Extracto
Antecedentes
La detección exacta de proteínas características secretadas por las células tumorales de cáncer de colon en fluidos biológicos podría servir un biomarcador de la enfermedad. El objetivo del presente estudio fue identificar y validar nuevos biomarcadores séricos y demostrar su utilidad potencial para el diagnóstico precoz del cáncer de colon
Métodos
El estudio se organiza en tres fases secuenciales: 1). el descubrimiento de biomarcadores, 2) la validación técnica y biológica, y 3) prueba de concepto para poner a prueba el potencial uso clínico de biomarcadores seleccionados. Un subconjunto de prioridades de los genes diferencialmente expresados entre los tipos de tejidos (50 de colon mucosa de individuos libres de cáncer y 100 pares-tumorales normales de pacientes con cáncer de colon) fue validado y más a prueba en una serie de muestras de suero de casos de cáncer 80 de colon, 23 pacientes con adenoma y 77 controles sin cáncer.
resultados
En la fase de descubrimiento, se identificaron 505 biomarcadores candidatos únicos, con resultados altamente significativos y alta capacidad de discriminar entre los diferentes tipos de tejidos. Después de una priorización sucesivo, todos los genes de la prueba (N = 23) fueron validados con éxito en el tejido, y una de ellas, COL10A1, mostró diferencias relevantes en los niveles séricos de proteína entre los controles, los pacientes con adenoma (p = 0,0083) y los casos de cáncer de colon (p = 3.2e-6).
Conclusión
Se presenta un proceso secuencial para la identificación y posterior validación de biomarcadores para la detección precoz del cáncer de colon que identifica los niveles de proteína en el suero COL10A1 como un potencial diagnóstico candidato para detectar adenoma ambas lesiones y tumores.
Impacto
el uso de una prueba de suero baratas para el cribado del cáncer de colon debería mejorar sus tasas de actividad y contribuir a disminuir la carga de esta enfermedad.
Visto: X Solé, Crous-Bou M, D Cordero, Olivares D, E Guinó, Sanz-Pamplona R, et al. (2014) El descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores potenciales para la detección temprana del cáncer de colon. PLoS ONE 9 (9): e106748. doi: 10.1371 /journal.pone.0106748
Editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), España |
Recibido: Abril 23, 2014; Aceptado: August 1, 2014; Publicado: 12 de septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Solé et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. El conjunto de datos de expresión génica está disponible en el Centro Nacional para Gene Expression Omnibus de Información Biotecnológica con número de serie GEO adhesión GSE44076. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Catalán de Oncología (ICO) y la Fundación Privada del Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge (IDIBELL), el Instituto de Salud Carlos III [otorga PI08-1635, PI08-1359, PS09-1037, PI11-1439], CIBERESP CB06 /02/2005 y la "Acción transversal del cáncer", el Gobierno catalán DURSI [subvención 2009SGR1489], la Fundación Privada Olga Torres (FOT), la Fundación Científica Asociación española contra el cáncer (AECC), la Comisión Europea [otorgan FP7-COOP-Salud-2007-B HiPerDART], y la Xarxa de Bancos de tumores de Cataluña patrocinados por Pla director d'Oncologia de Catalunya (XBTC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han presentado una patente sobre el uso de COL10A1 como biomarcador para el diagnóstico precoz de cáncer de colon con el título: "suero biomarcador PARA EL DIAGNÓSTICO dE cÁNCER dE cOLON". número de patente europea: EP2680003A1 (28.06.2012) y España ES2436667A2 (03/01/2014). Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte en el mundo, con más de uno millones de nuevos casos y medio millón de muertes en todo el mundo cada año [1]. Cinco años las tasas de supervivencia relativa son inferiores a 50%, pero esto depende en gran medida de la etapa en el momento del diagnóstico [2]. Ninguna medida preventiva primaria ha demostrado su eficacia en la reducción de la incidencia, pero la detección temprana a través de cribado de la población se ha encontrado para reducir la mortalidad [3].
