Extracto
Ácido hialurónico (AH) es un hidrato de carbono de la matriz extracelular con efectos promotores de tumores en una variedad de tipos de cáncer. El presente estudio se refirió al papel de la matriz de HA para la progresión y pronóstico del cáncer de vejiga humana mediante el estudio de la expresión y función de los genes relacionados con HA.
Métodos
Las muestras de tejido de 120 pacientes con diferentes estadios del cáncer de vejiga de células transicionales, que fueron sometidos a tratamiento quirúrgico para el cáncer de vejiga en el hospital Universitario de Essen fueron analizados. los niveles de mRNA de expresión de HA sintasas (HAS1-3) y HA-receptores (RHAMM y CD44) fueron evaluados por el tiempo real de RT-PCR en comparación con tejido de la vejiga sano como control. En el análisis de regresión de riesgos de supervivencia uni y multivariante de Cox proporcional, se evaluó el impacto de los niveles de expresión génica en la supervivencia.
En
in vitro
knock-down de RHAMM, CD44 y tiene isoenzimas se logró mediante siRNA y shRNA lentiviral en células de cáncer de vejiga J82. Se analizaron las células transfectadas
en
in vitro
con respecto a la proliferación, ciclo celular y la apoptosis. Las células J82 después de la precipitación de RHAMM se xenoinjertados en masculino ratones nu /nu atímicos para controlar la progresión tumoral
en
in vivo
.
Resultados
etapas tumorales invasoras RHAMM-, HAS1 y HAS2 los niveles de mRNA de expresión fueron elevados mientras que HAS3v1 se redujo en comparación con los tumores no invasivos. Posteriormente, el análisis de Kaplan-Meier reveló redujo la supervivencia específica del cáncer de vejiga en pacientes con alto ARNm RHAMM y baja expresión HAS3v1. Elevada RHAMM en los tumores invasivos se confirmó por RHAMM inmunohistoquímica. Además, el análisis multivariado reveló que sólo la expresión RHAMM se asocia con un mal pronóstico independiente de otros factores de supervivencia (HR = 2,389; IC del 95%: 1,227 a 4,651, p = 0,01). Lentiviral RHAMM knock-down reveló reduce la proliferación de células J82
en
in vitro Opiniones y redujo el crecimiento del xenoinjerto de tumor
en
in vivo
.
Conclusión
Los datos sugieren que RHAMM juega un papel crucial en la mediación de la progresión del cáncer vesical infiltrante y recomienda RHAMM para una evaluación adicional como marcador pronóstico o diana terapéutica en el tratamiento del cáncer de vejiga.
Visto : Niedworok C, Kretschmer I, Rock K, vom Dorp M, Szarvas T, Hess J, et al. (2013) El impacto del receptor del ácido hialurónico mediada por Motilidad (RHAMM) en humanos urotelial cáncer de células de transición de la vejiga. PLoS ONE 8 (9): e75681. doi: 10.1371 /journal.pone.0075681
Editor: Nikos K Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 14 Noviembre 2012; Aceptado 21 de agosto de 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Niedworok et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la DFG Fi682 /4-1 y el Programa IFORES de la Universidad de Essen. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de células transicionales (TCC) de la vejiga es el noveno enfermedad maligna más común, con una prevalencia global de 5 años de 860,299 hombres y 249,966 mujeres [1]. En los tumores no músculo invasivo (Ta) progresión de la enfermedad con invasión muscular (T2-T4) es raro y ocurre en 3-5% de los casos [2]. Mientras que los pacientes con tumores de bajo grado invasivos no musculares genéticamente estables muestran una excelente tasa de supervivencia a los 5 años del 96%, los pacientes con muscular profundo que infiltran tumores de alto grado tienen el peor pronóstico, con una supervivencia a los 5 años de alrededor del 20% [2,3]. En exofítico, tumores de bajo grado invasivos no musculares resección transuretral (RTU) es local, preservando la vejiga, el tratamiento de elección. En el músculo tumores infiltrantes cistectomía radical con disección de ganglios linfáticos extendida pélvica es el tratamiento generalmente aceptada con intención curativa. En pacientes alternativa de tratamiento con comorbilidades graves es la quimioterapia y la radioterapia combinada. Sin embargo muscular infiltrarse en carcinomas de células transicionales de la vejiga representan un grupo heterogéneo de tumores en relación con el resultado clínico. En pacientes con pT3 /4 tumores alrededor del 50% están en riesgo de desarrollar metástasis a pesar de la cirugía extendida. Por lo tanto, es de gran importancia para dilucidar la fisiopatología de la BC y para desarrollar marcadores de diagnóstico más precisas para la progresión de este subconjunto de carcinomas musculares invasiva que confieren un alto riesgo de mortalidad específica del cáncer.
