modificaciones de las histonas epigenéticos incluyen la metilación de residuos de lisina específicos, acetilación /desacetilación de restos de lisina, y la fosforilación de la histona colas, cada una con diferentes efectos sobre la regulación de la transcripción de genes. Estas modificaciones inducen patrones de expresión de genes anormales y por lo tanto se considera que contribuyen al desarrollo del cáncer [5], [6]. Dinucleótido CpG metilación aberrante es una característica bien reconocida epigenética de muchos tipos de cáncer. hipometilación genómica Global se encuentra en combinación con regiones localizadas de hipermetilación, típicamente en islas CpG que ocurren comúnmente en los promotores o regiones 5 'de las secuencias de genes [7]. la hipermetilación del promotor actúa junto con modificaciones específicas de las histonas para silenciar genes por inhibición directa del factor de transcripción biding [8], a través de unión de las proteínas de dominio de unión a metil CpG [9], o por medio de interacciones con las histonas modificación de enzimas [10]. Este mecanismo epigenético puede conferir una ventaja de crecimiento a las células cancerosas mediante la hipermetilación de los genes supresores de tumores. En consecuencia, los eventos de metilación del ADN pueden servir como biomarcadores útiles [11], lo que impulsó la búsqueda de los dos indicadores de diagnóstico y pronóstico.

isla CpG hipermetilación en el CaP es un evento común con más de 30 loci hypermethylated actualmente identificadas [12]. La mejor caracterizada de estos eventos,
GSTP1
la metilación del promotor, se produce en & gt; 90% de los cánceres y el 70% de la neoplasia intraepitelial prostática lesiones precursoras de alto grado (PIN) [13], [14] y puede ser también detectado en muestras de sangre y orina [15]. Por lo tanto,
GSTP1
metilación puede servir como un marcador de diagnóstico útil para CaP. Recientemente, se ha hecho un progreso sustancial en la proyección epigenómico de alto rendimiento para la identificación de nuevas dianas de la metilación del ADN [16]. Posteriormente, otros genes hypermethylated bien caracterizados se han identificado en el CaP incluyendo
RASSF1A
,
CDH1
, y
CDKN2A
, para nombrar unos pocos. Sin embargo, ningún gen estudiado hasta la fecha ha sido identificado como un biomarcador /pronóstico de diagnóstico específico en el CP similar a
GSTP1
[17], [18].

En este estudio, hemos tratado de analizar metilación en una escala amplia del genoma utilizando microarrays isla CpG humanos para descubrir nuevos methylatled loci dentro de cáncer de próstata. Entre un panel de la novela y /o loci diferencialmente metilado que hemos identificado, que más caracteriza
HOXD3
y
BMP-7
usando una combinación de análisis MassARRAY® EpiTYPER y el ensayo MethyLight cuantitativa, y se evaluó la expresión de células DU-145 de PCA.

Métodos

muestras de pacientes

20 muestras de tejido fresco congelado (CaP 10 Gleason 6 o pura patrón 3 (PP3), y 10 puntuación de Gleason 8 o pura patrón 4 (PP4)) obtenida a partir de piezas de prostatectomía de pacientes con cáncer de próstata diagnosticados entre 2001 y 2007 se recogieron desde el banco de tejidos en la Red Universitaria de Salud (UHN), Toronto. Los pacientes que tenían tratamiento previo a la cirugía fueron excluidos. Otra serie de muestras consistentes en 39 muestras, fijado en formol e incluidos en parafina (FFPE) PCA (20 PP3 y PP4 19) de los pacientes diagnosticados entre 2006 y 2008 se recogieron de manera similar para el conjunto de validación. Todos los pacientes dieron su consentimiento a la donación de tejido extirpado al banco de tejidos UHN y se obtuvieron muestras de acuerdo a los protocolos aprobados por el Consejo de Ética de Investigación del Hospital Mount Sinaí (MSH) y UHN, Toronto, ON, Canadá. especímenes CaP se sometieron a examen histológico por un patólogo experto (TVDK) para la confirmación independiente de los grados de Gleason.