Hoy en día existe un debate acerca de cuál es la prueba debe ser utilizado para la detección de CCR. Hasta que se recoge una prueba más, las directrices europeas actuales aceptan la prueba de sangre oculta en heces seguido por colonoscopia de confirmación, que es terapéutica cuando se identifican los adenomas resecables [4]. La mayoría de los programas de cribado basados en la población están utilizando guayaco basada prueba de sangre oculta en heces, que bioquímicamente detecta pequeños rastros de sangre derivadas de lesiones sangrado en las heces, o prueba inmunológica fecal, que se basa en la inmunodetección de la hemoglobina humana en heces. Estas pruebas tienen una sensibilidad de 80% para CRC y 28% para adenoma & gt; 1 cm, y especificidades en el intervalo de 91 a 94% [5]. Por otra parte, el cumplimiento del paciente con los ensayos basados en las heces tiende a ser baja [6]. El uso de la colonoscopia como método de referencia para la detección de CCR es objeto de controversia. Se ha informado de una sensibilidad más alta (97%) y especificidad (98%) para la detección temprana de CRC, pero también tiene varios problemas asociados a ella: aumentado el coste económico; requerimiento de personal altamente capacitado; la preparación intestinal incómoda; invasividad; riesgo de morbilidad y mortalidad unido al procedimiento de [7], [8]. Por otra parte, en los países en los que la colonoscopia nacional disponible, el cumplimiento ha sido a menudo bajos [9].
marcadores a base de suero serían altamente atractivo para el cribado del CCR, ya que son mínimamente invasivas y podrían integrarse en cualquier rutina de la salud chequeo sin la necesidad de muestreo de heces adicional, lo que aumenta la aceptación entre los pacientes. técnicas de biología molecular actuales permiten una generación más fácil de muchas hipótesis de biomarcadores candidatos para el diagnóstico, pronóstico o la respuesta terapéutica en CRC, pero la necesidad de una validación adecuada ha sido a menudo informado [10] - [12]. La hipótesis subyacente es que las células tumorales de CRC, incluso en sus etapas pre-invasoras, sufren importantes alteraciones genéticas que inducen la liberación de proteínas características o ácidos nucleicos potencialmente detectables en los fluidos biológicos obtenidos por métodos no invasivos, tales como sangre o heces [11] . La detección mediante técnicas de biología molecular de estas sustancias servirá como un biomarcador de la enfermedad para desarrollar pruebas de diagnóstico con una mejor capacidad de predicción de las pruebas de detección actuales. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue identificar y validar nuevos biomarcadores séricos y demostrar su utilidad potencial para el diagnóstico precoz del cáncer de colon.
Métodos
La evaluación de biomarcadores en este estudio se organizó en fases secuenciales y consecutivas para el descubrimiento, validación técnica y biológica, y la prueba de concepto para probar el potencial uso clínico de biomarcadores seleccionados. En primer lugar, se analizaron los datos de microarrays de expresión génica para identificar biomarcadores candidatos en muestras de tejido de los casos de cáncer de colon y los controles sin cáncer (
fase de descubrimiento
). En segundo lugar, utilizando una técnica alternativa basada en cuantitativa en tiempo real PCR (RT-qPCR), una selección de genes expresados diferencialmente se validó en el mismo conjunto de biopsias de tejido (
validación técnica Fase
), así como en biopsias obtenidas a partir de un conjunto independiente de pacientes (
Fase de validación biológica
). Por último, el uso clínico potencial de los candidatos validados más prometedores se ensayó en muestras de suero de casos de cáncer de colon, un pequeño conjunto de adenomas, y los controles sin cáncer mediante la detección de la proteína secretada correspondiente usando el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) pruebas (
Prueba de concepto de fase
). directrices STARD reportados [13] han sido la base para definir el protocolo.
