Extracto
Antecedentes
La detección de un nuevo fármaco contra el cáncer eficaz y hypotoxic es una nueva estrategia emergente para la quimioterapia del cáncer. La doxiciclina (DC) es una clase de antibióticos, pero también inhibe la tumorigénesis.
Métodos
MTT y el ensayo de invasión celular, citometría de flujo, análisis y desnudos ratones Western-blot se utilizaron para investigar los efectos y mecanismos de doxiciclina que subyace en las células de cáncer de ovario epitelial
resultados
la doxiciclina inhibe la proliferación e invasión de SKOV3 y SKOV3 /DDP.; inducida por apoptosis moderada de SKOV3 /DDP. expresión CXCR4 en tanto los niveles de proteína y ARNm se downregulated en ambas líneas celulares cuando se trataron con doxiciclina. Akt y ERK1 /2 estaban involucrados en efecto doxiciclina sobre la proliferación celular de SKOV3 pero no de SKOV3 /DDP. Akt y EKR1 /2 fosforilación fueron activadas por SDF-1α, que luego fue inhibida por la doxiciclina en SKOV3. Pro-caspasa-3 expresión fue significativamente mayor en SKOV3 que en SKOV3 /DDP que fue upregulated cuando son tratados con doxiciclina. In vivo, la doxiciclina inhibe xenoinjerto de tumor peritoneal y la disminución de la ascitis maligna.
Conclusión
Doxycycline no sólo tiene un efecto inhibidor sobre el cáncer de ovario, pero también puede aumentar la sensibilidad a cisplatino. Akt y ERK 1/2 activaciones SDF-1α /CXCR4-regulada probablemente están implicados en el efecto antitumoral de la doxiciclina en las células SKOV3, mientras que la regulación positiva de la procaspasa-3 puede ser el mecanismo principal implicado en las células SKOV3 /DDP.
Visto: Wu W, Yu Lh, Ma B, Xu MJ (2014) El efecto inhibidor de doxiciclina en cisplatino-sensibles y resistentes a cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 9 (3): e89841. doi: 10.1371 /journal.pone.0089841
Editor: Han Shen-Ming, Yong Loo Lin Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Singapur, Singapur
Recibido: 20 Julio, 2013; Aceptado: 27 de enero de 2014; Publicado: 5 Marzo 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (Nº 10411960100) y el hospital Changhai (núm CH125510105). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial (EOC) representa más del 90% de todos los tumores malignos de ovario y es principalmente una enfermedad de las mujeres posmenopáusicas, que se producen con mayor frecuencia en sexta y séptima década de la vida [1]. Representa la causa más común de muerte entre las mujeres con tumores malignos ginecológicos y la tasa de supervivencia global a los 5 años está basada en platino de sólo el 30% [2].
En la actualidad, el tratamiento estándar para el cáncer de ovario implica la citorreducción tumoral y quimioterapia [3]. La respuesta a este régimen es de al menos 70% de los casos, sin embargo, el 60-80% de los primeros en responder recaída dentro de los 18 meses con una enfermedad resistente al platino [4].
cisplatino (DDP), un noncycle dependiente de derivado de platino citotóxico, se ha utilizado con frecuencia en tumores sólidos diferentes, incluyendo gástrico, testicular, urológica, cabeza, cuello, y cáncer de ovario [5]. compuestos de platino ejercen su efecto citotóxico mediante la formación de intrastrand platino-ADN enlaces cruzados. Esto inhibe la replicación del ADN y en última instancia conduce a la apoptosis [6]. Sin embargo, al igual que otros medicamentos contra el cáncer, el cisplatino resistencia sigue siendo un obstáculo importante para el éxito clínico. La mayoría de los pacientes con cáncer de ovario recurrente con el tiempo desarrollarán la enfermedad resistente al platino [7], por lo que las células tumorales refractarias a la terapia. Por lo tanto, es necesario buscar nuevos medicamentos de quimioterapia económicas y eficaces que tienen actividades antitumorales y /o aumentar las respuestas antitumorales de la quimioterapia basada en platino.
La doxiciclina (DC) es un tipo de tetraciclinas de segunda generación, que es comúnmente utilizado para tratar una variedad de infecciones. Los estudios actuales han demostrado que la doxiciclina es un fármaco pluripotentes que afecta a muchas funciones anticancerígenas, incluido el efecto de crecimiento anti-tumor en el carcinoma de células escamosas oral humana y la inhibición de la migración de células de melanoma [8] - [9]. La doxiciclina también tiene un potencial para la actividad terapéutica mejorada de terapias contra el cáncer biológicos [10]. Sin embargo, el efecto de la doxiciclina en las células de cáncer de ovario epitelial y los mecanismos subyacentes siguen siendo desconocidos.