Líneas celulares y el ADN de extracción

líneas celulares de CaP humano LNCaP (ATCC#1740 CRL- ), DU-145 (ATCC#HTB-81), PC-3 (ATCC#59500) y 22Rv1 (ATCC#CRL- 2505) se obtuvieron de los Dres. M. Zielinska, R. Bristow, y E. Diamandis. Todas las células fueron cultivadas como monocapas en medio RPMI 1640 (Life Technologies), y complementado con suero bovino fetal al 10%. Todas las líneas celulares se cultivaron en atmósfera humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C. Se extrajo el ADN después de recoger las células por tripsinización, seguido de la extracción de ADN usando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen Inc, Mississauga, ON, Canadá), utilizando el protocolo recomendado por el proveedor.

-deoxycitidine 5-Aza 2 ' (DAC) de tratamiento y RT-PCR

250 mg /ml de solución madre 5- aza-2 deoxycitidine (DAC) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá) se preparó en agua y se mantiene a -80 ° C hasta su uso. DU-145 células se sembraron en placas de 6 cm y se incubaron en medio de cultivo con 2 g DAC /ml durante 4 días con cambio de medio cada 2 días. Las células se recogieron y el ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), utilizando el protocolo recomendado por el proveedor
.
Las secuencias de cebador para RT-PCR de
BMP7
y
HOXD3
se han descrito anteriormente [19], [20] y son los siguientes: (
BMP-7
adelante) 5'-ACG AGA TCA CAC CCA AGT-3 ', (
BMP-7
inverso) 5'-CTA CTC AGG CCC CAG CTT-3 '; (
HOXD3
adelante) 5'-AGG ATC CTG GTC TGA ACT CAG AGC AGC AGC3 ', (
HOXD3
inverso) 5'-ACT CGA GTT CAT CCG CCG GTT CTG GAA CCA-3 '.

aislamiento de ADN

tejido archivado fresco congelado fue snap-congelado en nitrógeno líquido, se trituró, y se aisló el ADN genómico utilizando el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del kit. Se seccionó el tejido FFPE (7 micras) y se secó al aire sobre portaobjetos. Las zonas con distinto grado de Gleason en H & amp; E manchadas diapositivas con al menos el 80% o que se marcaron las células neoplásicas más y las áreas correspondientes fueron identificados en las secciones FFPE para recoger células. muestras separadas con diagnóstico histológico de tejido normal fueron marcados también. Las poblaciones de células enriquecidas a partir de las áreas destacadas fueron entonces microdissected manualmente y se aisló el ADN genómico utilizando el QIAamp DNA mini kit usando un protocolo modificado con proteinasa K digestión prolongada. Brevemente, el tejido microdissected se digirió en 30 l de proteinasa K a 56 ° C durante la noche, seguido de una adición de 20 l de proteinasa K y la digestión durante una hora a 56 ° C el día siguiente. El Qiagen protocolo recomendado para el tejido FFPE fue seguida a continuación.

La hibridación de metilación diferencial (DMH) y CpG Island Humanos Microarrays

La técnica de hibridación diferencial de metilación para la preparación de los amplificados metilados se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente [21]. Brevemente, el ADN genómico (0,2 g) a partir de los casos PP3 y PP4 se digirió con
Mse
I. Los extremos escindidos se ligan con recocidos H-12 /H-24 enlazadores, seguido de una digestión adicional con dos rondas sucesivas de la digestión con enzimas sensibles a la metilación, es decir,
Hpa II y

Bst
IU . a continuación, las reacciones Enlazador de PCR se realizaron con DNA pre-tratada para generar los amplicones finales de destino para la hibridación de microarrays. amplicones finales se purificaron usando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La muestra de referencia consistía en ADN aislado de linfocitos de seis hombres sanos con pacientes con CaP de la misma edad. Las muestras de referencia se trataron de manera similar para la generación de destino final y fueron co-hibridada amplicones agrupados a los casos de prueba para las matrices individuales.

Análisis de Datos

Todos los microarrays de datos generados es compatible con los estándares actuales de acuerdo con MIAME Brazma
et al
[22].