El hialuronano (HA) es un polímero de alternar N-acetilglucosamina y residuos de ácido glucurónico y es uno de los principales componentes de hidratos de carbono de la matriz extracelular (ECM). HA es sintetizado por tres HA-sintasa (HAS) isoenzimas (HAS1, HAS2, HAS3) y de que sea retenido cerca de la superficie de la célula donde se forma un HA-rico microambiente pericellular o se libera de la superficie de la célula y se deposita en la matriz extracelular. HA en sí no está transformando, pero se ha demostrado que el apoyo muchas facetas importantes del fenotipo de células malignas, tales como la proliferación, la migración y la resistencia a la apoptosis [4]. Incluso la inflamación puede ser promovida por HA formar estructuras supramoleculares, HA-cables, que se unen monocitos y linfocitos y por lo tanto se cree que aumentar la inflamación [5].
Diferentes tipos de cáncer están asociados con el aumento de las células tumorales o de células del estroma asociado HA y con la expresión diferencial de los TIENE-isoenzimas [6]. Hasta el momento no está claro si la asociación específica de TIENE isoenzimas con entidades cancerosas específicas refleja diferentes funciones biológicas de las isoenzimas tiene o es el resultado de (i) la presencia de diferentes factores autocrinos y paracrinos y /o (ii) la célula específica tipos implicados en cada entidad cáncer. Es, sin embargo, es probable que tiene isoenzimas difieren con respecto al tamaño de la HA-polímero secretada que podría evocar consecutivamente diferentes funciones biológicas [7]. El mecanismo más eficiente para modificar la duración de polímeros de alta disponibilidad son las hialuronidasas (Hyal) que se han demostrado para apoyar fuertemente la progresión tumoral mediante, generando fragmentos de HA (SHA) que son activadores de HA señalización a través de cualquiera de los receptores tipo toll o CD44. Además, sHA está implicada en la angiogénesis tumoral, que contribuye al efecto de soporte tumor de HA [8,9]. En general, HA induce la señalización celular a través de receptores de HA, tales como CD44 y el receptor de la motilidad mediada por hialuronano-(RHAMM). Ambos receptores de HA se han implicado en la progresión del cáncer probable mediante la promoción de fenotipos de células de cáncer malignas [4,10]. Especialmente, la activación de la vía de señalización ERK1 /2 y la vía PI3K podría contribuir a la promoción de tumor efectos de ambos receptores. RHAMM fue identificado como receptor involucrado en la motilidad celular durante los procesos fisiológicos y malignas [11,12]. RHAMM puede estar asociada con la superficie celular o intracelular función. RHAMM está involucrado en ECM de células inducida por la señalización a través regulación de la estabilidad de los complejos de adhesión focal [13,14] y activa Ras, Src, ERK-cinasa y la proteína-quinasa C [15]. Además, la forma intracelular de RHAMM une a mitótico husillos [16] y regula la mitosis [17]. En este sentido tanto, la sobreexpresión y la pérdida de RHAMM, causan perturbación del huso mitótico y la inestabilidad genética posteriormente [17]. Considerando que HA es el principio ligando de RHAMM, CD44 se une también varios otros ligandos tales como la osteopontina, la fibronectina o colágeno [18]. Curiosamente, en algunos casos RHAMM y CD44 parecen incluso a cooperar con respecto a la señalización [19]. Además, el AH se ha atribuido un papel en la mediación de la quimio-resistencia, ya sea mediante el control de la difusión de fármacos contra el cáncer [20] y /o afectando a los transportadores de resistencia a múltiples fármacos que median flujo de salida de xenobióticos [20,21].