Por lo tanto, en nuestro experimento, nuestro objetivo es demostrar que la doxiciclina tiene una actividad contra el cáncer en las células de cáncer de ovario epitelial, y para explorar más a fondo los mecanismos subyacentes implicados.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Segunda Universidad Médica Militar. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Cultivo de células y reactivos
líneas celulares de cáncer de ovario humano HO8910 fue obtenido del Departamento de fisiopatología de la Segunda Médico Militar Universidad. SKOV3 y sus células resistentes al cisplatino afines SKOV3 /DDP se obtuvieron de ATCC (American Tissue Culture Collection). SKOV3.ip células fueron proporcionados por el Departamento de Ginecología y Obstetricia, Hospital de Shanghai First People (obtenido de la ATCC). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. El cisplatino, doxiciclina, SDF-1α, anticuerpo contra β-actina se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los anticuerpos contra CXCR4, fósforo-Akt, Akt total, fósforo-ERK, ERK total, el MMP-2, MMP-9, caspasa-3 se adquirieron de Cell Signaling Technology. kit Transwell se adquirió de BD, EE.UU.. kit ELISA fue adquirido de R & amp; D, EE.UU.. Cell kit de apoptosis se adquirió de Roche, EE.UU.. ARN interferentes pequeños fueron sintetizados por Genepharma Company (Shanghai, China). Xfect agente de transfección se adquirió de Clontech, EE.UU.. RNeasy MINIKIT se adquirió de QIAGEN, Clifton Hill, Australia.
ensayo MTT
Como se informó antes
11, los ensayos de MTT (methylthiazoltetrazolium) se llevaron a cabo para evaluar la viabilidad celular. suspensión Las células se sembraron en placas de 96 pocillos después de 12 h para la fijación después se trataron con diferentes concentraciones de cisplatino o doxiciclina. Se incubaron las células tratadas con las drogas durante 48 h y después se añadió solución de 5 mg /ml de MTT a los cultivos de 3-4 h adicional. Por último, el medio que contiene MTT se aspiró y se añadieron 100 l solución DMSO. Como resultado, las células vivas forman cristales debido a la presencia de MTT. Los cristales se disolvieron por DMSO y la absorbancia se midió a 490 nm por un lector de inmunoabsorción.
PCR en tiempo real
El ARN total se aisló utilizando un minikit RNeasy (QIAGEN, Clifton Hill, Australia) . Dos mg de ARN total se transcribe inversamente en ADNc en una reacción de 25-l que contiene 15 nmol /L MgCl2, 375 mmol /L de KCl, 50 mmol /L de ditiotreitol, 250 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,3), 10 mmol /L los cuatro dNTPs, 20 inhibidores de la U de RNasa, 200 U de transcriptasa inversa de M-MLV, y 50 ng de cebador oligo18. La mezcla se incubó a 70 ° C durante 5 min y después a 42 ° C para 60 min seguido por 10 min a 70 ° C. Se utilizaron los siguientes cebadores: CXCR4, 5-CCAACGTCAGTGAGGCAGAT-3 (hacia adelante) y 5-GGCAGGATAAGGCCAACCAT-3 (inversa); β-actina, 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 (hacia adelante) y 5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 (al revés). PCR en tiempo real se llevó a cabo usando Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) en una mezcla de reacción de 25 l. Se utilizaron 2 x Taq PCR Master Mix y 0,2 mmol /L de cada cebador. En tiempo real las condiciones de PCR se optimizaron de acuerdo con los experimentos preliminares para lograr una relación lineal entre la concentración de ARN y los productos de PCR. La especificidad de los cebadores se verificó mediante el examen de la curva de fusión, así como la posterior secuenciación del tiempo real RT-PCR. Se usó agua destilada en lugar de ADNc como control negativo. Todas las muestras se normalizaron en contra de control interno β-actina. La expresión génica se calcula utilizando el método comparativo ciclo umbral (Ct).