los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico
limma Red de
R
[23]. El principio consiste en ajustar un modelo lineal para cada sonda en el registro
2 cociente de la intensidad del canal rojo y la intensidad del canal verde es retrocedido en una variable indicadora del tumor (I). Se realizó tres comparaciones: Modelo Pure 3, Gleason 6 (PP3) (i = 1) vs. Referencia (I = 0), Pattern Pure 4, Gleason 8 (PP4) (I = 1) vs. Referencia (I = 0) y PP4 (I = 1) vs. PP3 (I = 0), para encontrar genes que tienen diferentes perfiles de metilación a través de los dos grupos de comparación. Estas comparaciones son análogos a un clásico de dos muestras
t-test
análisis. Como alternativa, también se utiliza una Bayes empírica
t-test
. Esto tiene la misma interpretación que un ordinario
t-estadística
excepto que los errores estándar se han moderado través de los genes (encogido hacia un valor común) mediante un modelo bayesiano simple. Esto tiene el efecto de tomar prestado información del conjunto de genes para hacer la inferencia sobre cada gen individual más robusto. El moderado
t-estadística
tiene un mayor número de grados de libertad en comparación con el ordinario
t-estadística
, reflejando la mayor fiabilidad asociado con el error estándar de alisado. Nuestros análisis se llevaron a cabo después de la pre-procesamiento de los datos. En el primer caso, se utilizó un método de corrección de fondo proporcionada por Agilent. En el segundo caso, se utilizó un método implantado en
limma
. Una convolución de las distribuciones normales y exponencial se ajusta a las intensidades de primer plano usando las intensidades de fondo como covariable, y la señal de esperar dado el primer plano observado se convierte en la intensidad corregida. Esto resulta en una transformación monotónica lisa del fondo se restan las intensidades de tal manera que todas las intensidades corregidas son positivos. Ambos métodos tuvieron un buen desempeño en nuestros datos. A continuación se aplica un procedimiento de loess normalización dentro de matrices para eliminar cualquier tendencia sistemáticas que surgen de la tecnología de microarrays de las medidas de metilación [24].

Análisis de Datos e Integración Partek

Los datos de extracción de características de Agilent software .txt fueron analizados utilizando el paquete de software de Genómica Partek (PGS) usando una modificación de los protocolos descritos anteriormente [25], [26]. Los datos sobre I procesado y columna G desde 10 PP3 y PP4 10 se importaron en PGS. La señal R procesado correspondía al ADN del tumor y la señal procesada G correspondía al ADN de linfocitos normal. La señal específica del cáncer en todas las sondas se normalizó como una relación con el valor inicial usando Normalizar a la herramienta de línea de base en PGS, donde los datos de referencia se corresponden con el ADN de linfocitos humanos normales. a continuación, los datos se ingrese
2 transformado mediante el PGS Normalización y Herramienta de escalado.

A continuación se utilizó Tal conjunto de datos normalizado y transformado para la detección de perfiles de metilación específicos de cáncer, y en segundo lugar para diferenciar entre PP4 y PP3-específica los perfiles de metilación. Con el fin de detectar significativa específica del cáncer de enriquecimiento /agotamiento, se realizó un modelo oculto de Markov (HMM) de detección de la región a través de aproximadamente 244.000 sondas con los siguientes parámetros: sondas mínimas: 5, estados de detección: -2 & Amp; 2; ignorar el estado: 0, la probabilidad máxima: 0,95, decaimiento genómico: 10.000, Sigma: 1. Tales regiones genómicas detectadas fueron anotados en los correspondientes genes utilizando la herramienta de anotación de genes con Affymetrix PGS HuGene-1_0-st-v1.na24.hg18.transcript archivo .csv. Además de los genes se solapan directamente, genes proximales (arriba y aguas abajo 1000 nucleótidos) a las regiones enriquecidas /empobrecido también fueron anotados.

diferencias significativas en el enriquecimiento entre PP3 y PP4 tumores se identificaron mediante el cálculo de la diferencia media de plegado entre el PP3 y PP4 señal normalizada en todas las sondas utilizando la herramienta de PGS ANOVA, y la posterior detección región HMM y anotación de genes usando los parámetros antes mencionados. Tales regiones genómicas se filtraron adicionalmente para incluir secuencias con un mínimo de 1,3 veces el enriquecimiento y agotamiento mínima -1.3 veces. La visualización de datos utilizando mapas de calor, archivos .wig para UCSC Genome Browser, archivos de vista del genoma, y ​​tablas de datos correspondientes /listas se llevó a cabo con una DGP como se describe anteriormente [25], [26]. Análisis FODA
MassARRAY EpiTYPER