BC se ha estudiado anteriormente con respecto a los genes asociados-hA hA y. Estudios previos revelaron que especialmente la isoenzima HAS1 se asocia con la progresión de la BC [22,23]. Por otra parte, la excreción urinaria de HA se estableció como un indicador de mal pronóstico en BC [24]. Recientemente, otra vez la expresión de mRNA HAS1 se asoció con BC metástasis [25]. Otro hallazgo importante es que HYAL1 tiene un papel perjudicial en BC humano y que HYAL1 está asociado con alto grado BC [26-28]. Por otra parte, la alta expresión de HYAL1 Recientemente se ha sugerido para predecir BC músculo-invasivo y recurrente progresiva y asociar con la metástasis y la disminución de la enfermedad de la supervivencia específica de [29]. En conjunto, los datos disponibles sobre la HA en BC punto de aumento de la síntesis de HA principalmente por HAS1 y la degradación de la promoción tumoral sHA por Hyal 1. A su vez, los efectos de la HA y SHA son propensos transducidas a través de la activación de los receptores de HA. En BC variantes de corte y empalme de CD44 cierto, como CD44V8-10, se upregulated y se asocia con un mal pronóstico [30,31]. Además, se ha demostrado que CD44 podría estar implicado en la respuesta angiogénica a HA en BC [22]. Sin embargo, un análisis reciente reveló que CD44v se reguló y CD44s se downregulated sin valor diagnóstico o pronóstico [30]. RHAMM se ha descrito que se upregulated pero también sin clara correlación con parámetros clínicos [25,32]. Porque parece plausible que la cantidad de HA-receptores juega un papel importante en la transducción de la señalización de HA y por lo tanto en la progresión de BC humana, el objetivo del presente estudio fue estudiar la expresión de HA-receptores y tiene isoenzimas y al conseguir información sobre el mecanismo en un colectivo de pacientes que se caracteriza por & gt;. 50% BC músculo invasivo
Materiales y Métodos
Las muestras tumorales
la expresión génica análisis se realizó en muestras de tejido de 120 pacientes con diferentes estadios de células de transición antes de Cristo (31xTa, 24xT1, 21xT2, 25xT3, 19xT4), que se sometió a tratamiento quirúrgico para el BC en las Clínicas de la Universidad de Essen entre 1990 y 2004. Todas las muestras de tejidos congelados fueron cortadas y teñidas con H & amp; e para verificar su contenido tumoral. Sólo las muestras que contienen células tumorales ≥70% se sometieron a un análisis más detallado. Además, 20 casos de carcinomas de vejiga embebidos en parafina (cuatro de cada etapa, pta-pT4) se evaluaron mediante inmunohistoquímica. El protocolo de estudio con el número 07-3537 proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de DuisburgEssen, Alemania. Cada paciente proporcionó un consentimiento informado por escrito para el almacenamiento de material tumoral congelado y parafinado fresco y los datos clínicos relevantes.
El objetivo primario de este estudio fue muerte por cáncer-específica. La causa de muerte se obtuvo de certi fi cados de la muerte. Los sujetos fueron seguidos desde la línea base (fecha de la cirugía) encuesta hasta julio de 2009. tejido de la vejiga normal se tomó de los pacientes que sufren de enfermedades no malignas (estenosis pieloureteral, vejiga neurogénica).
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó sobre muestras de BC embebidos en parafina. Para RHAMM recuperación de antígeno tinción en tampón de citrato (pH 6,2, que contiene 0,05% Tween20®) se realizó por ebullición de las diapositivas a 95 ° C durante 25 minutos. Las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios, se diluyó en 2% de BSA en PBS (de conejo anti-IgG RHAMM, 1: 100, Amsbio®, Lake Forest, EE.UU.); conejo anti-IgG Ki67, 1:25 (Novus Productos Biológicos, Ltd., Cambridge, Reino Unido). Después de la incubación con las diapositivas de anticuerpos primarios se lavaron, se bloquearon en H
2O solución 3%
2 durante 5 minutos y se incubaron con el anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa de rábano picante) durante 1 hora a temperatura ambiente y se vuelve a enjuagar tres veces durante 5 minutos. Para cada sección de control negativo de la tinción con omisión del anticuerpo primario fueron incluidos. La detección se realizó usando 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Al menos tres áreas representativas fueron fotografiados utilizando un sistema Leica® DM2000 y el análisis cuantitativo de la intensidad de la tinción se realizó utilizando el software de procesamiento de imágenes ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU.) como se describe anteriormente [33].