Western-blot análisis
Como se informó anteriormente [11], se cosecharon y se homogeneizaron en tampón de lisis frío células (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, sal de sodio 1% de ácido desoxicólico, 0.1% de SDS, y una mezcla de inhibidor de la proteasa) usando un homogeneizador. La concentración total de proteína se determinó por el método de Bradford utilizando suero bovino como estándar. Igual cantidad de proteínas se separaron en un 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Después bloquearon en tampón de bloqueo que consiste en 20 mM Tris-HCl, NaCl Ph 7.4,137 mM, 0,1% de Tween 20, y 5% de leche sin grasa para 2 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C en el anticuerpo primario (anti -β-actina 1:1000, anti-CXCR4 1:1000, anti-fósforo-Akt 1:1000, total anti-Akt 1:1000, anti-fósforo-ERK 1:1000, anti-ERK-total 1:1000 , anti-MMP-2 1:1000, anti-MMP-9 1:1000). Las transferencias se incubaron después con HRP-conjugado anticuerpo secundario (1:1000, Santa Cruz) durante 2 h a temperatura ambiente, y finalmente visualizar en solución ELC. Durante 1 min y se expusieron a una película Kodak de 1-30 min. Para el control de carga de gel correcta, se usó la cuantificación β-actina. Para cuantificar las señales de transferencia de Western, se midió la densidad de banda utilizando UMAX PowerLook III y normalizado con respecto al control.
ELISA ensayo
Se determinaron las cantidades de SDF-1 en el medio condicionado utilizando sándwich ELISA (sensibilidad 15 pg /ml) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
invasión de la célula de ensayo
SKOV3 y SKOV3 /DDP invasiones de células se evaluaron utilizando cámaras de 24 pocillos de cultivo celular transwell con policarbonato 8,0 micras de poro elementos filtrantes. Los filtros se recubrieron en primer lugar con BD matrigel. La solución madre de matrigel se diluyó con medio RPMI-1640 sin suero (1:01). Una cantidad de matrigel diluido fue pintado en cada elemento de filtro y se mantuvo a temperatura ambiente durante 10-15 minutos para secar. Entonces, las células cultivadas se trataron con tripsina y se suspendieron en medio RPMI-1640 sin suero a una concentración de 2 x 10
5 ml. Se añadió un total de 500 l de 10% de FBS /medio RPMI-1640 o 500 l de solución de 50 ng /ml de SDF-1 a la cámara inferior y 100 l de suspensión celular se aplicó a filtros de inserción recubiertas. La cámara se incubó durante 3 h para permitir la unión de células a continuación, las células fueron tratadas con doxiciclina. La cámara se incubó durante 36 h para permitir la invasión de células; a continuación, el inserto se fija con alcohol deshidratado durante 15 minutos, y luego se tiñó con 0,1% de cristal violeta durante 15 minutos y se lavó con 1 x PBS. Se rasparon las células que no sean necesarios en el lado superior o inferior del filtro. La membrana se montó en un portaobjetos y luego se examina con un microscopio utilizando 20 × magnificación. Invasion se cuantificó mediante la medición de las células teñidas en tres áreas al azar por membrana.
análisis de citometría de flujo de la apoptosis de células
Las células se recogieron y doble teñidas con ficoeritrina conjugado de Anexina V y PE de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. se consideraron apoptóticas células anexina V-positivo, y se calculó el porcentaje del número total de células. Diez mil eventos fueron recogidos para cada muestra utilizando un Becton Dickinson FACScan (Fondo para la citometría de flujo, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, Nueva York), y los datos fueron analizados utilizando el programa Winlist (VeritySoftware House, Topsham, ME).
siRNA transinfected tecnología
Las secuencias diana para ERK fueron 5'GUGCUCUGCUUAUGAUAAUTT-3 '(sentido) y 5'-AUUAUCAUAAGCAGAGCACTT -3' (antisentido). AKT siRNA fueron: 5- GACGGGCACAUUAAGAUCATT-3 (sentido) y 5- UGAUCUUAAUGUGCCCGUCTT -3 (antisentido). dúplex Scramble siRNA fueron diseñados (5- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 y 5- ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3) como control negativo (NC). Las células fueron transfectadas con 25 nM siRNAs objetivo o ARNsi de control usando Xfect agente de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la transfección se llevó a cabo durante 24 horas (para AKT y ERK). Posteriormente, el medio de cultivo se reemplazó con 1640 suplementado con 10% FBS inactivado por calor. Después de 48 h, se llevaron a cabo ensayos de MTT para evaluar la viabilidad celular.