el análisis cuantitativo de metilación CpG dinucleotide se realizó utilizando un enfoque de espectrometría de masas como disponible mediante el análisis MassARRAY® EpiTYPER (Sequenom). análisis EpiTYPER es un método basado espectrometría de masas MALDI TOF que proporciona una vista cuantitativo de metilación CpG dinucleotide de la resolución dinucleótido única o múltiple. ADN es primero bisulfito modificado, marcado con un promotor T7, y transcribe en ARN. Esto entonces se escinde con RNasa A y productos de escisión de masa diferente se puede resolver por el instrumento MS. El análisis fue realizado por el Centro de Genética Analytical Technology (AGTC), Princess Margaret Hospital, Toronto, ON, según las instrucciones del fabricante usando un subconjunto de ADN de tejido fresco congelado que se utilizó para el análisis de microarrays de la isla CpG. Regiones analizadas por EpiTYPER correspondían a los que mostraron una señal enriquecido en los resultados de la matriz isla CpG. Todos los análisis se realizaron por triplicado y las medias y los errores estándar se calcularon.

Modificación de bisulfito de sodio y MethyLight

modificación con bisulfito de sodio de ADN genómico se realizó utilizando el kit de ADN EZ La metilación del oro (Zymo Investigación Corp, Orange, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando 0,8 g de ADN de tejido incrustado en parafina.

los niveles de metilación de los dos genes de interés se determinaron por metilación Cuantitativo PCR específica (MSP), el MethyLight ensayo, como se describe anteriormente [27]. Los cebadores y sondas fueron diseñados específicamente para el ADN de bisulfito convertido, metilado y son los siguientes: (
BMP-7
adelante) 5'-CGT TTT TTT GGT TCG GAT, (
BMP-7
sonda CGC-3 ' ) 6FAM-5'-GTG TCG AGA GGG CGG TAG GGT TTT CG-3'-BHQ1, (
BMP-7
inverso) 5'-CTA AAA AAC AAC GAA ACG TCG CG-3 '; (
HOXD3
adelante) 5'-GTT TTG GTA TTT TTT CGG GTT ATC G-3 ', (
HOXD3
sonda) 6FAM-5'-AAG TGG AGC GTT GGG GGG AGG GC- 3'-BHQ1, (
HOXD3
inverso) 5'-TAA AAC TCC TAA CTT CGC TCG ACG-3 '; (
Alu
adelante) 5'-GGT TGG TAG TAG GTA TTT TTT ATA GTA GTA ATT TTA-3, (
Alu
sonda) 6FAM-5'-CCT ACC ACC TTA TCC C- 3'-MGBNFQ, (
Alu
inverso) 5'-ATT AAC TAA AAT ACT CTT CTC CTA AAA ACC TCA-3 '. Todas las reacciones se realizaron en el Applied Biosystems 7500 instrumento PCR en tiempo real. Las curvas de calibración se generaron utilizando diluciones seriadas de ADN supermethylated control positivo para el gen de interés y
Alu
repite. relación metilado por ciento (PMR) de un gen se calculó utilizando
Alu
repite como referencia la siguiente manera: (gen /
Alu proporción cuantitativa
fluorescencia de ADN de muestras modificado) /(gen /
Alu relación Opiniones de ADN supermethylated) X 100%. Una puntuación positiva para la metilación fue dado si PMR para un determinado tumor fue ≥10%.

Resultados

Análisis de metilación genómica

Nos separaba el análisis de nuestros datos de microarrays en dos subconjuntos. El primer subconjunto consistió en los 20 especímenes de cáncer en comparación con los de referencia de ADN. Una lista de los genes que se identificaron como hypermethylated significativamente en los métodos estadísticos realizados para el cáncer en comparación con el conjunto de datos de referencia (PP3 & amp; PP4 en comparación con ADN de referencia) se representa en la Tabla 1. Curiosamente, 27 de los 100 genes metilados (clasificadas por pliegue individual de cada sondeo cambio) del conjunto de datos de cáncer /referencia son homeobox o T-box genes (Tabla 2), en consonancia con la literatura actual patrones de análisis de metilación en otros tipos de cáncer, incluyendo los de pulmón, de mama y de colon [28], [29], [30 ]. También encontramos & gt; 2 veces en la señal de genes previamente identificados como metilado en el cáncer de próstata como
CDKN2A gratis (media de 15,8 veces enriquecimiento),
RUNX3 gratis (2,8 veces), y
PTGS2 gratis (2,9 veces). El gen que muestra el mayor grado de metilación era
FOXC1
con una media veces el cambio de 60,9 en comparación con el ADN de referencia. El uso de PGS, que restringieron el análisis de múltiples sondas que muestra el enriquecimiento, el mayor grado de metilación en un gen caracterizado fue
HOXD9 gratis (3,2 veces el cambio a través de 8 sondas).