Pacientes y muestras
Principales características de los sujetos incluidos en el presente estudio se muestran en la Tabla 1. tumor de colon y vinculado (cm) ~5-10 patológicamente normales muestras de tejidos adyacentes mucosa utilizados en este estudio se obtuvieron en el momento de la cirugía de una serie de casos con un diagnóstico de adenocarcinoma de colon incidente asistir al hospital Universitario de Bellvitge (Barcelona, España) entre enero de 1996 y diciembre de 2007. Incluye los casos fueron seleccionados para formar una serie homogénea de pacientes con estadio II, el cáncer de colon esporádico de microsatélites estables. Todos los pacientes fueron sometidos a cirugía radical y no recibieron quimioterapia antes de la cirugía. Los patólogos confirmaron todos los diagnósticos de cáncer de colon y seleccionaron muestras de tejido fresco del tumor y la mucosa adyacente tomado del margen de resección proximal. Una tinción de hematoxilina-eosina se realizó en un corte de deslizamiento de la muestra de tumor para guiar el patólogo en la selección de un área con al menos 75% de las células tumorales. La agrupación de etapas siguió la guía de la UICC autorizada "Atlas TNM, 6ª Edición". La mejor aproximación a esta clasificación se deriva de la información recogida en el momento del diagnóstico para cada caso.
Las muestras de tejido de la mucosa del colon de los controles sin cáncer se obtuvieron a través de la colonoscopia entre febrero y mayo de 2010. fueron invitados a participar de una serie de pacientes consecutivos que se sometieron a colonoscopia indicado por los síntomas (por lo general la anemia, sangrado, dolor gastrointestinal o el ritmo alterado). Aquellos con resultados negativos (es decir, sin lesiones de colon) se incluyeron en este estudio. Ninguno de ellos informó antecedentes familiares de cáncer.
Finalmente, se seleccionaron muestras de suero de casos de cáncer de colon y los controles sin cáncer a partir de un estudio de casos y controles epidemiológicos sobre las interacciones entre genes y medio ambiente que se ha descrito anteriormente en detalle [ ,,,0],14]. Todas las muestras de suero se recogieron antes de la cirugía para los casos y justo antes de la colonoscopia para los controles.
Para simplificar la nomenclatura de los diferentes tipos de muestras, aquí vamos a utilizar
tumor gratis (T) cuando se refiere a muestras de tumores de pacientes con cáncer de colon,
adyacente normal (a) cuando se refiere a muestras de mucosa de colon normales de patología de pacientes con cáncer de colon, y
libre de cáncer gratis (F) cuando se refiere a muestras de mucosa de colon de cáncer-libre los individuos.
el Comité Ético de Investigación clínica del hospital Universitario de Bellvitge aprobaron el protocolo de estudio, y todos los individuos que recibieron consentimiento informado por escrito para participar y para los análisis genéticos que se realizan en sus muestras.
ARN extracción
El ARN total fue aislado de muestras de tejidos congelados utilizando Exiqon miRCURY kit de aislamiento de ARN (Exiqon a /S, Dinamarca), según el protocolo del fabricante, y teniendo en cuenta todas las precauciones para evitar la degradación del ARN por RNasas recomienda. ARN extraído se cuantificó por NanoDrop ND-1000 Espectrofotómetro (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y se almacenó a -80 ° C. La calidad de estas muestras de ARN se comprobó adicionalmente usando RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se confirmó por electroforesis en gel. los números de la integridad del ARN (RIN) mostraron buena calidad ([Q1 = 7,5; mediana = 8,25; Q3 = 8.9] para los tumores, [Q1 = 7; mediana = 7,5; Q3 = 8] para el normal adyacente y [Q1 = 7,8; mediana = 8,3; Q3 = 8,65] para el normal sano). La pureza del RNA se midió con la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm (media = 1,96, SD = 0,04), sin diferencias entre los tipos de tejidos
Descubrimiento de la serie -. Arrays de expresión
La descubrimiento serie incluyó a 100 pares de muestras normales adyacentes mucosa colónica tumoral y 50 y las muestras de mucosa colónica de individuos sin cáncer (n total = 250). El ARN total extraído de estas muestras se hibridó en placas de matriz Affymetrix Human Genome U219 (Affymetrix, Santa Clara, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Cuatro muestras (dos pares de tumor normal adyacente) fueron excluidos del conjunto de datos después de control de calidad. Por lo tanto, se utilizó un último conjunto de datos de 246 matrices para su posterior análisis.