en tiempo real RT-PCR
ARNm fue aislado de tejido tumoral congelado instantáneamente utilizando kits de RNA total RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). La concentración de ARN se evaluó por medición fotométrica a 260/280 nm. 1 RNA g se utilizó para la síntesis de ADNc usando el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo mediante el uso de la Platinum® SYBR® verde qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) en el sistema de PCR 7300 en tiempo real (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Se utilizaron secuencias de cebador de los genes de interés como se ha descrito antes [14]. Los niveles de expresión se normalizaron a la expresión de GAPDH y se calculan utilizando el método ΔΔC
).
Cultivo de células y tumbar-HA de los genes relacionados con
se caracterizan células J82 BC células como de bajo grado de alta malignidad [34] y se obtuvieron de ATCC
® (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en condiciones de rutina en medio RPMI que contenía suero bovino fetal al 10%. Para knock-down RHAMM en las células J82 BC humanos, ARN corto horquilla (shRNA) secuencia dirigida RHAMM (5'-CCGGCGTCTCCTCTATGAAGAACTACTCGAGTAGTTCTTCATAGAGGAGACGTTTTTG-3 ') fue clonado en el vector pLKO.1 utilizando el
TM lentiviral shRNA sistema de knock-down Misión (Sigma-Aldrich
®). Revueltos shRNA se utilizó como control. Producción de vector, cultivo de células de riñón embrionario humano (HEK-293T), se realizó la cosecha de partículas recombinantes y la transducción lentiviral de células de cáncer J82 uroteliales humanos como se ha descrito antes para el derribo de RHAMM [14]. Siete días después de la transducción lentiviral de células J82 con shRHAMM la expresión de mRNA de RHAMM se redujo a menos del 40% en comparación con células J82 transducidas con controles revueltos. Posteriormente se utilizaron las células para los experimentos de xenoinjerto. La proliferación se determinó posteriormente como se describe antes [14]. En adicional
in vitro células J82
experimentos fueron tratados con siRNA para knock-down RHAMM, CD44, HAS1, HAS2 y HAS3. Para estos experimentos se utilizaron las siguientes secuencias de siRNA (Qiagen, Alemania): siRHAMM (Hs_HMMR_9); siHAS1 (Hs_HAS1_4); siHAS2 (Hs_HAS2_4); siHAS3 (Hs-HAS3_7); siCD44 (Hs_CD44_5); control (Ctrl_AllStars_1).
Para inhibir la síntesis de HA en células J82 se aplicó 4-metilumbeliferona (4-MU) disuelto en DMSO (300 M). Por otra parte, en los experimentos seleccionados exógena HA (Healon 5, Abbott) se utilizó a una concentración de 100 mg /ml.
Se analizó
Análisis del ciclo celular y la apoptosis
la progresión del ciclo celular después de knock-down de RHAMM y se expresó como porcentaje de células en G0 /G1 y la fase G2. Brevemente núcleos de células J82 se marcaron con Ciclo Guava célula reactiva (Millipore) de acuerdo con el protocolo del fabricante y las muestras se analizaron mediante un citómetro de flujo Guava easyCyte. La apoptosis se evaluó por el porcentaje de células en fase G1 sub [35]. Para PARP inmunotransferencia anticuerpo policlonal PARP (1: 1000, Cell Signaling,#9542) se utilizó como anticuerpo primario y la detección se visualizó mediante anticuerpo de cabra anti-conejo anticuerpo secundario conjugado con tinte IR 800 (1: 10.000, LI-COR Biosciences) con el uso de la zona Sistema Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Biosciences).