xenoinjerto de tumor peritoneal en ratones desnudos
Desnudo ratones (BALB /c-nu) (4 semanas, 18-20 g, siempre por la Academia de Ciencias de china, Beijing) fueron divididos en tres grupos: un grupo control, un grupo de tumores y un grupo de tumores tratados con doxiciclina. Para el grupo de tumor, inyectamos células SKOV3.ip a la cavidad peritoneal de ratones a una densidad de alrededor de 8 × 10
6 /ml. Las células se resuspendieron en 400 l de medio RPMI-1640 sin suero y luego se inyectan. Para el grupo de tumor tratados con doxiciclina, después de inyectar las células tumorales durante 14 días, la doxiciclina (3 mg /ratón) era i.p. inyecta todos los días para suprimir el crecimiento tumoral. Para el grupo control, los ratones se trataron con un volumen igual de PBS. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 21 después de la primera inyección. Los ratones de peso, el tamaño del tumor y la ascitis se evaluaron en los tres grupos.
El análisis estadístico
Todos los datos se muestran como media ± S.E.M. Los experimentos se realizaron de forma independiente tres veces. Se utilizó la prueba Los estudiantes no apareados 'para dos grupos de datos. Una forma ANOVA se utilizó para comparaciones múltiples (software SPSS versión 16.0), los valores de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La doxiciclina inhibe la proliferación de células de cáncer de ovario epitelial
.
Después de 48 h de tratamiento con cisplatino y doxiciclina en diferentes concentraciones, la viabilidad celular se redujo de una manera dependiente de la dosis en HO8910 (Fig. S1A, B), SKOV3 (Fig. 1A, C) y SKOV3 /DDP (Fig. 1B, D). El IC
50 de doxiciclina en SKOV3 se comparó con la de SKOV3 /DDP. Los resultados mostraron que la IC
50 era 16,33 mg /ml en SKOV3 (Fig. 1C) y 8,53 g /ml en SKOV3 /DDP (Fig. 1D) respectivamente, que indican que las células SKOV3 /DDP eran más sensibles a la doxiciclina tratamiento que las células SKOV3.
SKOV3 (a, C) y SKOV3 /DDP (B, D) viabilidad celular se inhibió de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con cisplatino y doxiciclina. E, F mostró que co-tratamiento con cisplatino (1,5 mg /ml y 2,5 mg /ml) y doxiciclina (10 mg /ml) tenía una inhibición significativa del crecimiento en las células SKOV3 en comparación con la de cisplatino o doxiciclina tratados solo. G, H mostró que cuando se combina doxiciclina (2,5 y 5 mg /ml) con diferentes concentraciones de cisplatino, el IC
50 de cisplatino en las células SKOV3 /DDP fue 3,36 y 2,66 g /ml, respectivamente. n = 9. *,
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doxiciclina sensibiliza a las células de cáncer de ovario a cisplatino
Hemos llevado a cabo experimentos con la aplicación conjunta de cisplatino y doxiciclina.. En primer lugar se seleccionaron dos dosis bajas (1,0 y 1,5 mg /ml) de cisplatino y los combinamos con doxiciclina en dosis bajas (0-10 g /ml), respectivamente. En la línea celular HO8910, se observó una inhibición significativa del crecimiento de células 48 horas después de co-aplicación de 1,0 g /ml (Fig. S1c) o 1,5 mg /ml (Fig. S1D) cisplatino con 7,5 o 10 mg de doxiciclina /ml, mientras cisplatino tratado solo no tuvo el efecto. Los resultados similares se muestran en la línea celular SKOV3, con una inhibición significativa del crecimiento celular cuando se combinan 1,5 g /ml (Fig. 1E) o 2,5 g /ml (Fig. 1F) cisplatino con 10 mg de doxiciclina /ml. A continuación, se seleccionaron dos dosis (2,5 y 5 mg /ml) de doxiciclina y las ha combinado con diferentes concentraciones de cisplatino (0-100 g /ml), respectivamente. El IC
50 de cisplatino en presencia de doxiciclina (2,5 y 5 mg /ml) fue ml 3,36 g /ml y 2,66 g /, respectivamente (Fig. 1G, H), que era mucho menor que la de cisplatino solo (Fig. 1C, IC
50 = 10,14 mg /ml).