Los datos primarios se normalizaron utilizando el algoritmo robusto multiarray media [15] aplicado en el
affy
paquete [16] de la Bioconductor suite (http://www.bioconductor.org) [17]. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software estadístico R computación (http://www.r-project.org) [18].
Antes de que se realiza el análisis de la expresión diferencial, bajo variantes y las transcripciones del cromosoma Y fueron eliminados de los análisis posteriores. Para los restantes probesets, pruebas t de Student-regularizado se utilizaron para detectar la sobreexpresión significativa entre normal adyacente (A) o muestras de tumor (T) y libre de cáncer mucosa (F). corrección de Bonferroni se aplicó para tener en cuenta múltiples pruebas de hipótesis. Con el fin de reducir las listas obtenidas inicialmente, probesets candidatos más se filtran según diferentes criterios: bajos niveles de expresión y baja variabilidad en la mucosa libre de cáncer; gran media veces el cambio entre T /F o A /F; y homogeneidad de los efectos entre múltiples sondas para el mismo gen, cuando esté disponible. Probesets que pasaron los criterios de filtrado fueron asignadas a los genes, las unidades de información que se utiliza para los análisis posteriores
Un procedimiento de priorización se llevó a cabo para seleccionar los mejores genes candidatos para la validación utilizando datos de dominio público [19] - [24]. . Criterios representaron estaban relacionadas con cuestiones de reproducibilidad y especificidad: observaron reproducibilidad de las diferencias de expresión; niveles muy bajos de expresión en el tejido de la sangre; y la selección de genes con gran expresión en el tejido de colon en comparación con otros tejidos de acuerdo con la base de datos GeneCards (http://www.genecards.org) [25], aunque la mayoría de los genes se expresaron en múltiples tejidos. El conjunto de datos de expresión génica está disponible en el Centro Nacional para la expresión de genes de Omnibus de Información de Biotecnología [26] con el GEO número de serie de la adhesión GSE44076 y en el sitio web del proyecto (http://www.colonomics.org).
Técnica y validación biológica - RT-qPCR para la evaluación de la expresión
se evaluaron los niveles de expresión de genes seleccionados con RT-qPCR tanto para la serie de descubrimiento y de un conjunto adicional de 104 muestras (70 pares de tejidos /tumorales normales adyacentes de cáncer de colon 34 pacientes y de los controles sin cáncer). Se recogieron muestras de estos entre enero de 1996 y junio de 2011 siguiendo el mismo protocolo y almacenados en las mismas condiciones que la serie de descubrimiento. Se sintetizó ADNc a partir del ARNm extraído con el kit de síntesis de la primera cadena de ADNc de la transcripción (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) siguiendo procedimientos estándar.
Dos conjuntos de cebadores fueron diseñados para cada gen, y cada conjunto se ensayó en duplicar. Tres genes de control se incluyeron en el ensayo:
ACTB
,
TPT1
, y
UBC
.
ACTB
fue elegido en base a la extensa literatura previa que señala como un gen de mantenimiento adecuado para la expresión de genes análisis en muestras de colon [27] - [29].
UBC
y
TPT1
fueron seleccionados en base a la alta estabilidad de sus niveles de expresión en todas las muestras en nuestra gama de datos (figuras S1 y S2). Curiosamente, también se habían postulado previamente como limpieza genes potencialmente adecuados para ensayos de expresión génica en muestras de colon [29].
multiplexados RT-qPCRs ensayos se realizaron utilizando BioMark dinámico matriz de 96 × 96 Placas (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). las imágenes resultantes se analizaron con el software Fluidigm Biomark utilizando parámetros estándar. qPCR datos sin procesar se procesaron con el paquete v1.10.0 HTqPCR [30]. Antes de la evaluación de la expresión diferencial entre diferentes tipos de tejidos, la matriz de expresión se filtró para los propósitos de calidad.