xenoinjerto modelo animal
Varón nu /nu atímicos (8-12 semanas de edad) fueron utilizados para los xenoinjertos de J82 Células. 100 l de PBS con-que contiene 1x10
se aplicaron 6 células tumorales subcutáneamente en ambos flancos de los animales. El crecimiento tumoral se controló durante 45 semanas. Durante este tiempo los animales fueron controlados por un excesivo crecimiento del tumor (& gt; 15 mm de diámetro), ulceraciones, marcados pérdida de peso (& gt; 20%) o signos clínicos de dolor y malestar, lo que habría sido razones para sacrificar los individuos afectados. Seis animales por grupo (knock-down y de control) recibieron las células 7 días después de lentiviral knock-down como se describe anteriormente. El crecimiento del tumor se midió con un calibre dos veces a la semana durante 45 días. Posteriormente, se sacrificaron los animales (luxación cervical), los tumores se recogieron y se fijaron para la tinción inmunohistoquímico. Se obtuvieron muestras de hígado y pulmón para buscar el crecimiento del tumor metastásico por tinción. Los experimentos se realizaron en ratones de acuerdo con las reglas y normas de la LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) y la Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. El LANUV aprobó los experimentos y confirmó el cumplimiento de normas de calidad. El proyecto se identifica con el número 87-51.04.2010.A149.
El análisis estadístico
Se analizaron los datos de expresión de genes, ya sea mediante el análisis de varianza y la post-hoc de Bonferroni prueba o por el estudiante de
t
ensayo, según proceda. Los datos se presentan como medias ± SEM. La significación estadística se asigna al nivel de
p Hotel & lt; 0.05. Los datos relativos a los resultados clínicos de los parámetros del paciente se carecía de distribución normal y por lo tanto se analizaron mediante el no paramétrico de dos colas prueba de rango suma Wilkoxon (U de Mann-Whitney) para comparaciones de grupos apareados. correlaciones etapa dependiente se calcularon utilizando la prueba de correlación de Pearson. El análisis de la supervivencia global y la supervivencia específica de la enfermedad se llevó a cabo utilizando tanto, uniforme epidemiológica y el análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox de supervivencia multivariante y la prueba de probabilidad de supervivencia de Kaplan-Meier, software de análisis estadístico IBM SPSS (versión 18.0, Chicago, IL, EE.UU.) .
resultados
Características de los pacientes
Un total de 55 pacientes sufría de enfermedad superficial (pTA y pT1), 65 pacientes fueron diagnosticados con la enfermedad músculo-invasivo (desigualmente distribuida en 21 pacientes con enfermedad pT2-25, pT3 y pT4 19). Los tumores eran de bajo grado (G1 /G2) en el 63 o de alto grado (G3) en 57 casos. Ganglios linfáticos positividad estaba presente en 23/120 pacientes. 74 pacientes sufrieron de BC primario, mientras que 46 pacientes experimentaron una recurrencia de la enfermedad. 55 pacientes fueron tratados mediante resección transuretral de la TCC, en 65 casos se realizó cistectomía radical. El nivel de tabaquismo era conocido en 83 pacientes, 49 eran fumadores y 34 eran no fumadores. La mediana del tiempo de seguimiento fue de 34 meses, el tiempo máximo de seguimiento fue de 189 meses. La mediana de la edad del paciente fue de 65 años (32-87 años). Los datos clínicos de características de los pacientes se muestran como parte de la Tabla 1.