cisplatino y doxiciclina inhiben la capacidad invasión de células de cáncer de ovario epiteliales
el efecto de cisplatino y doxiciclina sobre la invasión capacidad de las células tumorales se examinó mediante un ensayo de invasión. En primer lugar, se seleccionaron 1,5 mg /ml y 5 mg /ml de cisplatino para el tratamiento de las células SKOV3 y SKOV3 /DDP, respectivamente. Higo. S2A, B representa la capacidad de invasión de células tumorales en presencia (c) o ausencia (d) de cisplatino en las células SKOV3 y SKOV3 /DDP. Hemos encontrado que el cisplatino tuvo un efecto inhibitorio sobre la capacidad de las células de ovario invasión. A continuación, se seleccionaron 10 mg /ml de doxiciclina para tratar las células SKOV3 y 5 mg /ml de doxiciclina para tratar las células SKOV3 /DDP. Figura 2A, B representa la capacidad de invasión de células tumorales en presencia (c) o ausencia (d) de la doxiciclina en tanto SKOV3 (Fig. 2A) y células SKOV3 /DDP (Fig. 2B). Por primera vez, se encontró que la doxiciclina podría inhibir la capacidad de invasión de las dos células SKOV3 y SKOV3 /DDP.
Las células fueron cultivadas en transwell con doxiciclina indicada por 36 células /DDP por 4 y 2, respectivamente pliegues. a: 100 l de suspensión celular libre de suero (después de células unidas) con doxiciclina tratados (10 g /ml) en filtros de inserción recubiertas; 500 l de medio libre de suero RPMI-1640 con doxiciclina (10 mg /ml) en las cámaras inferiores, las imágenes fueron fotografiados desde el lado superior de las membranas. b: 100 l de suspensión celular libre de suero en los filtros de inserción revestidos; 500 l de medio RPMI-1640 sin suero en las cámaras inferiores, las imágenes fueron fotografiados desde el lado superior de las membranas. c: 100 l de suspensión celular libre de suero (después de células unidas) con doxiciclina tratados (10 g /ml) en filtros de inserción recubiertas; 500 l 10% de FBS /medio RPMI-1640 en las cámaras inferiores, las imágenes fueron fotografiados desde el lado inferior de las membranas. d: 100 l de suspensión celular libre de suero en los filtros de inserción revestidos; 500 l 10% de FBS /medio RPMI-1640 en las cámaras inferiores, las imágenes fueron fotografiados desde el lado inferior de las membranas. c /a representa la relación de células procedentes través de la membrana de filtro de inserto con tratamiento doxiciclina. d /b representa la relación de células procedentes través de la membrana de inserto de filtro sin doxiciclina. C, D mostró que la doxiciclina inhibe la invasión de SDF-1α inducida en ambas líneas celulares y una apoptosis inducida por doxiciclina moderada en las células SKOV3 /DDP y la inhibición por la doxiciclina sobre la secreción de SDF-1α en las células SKOV3. C: SDF-1α aumentó la invasión de las células SKOV3 por 9 pliegues que fue inhibida por la doxiciclina (10 mg /ml). D: SDF-1α sólo aumentó la invasión de las células SKOV3 /DDP en 1,5 pliegues que fue inhibida por la doxiciclina (5 g /ml). n = 3, *,
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La doxiciclina inhibe la invasión de células tumorales-1α inducida por SDF en células de cáncer de ovario
SDF-1α es miembro de quimiocinas y juega un papel importante en la metástasis de cáncer de ovario [12]. Con el fin de investigar si SDF-1α podría promover la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario, que luego cambió el factor inducido (10% de FBS) a SDF-1α (50 ng /ml). Como se muestra en la Fig. 2C, SDF-1α aumentó la invasión de las células SKOV3 por 9 pliegues, lo que podría ser inhibidos significativamente por la doxiciclina. Mientras que en las células SKOV3 /DDP, SDF-1α en la misma dosis sólo aumentó la capacidad de invasión de 1,5 veces, que también puede ser inhibida por la doxiciclina (Fig. 2D).