UBC
finalmente fue seleccionado como el control de limpieza basado en la estabilidad de sus valores de ciclo umbral (Figura S2). Mann-Whitney se utilizaron para comparar los niveles de expresión entre las muestras normales y libres de cáncer adyacentes y entre las muestras libres de cáncer y tumores. Se analizó cada conjunto de cebadores de forma independiente, y el conjunto de cebadores que se muestran los más altos resultados significativos en el análisis de la expresión diferencial fue seleccionado como representante
Identificación de biomarcadores séricos -. prueba de concepto para la validez de detección
para probar el valor potencial para la detección precoz, los candidatos más prometedores de la validación biológica se analizaron en muestras de suero en una serie de 80 casos de cáncer de colon, 23 pacientes con adenoma y 77 controles sin cáncer, todos probados por duplicado para aumentar la precisión del experimento. muestras de diez mililitros de sangre venosa periférica se obtuvieron de los casos de cáncer de colon, los pacientes con adenomas y controles. Después de centrifugación durante 15 minutos a 1000 rpm dentro de los 30 minutos de la colección, el suero se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C. kits ELISA comercial de Life Sciences Inc y amp I +; D Systems, dependiendo de la disponibilidad, se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluar las concentraciones de proteína de suero. Todos los ensayos emplean sándwich cuantitativo técnica de inmunoensayo enzimático. La concentración de proteínas diana en cada muestra se calcula a partir de una curva estándar por duplicado en cada placa. Los científicos que examinan estas muestras de suero eran conscientes del diagnóstico del paciente. Un modelo lineal de ajustar por edad, género y los efectos potenciales de lote se utilizó para evaluar la significación estadística de los niveles de proteína diferencial entre los grupos. La asociación de los marcadores con las características del paciente como la edad y el género, las múltiples factores epidemiológicos y las características del tumor se muestra en la Tabla S1. Debido a que algunos marcadores séricos mostraron valores extremos por unos sujetos, también se realizó una prueba basada en rango. Los resultados no cambiaron de forma relevante y los valores de p derivados de los modelos lineales son reportados.
El número de muestras utilizadas se calculó para alcanzar una precisión del 10% en las estimaciones de sensibilidad y especificidad para los valores esperados de 75%. Esto requiere al menos 72 sujetos por grupo. Para la serie de descubrimiento, este número era desequilibrada a los tumores de sobremuestreo, que tienen mayor variabilidad y una amplia gama de candidatos tenían que ser analizados. La serie de validación en suero se complementa con un pequeño subgrupo de adenoma (n = 23) para explorar la utilidad de los marcadores para detectar esta lesión premaligna.
Resultados
descubrimiento de biomarcadores
en este conjunto homogéneo bien seleccionada de las muestras, las diferencias en la expresión de ARNm medido con placas de Affymetrix HG-U219 eran tan notable que una técnica no supervisada (análisis de componentes principales) usando el conjunto completo de probesets separó casi a la perfección los tres tipos de tejidos ( Figura 1a). El primer componente principal divide claramente muestras de tumores de los casos de cáncer de colon (T) y las muestras no tumorales. Notablemente, el segundo componente principal también split (F) de las muestras normales adyacentes pertenecientes a los pacientes con cáncer (A) libre de cáncer.
A. Análisis de componentes principales. B. Genes expresados diferencialmente entre las muestras normales y libres de cáncer adyacentes. C. Genes expresados diferencialmente entre las muestras tumorales y libres de cáncer.
A partir de 33,853 sonda fija incluidos en la matriz con alta variabilidad, 5.503 eran sobre-expresada en A cuando se compara con F y 11.229 eran mayores -expresada en T en comparación con F (p & lt; 0,05, Bonferroni corregido). Nos hemos centrado específicamente en genes sobre-expresados porque estas diferencias son más propensos a ser detectados en el suero, y por tanto más adecuado para ser utilizado como biomarcadores de diagnóstico. Curiosamente, un notable nivel de solapamiento (3.101 conjuntos de sonda, ~56%) se encontró entre estas dos listas de conjuntos de sonda, lo que sugiere que la mucosa normal adyacente en pacientes con cáncer ya se había experimentado importantes alteraciones en la expresión génica, y el aumento de la importancia de utilizar libre de cáncer como el tejido de la mucosa de referencia. Los resultados globales del análisis de expresión diferencial se muestran en las figuras 1b y 1c.