el segundo subconjunto de datos se compararon los diez casos PP3 a los casos 10 PP4, lo que hemos denominado el conjunto de datos progresión. Usando una diferencia de señal de enriquecimiento promedio de 2 veces entre los dos patrones como una línea de corte, descubrimos un conjunto de 493 gama de sondas que son capaces de distinguir entre PP3 y PP4 cánceres. luego filtrados múltiples sondas que representan el mismo gen y sondas que representan lugares no caracterizados, dando una lista final de los 223 genes individuales. Una sonda específica que representa el dominio CAP-GLY que contiene familia de proteínas enlazador, miembro 4 (
clip4
) mostró la mayor diferencia veces entre los dos patrones (6,5). Con una DGP para el análisis estadístico, anterior ventral homeobox 1 (
VAX1
) muestran la mayor diferencia media veces (2.7) a través de múltiples sondas (6 en total). Una visión representativa de los genes a partir del análisis de PGS se da en la Tabla 1. Al igual que en el conjunto de datos de cáncer /de referencia, 23 de los 100 genes clasificados por el cambio de sonda veces a partir del conjunto de datos progresión son genes homeobox (Tabla 2).

a continuación seleccionaron dos genes de estas listas para su posterior análisis usando una combinación de técnicas basadas en la metilación y de expresión. Los criterios de selección incluyen la función biológica del gen, participación en /contribución al cáncer de próstata, y la significación estadística de los resultados de microarrays CpG

Gene análisis específico de metilación

Los genes elegidos para el análisis fueron:.


BMP-7
[proteína ósea morfogénica] (cromosoma 8p21 #), un gen ya implicados en la progresión del CaP [31], que se había informado anteriormente como metilado en una línea celular de cáncer gástrico y oligodendrogliomas [32] , [33]. Decidimos investigar aún más su perfil de metilación debido a su regulación a la baja putativa en el CaP progresión [31] y se observó señal de metilación en nuestra base de datos de cáncer /de referencia (3,2 veces enriquecimiento), lo que sugiere que la metilación de este gen puede jugar un papel en la progresión del CaP.


HOXD3
[Homoebox factor de transcripción] (cromosoma 2q31-37), un gen que se encuentra a ser metilado en líneas celulares de cáncer de pulmón y tumores primarios [34], que mostró un patrón distinto de aumentar metilación con el grado tumoral en nuestra serie basada en la diferencia media de enriquecimiento (6.4), lo que sugiere que la metilación de este gen puede estar implicado en la progresión de la enfermedad también.

Partek gráfica y mapa de calor visualización de los datos de microarrays es se muestra para los dos genes en la Figura 1.

(a)
BMP-7
y (B)
HOXD3
. Los gráficos de líneas en el panel superior de cada registro espectáculo
2 valores de relación para cada sonda, con casos que representa PP4 rojas A-J y azules que representan casos PP3 1-10. El panel inferior de cada uno es un mapa de calor para cada sonda en casos PP4 y PP3 individuales. Las flechas rojas corresponden a las regiones seleccionadas para el análisis EpiTYPER mientras que las flechas negras corresponden a regiones elegidas para el análisis MethyLight.

EpiTYPER cuantificación de la metilación CpG

El análisis EpiTYPER incluye un subconjunto de casos que mostraron enriquecimiento de ≥3 veces o una señal de falta de metilación (≤2 veces) en los microarrays. Los datos obtenidos a partir del análisis EpiTYPER confirmaron los perfiles de enriquecimiento /metilación en
BMP-7 Opiniones y
HOXD3 con descuento que eran evidentes a partir de los resultados de microarrays en un conjunto de cuatro casos de microarrays elegido para el análisis (Figuras 2, 3) . Para
BMP7
, la metilación de la región identificada por el análisis de microarrays confirmó que para las muestras B y 3, se produjo un importante nivel de metilación en comparación con la del ADN de referencia (hasta 76% para CpG dinucleotide 4 en muestra B) (figuras 2A, B). Estas muestras tenían una metilación promedio de 43% y 52% (relación metilado /no metilada, dada como porcentaje), respectivamente, a través de los 35 CpG analizadas, mientras que las muestras I y 4 mostraron una metilación promedio CpG de 14% y 17%, respectivamente.
HOXD3
muestra un patrón distinto del aumento de la metilación en los casos PP4 en comparación con los casos PP3. El análisis de muestras de ADN fresco congelado F, I, 4, y 8 confirmó un patrón diferencial de metilación de PP3 a PP4, al menos con respecto a los cuatro casos analizados (Figura 3A, B). casos de alto grado F y tuve una metilación promedio de 72% y 43%, respectivamente, en los 27 dinucleótidos CpG analizadas, mientras que las muestras de bajo poder calorífico 4 y 8, respectivamente, tuvieron una metilación promedio de 19% y 35%.