Doxycycline induce la apoptosis de SKOV3 /DDP pero no de células SKOV3
La proporción de apoptosis fue probada en dos líneas de células después del tratamiento con 5, 10 y 20 mg de doxiciclina /ml para 12 h. Como se muestra en la Figura 3A, la doxiciclina (20 mg /ml) aumento de la apoptosis de las células SKOV3 /DDP por 13 pliegues, mientras que no tuvo efecto sobre SKOV
3 células
A:. Análisis de citometría de flujo que muestra la apoptosis de las células después del tratamiento con diferentes concentraciones de doxiciclina durante 6 h. 20 g /ml de doxiciclina aumenta la apoptosis de las células SKOV3 /DDP por 13 pliegues. B: Análisis de ELISA que muestra la doxiciclina (10 mg /ml) inhibe la secreción de la SDF-1α en las células SKOV3 de una manera dependiente del tiempo. PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western que muestra los efectos de la doxiciclina sobre la expresión de CXCR4 en ambos ARNm y los niveles de proteína en las células SKOV3 (C, E) y células SKOV3 /DDP (D, F). Después del tratamiento con doxiciclina de concentraciones indicadas durante 48 h, la expresión de CXCR4 en tanto los niveles de proteína de ARNm y se inhibieron significativamente en dos líneas celulares. n = 3. *,
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La doxiciclina inhibe la secreción de SDF-1α en las células SKOV3, pero no en las células SKOV3 /DDP
Como SDF-1α y su receptor CXCR4 juegan un papel importante en el proceso de invasión tumoral y metástasis [13], que entonces lleva a cabo el ensayo ELISA para determinar si la doxiciclina podría inhibir la secreción de SDF-1α en dos líneas celulares. Los resultados mostraron que en SKOV3, la secreción de SDF-1α se redujo significativamente por el tratamiento de la doxiciclina en una forma dependiente del tiempo, con el nivel mínimo observado en 180 min (Fig. 3B). Sin embargo, la secreción de SDF-1α no se detectó en SKOV3 /DDP.
doxiciclina disminuye CXCR4 mRNA y niveles de proteína en SKOV3 y células SKOV3 /DDP
CXCR4 podría ser activado por SDF-1α y es el único de los 14 receptores de quimioquinas expresados en un subconjunto de células tumorales en tumores de ovario y tumores primarios de ovario [14]. En nuestros experimentos, las células se trataron con diferentes concentraciones de doxiciclina durante 48 h, a continuación, CXCR4 ARNm y los niveles de proteína se examinaron por PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western. Hemos encontrado que la doxiciclina inhibe la expresión de CXCR4 en ambos mRNA (Fig. 3C. D) y los niveles de proteína (Fig. 3E, F) en ambas líneas celulares SKOV3 y SKOV3 /DDP.
cisplatino y doxiciclina inhiben la viabilidad celular a través de Akt y ERK en SKOV3 pero no en las células SKOV3 /DDP
se ha informado de que la resistencia a cisplatino de cáncer de ovario humano se relaciona con la activación de PI3K /Akt y Erk1 /2 vías de señalización [15] - [16 ], se determinó entonces la posible participación de estas dos vías en cisplatino y doxiciclina efectos sobre la proliferación de células de cáncer de ovario. Después de agotar Akt y ERK por siRNA (Fig. 4A, B), los resultados de MTT mostró que la reducción de Akt y de expresión ERK podría atenuar el efecto inhibidor de la proliferación cuando se trataron con cisplatino y doxiciclina durante 48 h en SKOV3 (Fig. 4C, D , G, H), pero no tuvo efecto sobre la proliferación de las células SKOV3 /DDP (Fig. 4E, F, I, J).
Reducción de Akt y ERK expresión de Akt y ERK siRNA podría atenuar el inhibidor efecto sobre la proliferación cuando se trataron con cisplatino y doxiciclina durante 48 (C, D, G, H) pero no tuvo efecto sobre la proliferación en las células SKOV3 /DDP (e, F, I, J) *,
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La doxiciclina inhibe la activación inducida por SDF-1α de Akt o ERK en SKOV3 pero no en SKOV3 /DDP
para determinar si inducida por SDF-1α Akt y /o fosforilación de ERK en dos líneas celulares puede ser inhibida por la doxiciclina, se realizó una serie de experimentos con pre-tratamiento. En primer lugar, se investigó la fosforilación de Akt y ERK en SKOV3 después del tratamiento SDF-1α (50 ng /ml) durante un tiempo diferente (0, 2, 5, 10, 20, 40 min). Como se muestra en la Fig. 5A, B, SDF-1α estimulados Akt y ERK fosforilación de una manera dependiente del tiempo. La Akt y ERK fosforilada fueron significativamente y alcanzaron un máximo en 10 o 20 min después del tratamiento SDF-1α. Los experimentos similares se llevaron a cabo a continuación, en SKOV3 /DDP. En particular, no hubo activación de Akt y ERK después del tratamiento de SDF-1α (datos no mostrados). Además, se acortó el tiempo de tratamiento de menos de 10 min. Todavía no se encontró ninguna activación de Akt (Fig. 5C), mientras que la activación de ERK se incrementó de 0,5 minutos y alcanzó un máximo en 1 min (Fig. 5D). A continuación, las células SKOV3 fueron pre-tratados con doxiciclina (0, 5, 10 mg /ml) durante 3 h, y luego se aplicaron con SDF-1α (50 ng /ml) durante 10 min. Se observó una inhibición de fósforo-Akt y los niveles de fósforo-ERK después de la aplicación de 10 g /ml de doxiciclina (Fig. 5E, F). Aplicación de doxiciclina solo no tuvo ningún efecto. Del mismo modo, las células SKOV3 /DDP fueron pre-tratados con la misma dosis de doxiciclina durante 3 h, y luego tratados con SDF-1α (50 ng /ml) durante 1 min. La doxiciclina no tuvo ningún efecto sobre la activación de Akt (Fig. 5G). SDF-1α inducida por la fosforilación de ERK no pudo ser bloqueada por la doxiciclina a la dosis de 5 o 10 mg /ml. (Fig. 5H).