n
RHAMM
P
CD44p
P
TIENE 1 | P
TIENE 2
P
TIENE 3v1
P
gen exp. exp valuesgene. exp valuesgene. exp valuesgene. exp valuesgene. valuesΣ = 120median (rango) mediana (rango) mediana (rango) mediana (rango) mediana (rango) Age≤ 65572,400 (0.00-13.43) 0.7620.320 (0.00-1.92) 0.2530.08 (0.0-7.55) 0.6030.51 (0.01-7.96) 0.10210.62 (0.069-50.82) 0,065 & gt; 65632.420 (0,06-14,76) 0,260 (0,00 a 1,24) 0,12 (0,0 a 103,04) 0,7 (0,0 a 13,68) 6,465 (0,0 a 35,65) GenderMale932.340 (0.00-14.76) 0.4940.305 (0.00-1.26) 0.1850.07 ( 0.0-103.04) 0.0720.52 (0.0-8.69) 0.0597.73 (0.0-34.59) 0.608Female272.570 (0,29-13,40) 0,260 (0,00 a 1,92) 0,235 (0,0 a 7,55) 1,02 (0,01 a 13,68) 6,18 (0,12 -50,82) Smokingyes492.265 (0.06-13.40) 0.0930.310 (0.02-1.65) 0.7270.08 (0.0-7.55) 0.4550.695 (0.0-13.68) 0.3158.74 (0.04-35.65) 0.777no342.860 (0.67- 14,76) 0,270 (0,00 a 1,92) 0,235 (0,0 a 103,04) 0,66 (0,02-8,69) 9,04 (0,02-50,82) Ta311.460 (0.04-7.01) 0.0270.300 (0.11-1.43) 0.20.02 (0.0-3.14) 0.0660.125 (0.01-4.43) 0.02911.43 (0.46-34.59) 0.392T1242.420 (0.19-10.12) 0.5440.205 (0.06-1.20) 0.9120.06 (0.0-0.99) 0.0520.685 (0.0-13.68) 0,78410 .62 (0.0-30.13) 0.021T2212.890 (0.00-11.86) 0.960.170 (0.02-1.03) 0.2150.21 (0.0-103.04) 0.1370.68 (0.16-8.69) 0.7974.98 (0.77-11.09) 0.613T3252 .710 (0.66-9.18) 0.4010.310 (0.00-1.92) 0.9560.64 (0.01-7.23) 0.0550.81 (0.01-7.96) 0.9395.73 (0.02-50.82) 0.529T4193.815 (0.06-14.76) 0,470 ( 0.02-1.65) 0,125 (0.0-7.55) 1,14 (0.0-2.92) 3,26 (0.12-20.61) no inv.551.685 (0.04-10.12) 0.0030.270 (0.06-1.43) 0.7440.02 (0.0-3.14) & lt; 0.0010.22 (0.0-13.68) 0.0067.675 (0.0-36.65) & lt; 0.001Invasive652.875 (0.00-14.76) 0,310 (0.00-1.92) 0,26 (0.0-103.04) 0,805 (0.0-8.69) 1,98 (0.04-50.82 ) GradeG1201.250 (0.16-3.89) 0.0210.260 (0.16-1.20) 0.3030.02 (0.0-3.14) 0.3570.155 (0.02-13.68) 0.48112.5 (0.28-29.38) 0.279G2432.445 (0,04-10,12) 0.1790.250 (0.02-1.43) 0.2240.03 (0.0-103.04) & lt; 0.0010.36 (0.01-8.69) 0.0268.875 (0.77-34.59) & lt; 0.001G3572.810 (0.00-14.76) 0,330 (0.00-1.92) 0,27 (0.02-7.55) 0,83 (0.0-7.96) 3,925 (0.0-50.82 ) Bajo grade631.770 (0.04-10.12) 0.0060.260 (0.28-0.46) 0.2430.03 (0.0-103.04) & lt; 0.0010.29 (0.01-13.68) 0.01411.09 (0.28-34.59) & lt; 0.001High-grade572.850 (0.00-14.76) 0,325 (0.00-1.92) 0,265 (0.0-7.55) 0,82 (0.0-7.96) 4,25 (0,0 -50,82) La linfa nodeN0 /Nx972.240 (0.00-14.76) 0.0050.270 (0.00-1.65) 0.5140.07 (0.0-103.04) 0.0150.61 (0.0-13.68) 0.3027.675 (0.0-35.65) 0.046N 233.970 (0,06 a 11,86) 0,430 (0,00 a 1,92) 0,405 (0,0 a 5,62) 0,93 (0,11-7,96) 1,98 (0,04-5,82) Primary742.225 (0.17-11.86) 0.0290.305 (0.00-1.92) 0.9570.125 (0,0 -7,55) 0.5750.645 (0.0-7.96) 0.4648.21 (0.0-50.82) 0.902Recurrent462.760 (0,00-14,76) 0,310 (0,00 a 1,31) 0,115 (0,0 a 103,04) 0,55 (0,0 a 13,68) 6,95 (0.02- 35.65) Tabla 1. RHAMM los niveles de expresión de ARNm son elevados en las fases del tumor músculo-invasivo, tumores de alto grado, estado de los ganglios linfáticos positivos y la recurrencia tumoral.