(a) PP3 casos 3 y 4, y (B) PP4 casos B y linfocitos I. referencia se muestran para cada uno. Coloreados barras representan la metilación media de tres repeticiones, con barras de error estándar que se muestran.

(A) PP3 casos 4 y 8 y (B) casos PP4 F e I. Referencia de linfocitos se muestran para cada uno. Coloreados barras representan la metilación media de tres repeticiones, con barras de error estándar que se muestran.

Análisis MethyLight

Para verificar los patrones de metilación de estos genes, se les validado en una serie independiente de parafina embebido casos de CaP, con el tejido normal correspondiente a partir de las mismas muestras cuando están disponibles y también evaluaron su estado de metilación en líneas celulares de CaP (DU-145, PC-3, 22Rv1, y LNCaP) utilizando MethyLight.
BMP-7
metilación se verificó en un total de 4 muestras de tumor (dos PP3, dos PP4), así como dos muestras normales de casos separados (Figura 4A).
HOXD3
metilación estuvo presente en un total de ocho ejemplares (dos PP3, seis PP4) (figura 4B). DU-145 células fueron positivas para la metilación de ambos
BMP-7
y
HOXD3
. Los valores de PMR para DU-145 y los casos positivos se dan en la tabla 3.

(A)
BMP-7
y (B)
HOXD3
MethyLight gráficas de amplificación. El eje x muestra el número de ciclo, mientras que el eje y muestra el valor de Rn delta. Ctrl + -. Supermethylated ADN

RT-PCR

A continuación trataron células DU-145 con el agente de desmetilación DAC y realizó el análisis de RT-PCR semicuantitativa usando sin tratar y células tratadas para evaluar el efecto de la metilación sobre la expresión de los dos genes.
HOXD3
expresión parece ser completamente abolida en células DU-145 no tratadas, mientras que
BMP-7
se expresa mínimamente. El tratamiento con DAC indujo
HOXD3
expresión y provocó un aumento de
BMP7
niveles de mRNA (Figura 5), ​​lo que indica que la metilación está implicada en la reducción de la expresión de ambos
BMP-7 y

HOXD3

NTC -. control sin molde. -DAC - Sin tratar. + DAC - tratados con 5-aza-2-desoxicitidina

Discusión

Hemos utilizado microarrays isla CpG humanos para identificar los genes metilados en el CaP en su conjunto, así como diferencialmente. metilado en bajo grado, PP3 y alto grado, PP4 CaP. puntuación intermedia de Gleason 7 tumores no fueron examinados, ya que se componen de patrones 3 y 4, y elegimos para limitar nuestra atención a aquellos tumores que están compuestos en su totalidad de patrón de Gleason 3 o patrón Gleason 4 con el fin de enriquecieron poblaciones patrón celular. Encontramos que hemos sido capaces de identificar las islas CpG que son cuantitativamente más metilado y no metilado en una mayor frecuencia en los tumores PP4 en comparación con los tumores PP3. Esto puede reflejar un cambio general a un mayor estado de metilación en las islas CpG promotoras que el tumor progresa hacia un grado superior.