Después del tratamiento de SDF-1α (50 ng /ml) durante 0, 2, 5, 10, 20, 40 minutos, AKT (A) y ERK (B) la fosforilación en SKOV3 se aumentaron las células. Cuando se tratan SKOV3 /DDP con la misma dosis de SDF-1α durante 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 minutos, la fosforilación de AKT (C) no cambió, mientras que la fosforilación de ERK (D) se aumentó de manera significativa. Luego, las células fueron pretratadas con 0, 5, 10 mg /ml de doxiciclina durante 3 h, después se trató con SDF-1α (50 ng /ml) durante 10 min (SKOV3) o 1 min (SKOV3 /DDP), SDF-1α- AKT inducida (e) y ERK (F) de la fosforilación en las células SKOV3 fueron sólo inhibe cuando co-aplicación con doxiciclina a dosis de 10 mg /ml. En las células SKOV3 /DDP, SDF-1α no indujo la fosforilación de AKT (G) y la fosforilación de ERK mejorado (H) no pudo ser bloqueado por doxiciclina en dosis de 5 o 10 mg /ml. n = 3. *,
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p Hotel & lt; 0,01, grupos SDF-1a tratados con
vs
grupo de control. #,
p Hotel & lt; 0,01, SDF-1a más doxiciclina grupos co-tratada
vs grupos SDF-1 tratada
La doxiciclina aumenta la expresión pro-caspasa. 3 expresión en SKOV3 /DDP pero no en SKOV3
caspasa-3 es un importante mediador de la apoptosis y también podría estar asociada con la quimiorresistencia de cáncer de ovario humano [17]. a continuación, observamos los cambios en su expresión en dos líneas de células después del tratamiento con doxiciclina. En primer lugar, se compararon Akt, la fosforilación de ERK, CXCR4 y pro-caspasa-3 de expresión entre las dos líneas celulares. Los resultados mostraron que no hubo ninguna diferencia significativa de la fosforilación de Akt (Fig. 6A). fosforilación de ERK, CXCR4 y pro-caspasa-3 en SKOV3 /DDP eran más bajos que los de las células SKOV3, respectivamente (Fig. 6B, C, D). Entonces, se trataron dos líneas celulares con 10 mg de doxiciclina /ml para el tiempo diferente (0, 0,5, 1, 2, 6, 12 h). Como se muestra en la Fig. 6E, la procaspasa-3 de expresión fue significativamente mayor en SKOV3 /DDP, mientras que no cambió en SKOV3.
Comparación de Akt, ERK, CXCR4 y la expresión de pro-caspasa-3 en dos líneas celulares. No hubo diferencia significativa de la fosforilación de Akt (A) en las dos líneas celulares. la fosforilación de ERK (B), CXCR4 (C) y 3 pro-caspasa-expresión (D) en las células SKOV3 /DDP eran más bajos que en las células SKOV3, respectivamente. Pro-caspasa-3 de expresión se incrementó significativamente por el tratamiento doxiciclina en células SKOV3 /DDP, mientras que no se modificó en las células SKOV3 (E). n = 3. *,
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La doxiciclina inhibe xenoinjerto de tumor
como un intento para determinar si la doxiciclina contribuye a la inhibición del tumor in vivo, se utilizó SKOV3.ip modelo de xenoinjerto en ratones desnudos (BALB /c-nu). Catorce días después de la inyección de las células tumorales, la doxiciclina (inyección por vía intraperitoneal) y luego se administró (3 mg /d /por ratón) durante los siguientes 7 días. Se analizaron los diámetros de los tumores, los pesos corporales y niveles de ratones de ascitis en el grupo de tumor y el grupo de doxiciclina tratados. En comparación con los del grupo de tumores, el diámetro del tumor y el volumen de ascitis se redujeron significativamente en el grupo de doxiciclina tratados (Fig. 7B, C, F, G). El grado de agregación de las células tumorales en el grupo de doxiciclina tratados (Fig. 7E) fue menor que en el grupo de tumor (Fig. 7D). Por otra parte, el peso corporal en el grupo tratado con doxiciclina fue acercamiento a la del grupo de control (Fig. 7H).