niveles de mRNA expresión génica de los genes asociados con HA (RHAMM, CD44, HAS1, - 2 y - 3v1) en muestras tumorales de 120 pacientes con la enfermedad antes de Cristo. La caracterización se estratificó de acuerdo con (a) la edad, el sexo y el hábito de fumar y el estadio tumoral (B), la clasificación del tumor, los ganglios linfáticos y los tumores primarios frente a la enfermedad de tumor recurrente. Los datos se analizaron mediante análisis de regresión de Cox univariante de supervivencia proporcional de peligros, n total = 120. Descargar CSV CSV
Expresión de ARNm
Para determinar su asociación con infiltración tumoral y desdiferenciación, HAS1, HAS2, HAS3v1, RHAMM mRNA y los niveles de expresión de CD44 se determinaron en BC tejidos de 120 pacientes como pliegue de tejido de control, utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR (Tabla 1, Figura 1). Como resultado RHAMM los niveles de expresión fueron elevados en los tumores infiltrantes comparación con los tumores no invasivos (RHAMM: tumores no invasivos 1,69 plegado (Ta + T1), tumores invasivos 2,88 plegado (T2-4), p = 0,003). Por otra parte, la expresión de ARNm de HAS1 y HAS2 se upregulated significativamente en las fases del tumor músculo-invasivo (pT2, pT3 y pT4). Por el contrario, HAS3v1 fue elevada en todas las etapas de tumores en comparación con tejido de la vejiga sana, pero disminuyó con el aumento de tumor en escena (tumores no invasivos 11,26 veces (Ta + T1) y los tumores invasivos 4,72 veces (T2-4), p & lt; 0,001; calculan datos como mediana). Por otra parte, CD44 no estaba regulada por incremento en comparación con los controles y no regulada con respecto al músculo invasivo.
RHAMM, CD44, HAS1, HAS2 y ARNm HAS3v1 expresión en tejido humano antes de Cristo, que se muestra como diagramas diagrama de caja en un 25% a 75% de intervalo con mínima para los bigotes máximos. En tiempo real RT-PCR (total de pacientes n = 120, los tumores no invasivos n = 55, los tumores invasivos n = 65; Ta n = 31, T1 n = 22, T2 n = 21, T3 n = 25, T4 n = 19;. n bajo grado n = 63, de alto grado = 57) guía empresas
se obtuvieron resultados similares con respecto a la clasificación de las células tumorales. RHAMM, HAS1 y de ARNm de HAS2 niveles de expresión se incrementaron significativamente en gradaciones tumorales más altas (G1 frente G2-3; RHAMM, 1,77 veces en grado bajo, 2,81 veces en tumores de alto grado, p = 0,006; HAS1, 0,02 veces en bajo grado y 0,26 veces en las muestras de alto grado, P & lt; 0,001; HAS2, 0,29 veces mayor en bajo grado y 0,82 veces mayor en los tumores de alto grado, p = 0,014). Una vez más los niveles de expresión de ARNm HAS3v1 fueron fuertemente upregulated en G1 comparación con el control, pero disminuyó con la clasificación más alta del tumor (HAS3, 10,91 pliegue de control en el bajo grado frente a 3,93 veces en los hallazgos de alto grado, p & lt; 0,001). Además, CD44 no mostró diferencias también con respecto a la clasificación de células tumorales.