Para dar prioridad a los candidatos a biomarcadores de diagnóstico, un conjunto de filtros se aplica al conjunto inicial de la sonda fija expresados diferencialmente. Estos filtros se basan principalmente en criterios estadísticos (es decir, gran factor de cambio entre A /F o T /F, bajos niveles de expresión y baja variabilidad en las muestras F). Estos filtros produjeron un número final de 242 conjuntos de sonda seleccionados entre A /F y 443 entre T /F, que corresponde a un conjunto de 194 y 352 genes, respectivamente (Tabla S2).
Esta primera selección proporciona una lista de 505 biomarcadores candidatos únicos con muy significativas las diferencias de expresión entre el tumor y el tejido libre de cáncer. Debido a las dificultades técnicas derivadas de la validación de una cantidad tan grande de los biomarcadores, se aplicaron criterios técnicos y biológicos adicionales para reducir aún más la lista de posibles candidatos. Este segundo conjunto de filtros se basa en la evaluación de la coherencia entre las diferentes probesets para cada gen; confirmación de nuestros resultados en independientes y accesibles al público de expresión génica de datos; y nulos o bajos niveles de expresión de estos genes en muestras de sangre de individuos sin cáncer. Por otra parte, el conocimiento previo y la información molecular para cada gen se compiló a partir de la bibliografía y bases de datos en línea para asegurar la selección de los candidatos más fiables (es decir, la secreción de la proteína, la especificidad tisular, función de las proteínas, la evidencia anterior como un biomarcador, entre otros). Una lista de los 23 mejores candidatos finalmente fue seleccionado para la validación en el paso siguiente (Tabla 2, columnas 1-2).
Técnica y validación biológica
Para garantizar la fiabilidad de los resultados obtenidos de los arrays de expresión de genes, la selección de 23 biomarcadores se validó con una técnica alternativa (RT-qPCR), tanto en el mismo conjunto de muestras (es decir, técnica de validación), y también en una serie independiente con características clínicas y epidemiológicas equivalentes (es decir, la validación biológica).
la figura 2 muestra de genes de dos vías y de agrupamiento muestra de los valores de expresión de RT-qPCR tanto para los resultados de la técnica (Figura 2a) y la validación biológica (Figura 2b). ejes horizontales de los mapas de calor (es decir, columnas) muestran una clara separación de muestras de tumores de los grupos normales y libres de cáncer adyacentes. El eje vertical de genes (es decir, filas) mostró dos grupos de genes, uno para los expresados diferencialmente entre A /F y otro para el expresado diferencialmente entre T /F. Estos resultados altamente replican el patrón de expresión observado en las matrices en la fase de descubrimiento, reforzando el papel potencial de estos genes como biomarcadores de diagnóstico de cáncer de colon. Una comparación formal de las diferencias de expresión entre los tipos de muestras para la validación técnica y biológica se muestra en la Tabla 2, columnas 3-4. Aunque sólo los valores de p se muestran en la Tabla 2, los niveles de expresión de todos los genes validados comportaron constantemente a lo largo de las diferentes fases, como se muestra en la Figura S3.
Las muestras son un código de colores en la parte superior de los mapas de calor basan en el tipo de tejido (es decir, la mucosa libre de cáncer = verde, tejido normal adyacente de pacientes con cáncer de colon = azul, tejido tumoral = rojo)
Prueba de concepto -. identificación de biomarcadores séricos
como piloto de prueba de concepto para demostrar su utilidad potencial como biomarcadores tempranos de diagnóstico de cáncer de colon, una selección de 9 genes fueron probados en el suero mediante pruebas de ELISA. La priorización de estos candidatos se basa en una extensa revisión de la literatura y la disponibilidad de kit ELISA comercial.