La mayoría de los genes descubiertos a través de nuestras matrices o bien nunca han sido demostrado ser metilado en el CaP o en otra tipos de cánceres. Otros genes metilados previamente descritos en el cáncer de próstata, como
CDKN2A
,
PTGS2
, y
RUNX3
, todos mostraron evidencia de metilación basado en los cambios veces y significación estadística. La rigurosidad del análisis estadístico que hemos realizado podría haber evitado la inclusión de estos genes dentro de nuestras principales genes de la progresión o conjunto de datos de cáncer /referencia. Por lo tanto, esto puede no ser indicativo de la falta de metilación, pero en su lugar se puede explicar por los niveles de metilación cuantitativos. Es posible que la metilación de estos genes puede haber ocurrido en un menor número de células y /o en un menor número de dinucleótidos CpG, produciendo de este modo una señal menos robusto en nuestra pantalla. Alternativamente, la agrupación de los casos en los análisis estadísticos puede haber filtrado estos genes a cabo, ya que la metilación en un número menor de muestras crearía una variabilidad media y superior inferior a través de estos casos. Nos sorprendimos al encontrar que el mejor evento de metilación caracterizado CaP, la hipermetilación del
GSTP1
promotor, no fue capturado en nuestros resultados de la pantalla de matriz. Es posible que el método se utilizó para la preparación de ADN diana en combinación con la plataforma de microarrays es responsable de la falta de detección de
GSTP1
señal de metilación. Secuencia de análisis de
GSTP1
reveló que nuestro método metilado enriquecimiento DNA produciría un fragmento de aproximadamente 1.900 pb, lo que puede afectar de recocido a las sondas de longitud significativamente menor (aproximadamente 45 a 60 mer) o puede no permanecer intacto después de la metilación digestión sensible. Tras realizar investigaciones adicionales de
GSTP1
metilación en las mismas 20 muestras de cáncer, sin embargo, hemos podido detectar la metilación en el 80% de los casos utilizando MSP (datos no mostrados).

Hemos desarrollado una lista de genes comparando el total de datos en comparación con el cáncer de referencia, así como la separación de los perfiles de metilación de las puntuaciones PP3 y PP4 Gleason. Elegimos a hacer un análisis de metilación en profundidad de los
BMP-7
y
HOXD3
, ya que estos son nuevas dianas para la metilación en el CaP. Ellos representan un subconjunto de genes de silenciamiento donde pueden jugar un papel en el desarrollo de los cánceres de próstata de alto grado base a los resultados de la matriz, sino también basadas en la información funcional disponible de la literatura actual. Por lo tanto, estos genes no reflejan necesariamente el mayor significación estadística o el mayor cambio veces metilación de cualquiera de dos conjuntos de datos que hemos producido. Los genes con los mayores cambios veces en los conjuntos de datos,
FOXC1
y
VAX1
, requerirá la validación futuro de una serie más amplia de los tumores de próstata.
Proteínas morfogenéticas
óseos son secretadas factores que controlan el desarrollo y mantenimiento de la formación de hueso y que pertenecen a la superfamilia de TGF de proteínas de señalización [35]. Dentro de PCa se ha demostrado que
BMP7
se underexpressed significativamente en células de cáncer de láser microdissected, dando lugar a una transición epitelio-mesenquimal [31]. Lo hace, sin embargo, parecen ser re-expresa en metastásico focos PCa del hueso [36]. Nuestro descubrimiento de la metilación del promotor de
BMP-7
sugiere un posible mecanismo a través del cual se logra el silenciamiento inicial, como el tratamiento de las líneas de células DU-145 con DAC aumentó
BMP-7
expresión dramática. Estudios previos han demostrado la metilación de
BMP-7 Hoteles en los cánceres gástricos y líneas celulares oligodendrogliomas [32], [33], lo que sugiere que el silenciamiento de
BMP-7
través de este mecanismo no se limita a CaP solo. Es de destacar que
BMP-7
metilación no era exclusivo de los tejidos cancerosos histológicamente, pero también fue evidente en el tejido normal adyacente. Esto puede atribuirse al efecto de cancerización de campo lo que se produce la metilación antes de cualquier cambio canceroso histológica en las células, que se ha demostrado que se producen en el cáncer de próstata [37]. Alternativamente, esta metilación puede ser principalmente relacionada con la edad, ya que este fenómeno también se ha demostrado antes en el tejido normal de la próstata [38]. Futuros estudios son necesarios para abordar estas cuestiones.


HOXD3
, otra nueva diana metilación CaP, mostró un claro desplazamiento hacia mayores niveles de metilación del PP3 a PP4 CaP en el análisis de nuestros resultados de la matriz CpG. El papel que
HOXD3
juega en la génesis de tumores y /o progresión de la enfermedad aún no se ha identificado, pero la activación de la señalización de TGF ha demostrado en células A549 transfectadas con
HOXD3
[39]. Las aberraciones en esta vía han sido bien documentados en el CaP y otros tipos de cáncer [40]. Por tanto, es posible que el silenciamiento inducido por metilación de
HOXD3
está perturbando la señalización de TGF, y tal vez contribuir al desarrollo de alto grado CaP.

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