(A) A partir de la apariencia exterior, el abdomen del grupo del tumor se abulta, obviamente, (b) que la uno en el grupo de control (a) y el de la doxiciclina tratados con grupo (c). La doxiciclina inhibe el crecimiento de xenoinjerto de tumor (B, F) y el volumen de ascitis maligna (C, G) significativamente en los ratones tratados con doxiciclina tumorales en comparación con los de los ratones del tumor. (D) HE tinción mostró que el grado de agregación de las células tumorales en el grupo tratado con doxiciclina (E) fue mucho menor que en el grupo de tumores. (H) El peso corporal en el grupo del tumor fue significativamente menor que los de cualquiera de los grupos de control o grupo de doxiciclina tratados. n = 6. **,
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Discusión
El cisplatino es un fármaco quimioterapéutico para el cáncer de ovario. Además de los efectos secundarios graves, el cisplatino-resistencia es también un gran obstáculo. Combinación de algunos componentes inocuos con los medicamentos de quimioterapia es una nueva estrategia emergente para la quimioterapia del cáncer para mejorar aún más la eficacia y minimizar los efectos secundarios. La doxiciclina es ampliamente aceptado como un antibiótico. En nuestros experimentos, hemos demostrado que la doxiciclina no sólo tiene un efecto inhibidor sobre el cáncer de ovario, pero también puede mejorar drásticamente la quimiosensibilidad al cisplatino.
Sin embargo, el mecanismo subyacente todavía no está claro. Algunas investigaciones han informado de que el efecto antitumoral de la doxiciclina se asocia con diferentes niveles de p53 en el carcinoma hepatocelular [18]. Otro estudio demuestra que la doxiciclina puede inducir la apoptosis en las células de páncreas y cáncer de colon humano a través de la caspasa-dependiente manera [19] - [20]. Nuestros resultados, por primera vez, mostraron que la doxiciclina inhibe la secreción de SDF-1α en SKOV3, mientras fenómeno similar no se observó en las células SKOV3 /DDP. La investigación adicional demostró que la doxiciclina inhibe la expresión de CXCR4, tanto en los niveles de proteína y ARNm, lo que sugiere su efecto podría ser a nivel de transcripción. El análisis de Western-blot también indicó que la expresión de CXCR4 en SKOV3 /DDP fue 20% menor que en SKOV3. Estos resultados sugieren que SDF-1α /CXCR4 eje puede tener diferentes funciones en efectos doxiciclina en las dos líneas celulares. Varias explicaciones pueden contribuir a este fenómeno: 1) Tras la activación, CXCR4 puede mediar la metástasis tumoral. Las células tumorales que entran en los sistemas sanguíneos o linfáticos migrarán y se adhieren a las áreas con alta expresión de SDF-1α. células de cáncer de mama siguen este patrón de metástasis [21]. Aquí se describe que las células SKOV3 puede secreta SDF-1α y tiene una mayor expresión de CXCR4. Por otra parte, SDF-1α promueve la invasión de SKOV3 por nueve veces. Sobre la base de estos datos, hemos postulado SDF-1 /CXCR4 eje jugó un papel crítico en la metástasis de las células SKOV3 mediante el aumento de la capacidad de adhesión de las células cancerosas, pero SKOV3 /DDP no. 2) Algunos otros estudios indicaron que los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación negativa de SDF-1α o expresión CXCR4 pueden ser necesarios para la metástasis tumoral. modificación típica de SDF-1α o CXCR4 tales como la metilación del ADN está asociada con la inactivación de supresores de tumores. Hay pruebas de que la metilación del promotor de SDF-1α en el epitelio del colon promueve la metástasis de tumores en el colon [22]. Además, en el cáncer de páncreas, el promotor CXCR4 se ha encontrado para ser regulada por la metilación del ADN, lo que resulta en menores de ARNm de CXCR4 y los niveles de proteína [23].
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doi:10.1371/journal.pone.0089841.s002
(TIF)
Acknowledgments
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