Los resultados para cada proteína se muestran en la Figura 3. Sorprendentemente, alfa1 colágeno tipo X (COL10A1) muestran concentraciones muy elevadas en el colon casos de cáncer y adenomas en comparación con los controles (p = 3.2e-6 y P = 0,0083, respectivamente). Las concentraciones séricas de COL10A1 en los controles, los adenomas de colon y los casos de cáncer de fase se muestran en la figura S4. Curiosamente, se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon los controles a cada una de las diferentes fases del tumor, excepto la Etapa I, probablemente debido al tamaño pequeño de la muestra de este grupo. El área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC) fue de 0,75 y 0,76 para el cáncer cuando adenoma y cáncer de colon se consideraron en conjunto (Figura 4), que muestra buena capacidad potencial de clasificación. Metaloproteinasas de matriz-7 (MMP7) también mostró una asociación significativa pero no se considera aún más, ya que se debió a una disminución en la expresión en los adenomas en comparación con los controles, lo que representó el sentido contrario de la expresión diferencial que estábamos tratando de validar. Ninguna combinación de COL10A1 con cualquiera de las otras proteínas aumentó significativamente el área bajo la curva ROC (datos no mostrados).
A. Las curvas ROC para ambos adenomas y cáncer de colon juntos (púrpura) y los casos de cáncer de colon solamente (rojo). B. Diferentes puntos de corte de marcador en contra de las curvas de sensibilidad y especificidad. Eficacia
detección Discusión
CRC con la prueba de sangre oculta en heces se ha demostrado en ensayos aleatorios. No obstante, la baja especificidad de la prueba sugiere la necesidad de pruebas diagnósticas alternativas más precisas. Sigmoidoscopia, colonoscopia y tomografía computarizada (es decir, la colonoscopia virtual) son fuertes candidatos alternativos, pero todos tienen limitaciones importantes, sobre todo en cuanto a los costos, los posibles efectos secundarios graves y la reducción de la participación. La participación es un factor importante para el cribado de la eficacia, y es también una observación generalizada que el cribado basado en la prueba de sangre oculta en heces tiene bajas tasas de participación [31] - [33]. Por lo tanto, una prueba de diagnóstico basado en un análisis de sangre de rutina, probablemente sería capaz de llegar a un mayor porcentaje de la población, y las autoridades de salud pública favorecería una prueba de este tipo si la eficacia y los costos fueron similares a prueba de sangre oculta en heces. Con estas premisas en mente, empezamos este estudio para buscar biomarcadores de diagnóstico que se pueden detectar en la sangre con un simple y asequible prueba de ELISA
.
Nuestro estudio de la expresión génica en el tejido de colon ha confirmado observaciones anteriores de que una gran número de genes están desreguladas en el tumor en comparación con la mucosa normal adyacente. A partir de los 20.000 genes interrogados en la matriz de expresión, y después de la filtración por varios criterios restrictivos, 505 biomarcadores candidatos únicos se han identificado (Tabla S2), con resultados altamente significativos y de alta capacidad para discriminar entre tumor emparejados y muestras normales adyacentes. Una característica importante de nuestro diseño del estudio es la inclusión de un conjunto de muestras de los controles sin cáncer (n = 50). Esto nos ha permitido identificar los genes que no muestran diferencias de expresión entre el tejido normal y tumoral adyacente de pacientes con cáncer de colon, así como para confirmar que los genes sobreexpresados en tumores no muestran altos niveles de expresión en el tejido de colon libre de cáncer, lo que podría impedir su uso potencial como biomarcadores. Hemos descrito previamente que la expresión del gen de la mucosa del colon normal adyacente en un paciente con cáncer que ya se ha alterado de manera significativa si se compara con la mucosa libre de cáncer de colon [34], lo que refuerza la necesidad de incluir a los tejidos de individuos libres de cáncer en los proyectos destinados a encontrar biomarcadores de diagnóstico para el cáncer de colon
.
el gran número de candidatos identificados en el análisis de datos de expresión nos llevó a priorizar cuáles debían ser seleccionados para su posterior validación. Se utilizó una combinación de criterios, que incluían la coherencia con otros conjuntos de datos y la literatura a disposición del público; niveles bajos o ninguna expresión en la mucosa libre de cáncer o de otros tejidos; expresión predominante en el tejido de cáncer de colon; y selección de proteínas secretables. Desde la identificación de las proteínas séricas es caro y lleva mucho tiempo, se realizó una validación técnica y biológica de los mejores candidatos antes de intentar las pruebas de ELISA. La validación técnica (es decir, en el mismo conjunto de muestras, pero con una técnica diferente) mostró una notable reproducibilidad de las diferencias de nivel de expresión medidos por RT-qPCR y microarrays para todos los genes ensayados, lo que confirma que el conjunto de datos de expresión obtenidos con Affymetrix HG-U219 microarrays era de calidad excepcional y de forma fiable identificaron diferencias de expresión entre los diferentes tipos de tejidos. Por lo tanto, esperamos que el número de falsos positivos en la lista restante (no validada) de importantes genes expresados diferencialmente entre tipos de tejidos a ser baja. Por otra parte, la confirmación de las diferencias identificadas previamente en un conjunto de datos biológicamente independiente también pone de manifiesto la validez de los resultados obtenidos con microarrays.
El siguiente paso en nuestro proceso de validación secuencial estaba tratando de identificar en el suero las proteínas correspondientes para nuestra genes candidatos y evaluar su uso potencial para el diagnóstico precoz. También incluimos un subgrupo de pacientes con adenoma, ya que éste es también un objetivo importante para el cribado del CCR. Utilizando kits comerciales de ELISA podríamos evaluar los niveles de proteína de todos los genes priorizados. Sorprendentemente, COL10A1 mostró suficientes diferencias relevantes entre los controles y los pacientes con cáncer de colon (p = 3,2 × 10
-6) para ser propuesto como un candidato potencial de diagnóstico. MMP7 también mostró algunas diferencias para adenomas (p = 0,0092), pero mostró una dirección opuesta a la esperada.
Hemos identificado la COL10A1 proteína que, cuando se detecta en altas concentraciones en la sangre, puede ser indicativo de la presencia de una lesión neoplásica en el colon. Esta proteína fue seleccionada después de un procedimiento secuencial en el que empezamos a explorar los datos de expresión de todo el genoma en el tejido de colon. Se observaron niveles séricos elevados de COL10A1 tanto para los pacientes de adenoma y cáncer de colon. El área bajo la curva ROC fue de 0,76, lo que hace COL10A1 como un biomarcador de diagnóstico prometedor. El punto de corte de 280 ng /ml alcanza 0,63 sensibilidad y especificidad 0,85 para el cáncer de colon o adenoma (Figura 4). Valores similares se obtuvieron para el cáncer solamente. Unos sujetos sin cáncer mostraron altos niveles de COL10A1 en el suero, superior a la media de adenoma, lo que indica que otros procesos no relacionados con lesiones colorrectales pueden aumentar los niveles de Col10a1.
COL10A1
es una colágeno de cadena corta expresa principalmente por los condrocitos durante la osificación. Los defectos en esta proteína se han relacionado con el de tipo Schmid metafisaria chondrodysplasia [35]. COL10A1 no se expresa en el epitelio de colon normal, pero es un objetivo transcripcional directa de
RUNX2
[36], un factor de transcripción que se expresa en las células cancerosas, y se ha relacionado con varios tipos de cáncer. La elevada expresión de
COL10A1
observado en los tumores podría ser un efecto indirecto de las alteraciones de regulación de nivel superior que ocurren en el tumor. De hecho, hemos observado una alta correlación entre RUNX2 y
COL10A1
expresión en tumores (Pearson R = 0,5, resultados no mostrados). Nuestros datos de expresión también identifica alta correlación entre el
COL10A1
y otros genes:
SFRP4
,
INHBA
,
TNFSF4 Windows que están involucrados en la señalización de Wnt y la citoquina