Estado del nodo
linfáticos también se asoció con diferencias significativas en los niveles de expresión de varios genes. El tejido tumoral de pacientes con ganglios linfáticos positivos mostraron mayores RHAMM y ARNm HAS1 niveles de expresión en comparación con aquellos con estado de los ganglios linfáticos negativos. HAS3v1 niveles de expresión se redujo en los pacientes con estado de los ganglios linfáticos positivos (Tabla 1 B) en comparación con muestras de ganglios linfáticos negativos. Curiosamente, la expresión de ARNm RHAMM era el único gen asociado con HA que se incrementó significativamente en los tumores recurrentes en comparación con los tumores primarios.
expresión de proteínas en muestras de tumores humanos
Para caracterizar mejor la expresión de RHAMM en tinción inmunohistoquímica BC humana se llevó a cabo en 20 casos representativos (4 cada uno en el pTA-pT4). RHAMM tinción mostró células en los tumores papilares no invasivos (Figura 2 A) rara vez se tiñe. la morfología del tejido normal de la vejiga no se vio afectada en estos tumores papilares superficiales y RHAMM se encuentra predominantemente en el urotelio. Con emergente invasión del músculo, las células tumorales teñidas positivas RHAMM comienzan a formar grupos de células aisladas dentro del tejido muscular de la pared de la vejiga (Figura 2 B) y la intensidad general de tinción y de tejido de las células positivas RHAMM aumentado. En los tumores confinados invasiva y no de órganos profundos indiferenciadas en etapa histopatológico pT4, las células tumorales positivas RHAMM se distribuyen de forma ubicua en muestras de tumores humanos. Predominio de las células tumorales, sino también en menor medida las células del estroma expresadas RHAMM (Figura 2 C). RHAMM fracción de área positivo fue del 3,3% en los tumores no invasivos (PTA-1) en comparación con el 21,6% de los resultados del músculo-invasivo (pT2-4, p = 0,03, Figura 2 D). El aumento de RHAMM también se correlaciona con el aumento de la etapa del tumor (p = 0,0129, Figura 2 E).
(A-C) tinción inmunohistoquímico representante de RHAMM en el tejido humano AC incluido en parafina. (A) en las etapas tumorales no muscular invasivos T1 la estructura de la vejiga aún se conserva. (B) en el tejido de la etapa alta tumores las células malignas empiezan a proliferar y formar grupos de células independientes rodeadas por las células del estroma (pT2). (C) en las fases del tumor confinado no-órgano (pT4), la estructura de la vejiga se ve gravemente perturbado por la infiltración de células tumorales. (D) la fracción de área de las células positivas RHAMM es elevada en las etapas tumorales altamente musculares invasiva como se determina por análisis de imagen (no invasiva, n = 8; invasivo n = 12; * p = 0,03, t-test). (E) la correlación de RHAMM fracción de área positiva con etapas tumorales más altas (n = 4, * p = 0,0129, Pearson-correlación); media ± SEM.
Correlación entre la enfermedad-específica de la supervivencia y de la Expresión Génica
Los pacientes con alta y baja expresión de los respectivos genes se dividieron en dos grupos utilizando el valor de la mediana como corte apagado. Los resultados del análisis de Cox univariante se enumeran en la Tabla 2. La edad, el género y el tabaco no mostró ningún impacto en las tasas de supervivencia. Como era de esperar etapa, tumor de alto, de alta calidad y estado de los ganglios linfáticos positivos mostraron una correlación negativa significativa con la supervivencia específica de la enfermedad y, en general. De nota, los altos niveles de expresión de ARNm de HAS2 RHAMM y están significativamente asociados con la mala específica de la enfermedad y la supervivencia global. En cambio, la expresión de ARNm de alta HAS3v1 correlaciona con la supervivencia global favorable y la supervivencia específica del cáncer
Tabla 2A:.
Variables
La supervivencia global
específico de la Enfermedad de supervivencia
n
HR
95% IC
P
HR
95% IC
P
Edad
≤ 65
57
ref
ref
& gt..; 65
63
1.111
0,715-1,726
0,64
1.171
0,701-0,959 0,546
Sexo seguro Female27ref.ref. no49ref.ref Male930.6770.411-1.1150.1260.6430.362-1.1420.132Smoking. 2B yes340.8970.535-1.5050.6810.6040.322-1.1000.099Table:
Etapa
no inv. (Ta-T1) 55ref.ref. Invasivo (T2-T4) 653.4162.110-5.529 & lt; & lt 0.0015.7663.039-10.940; 0.001Grade baja grade63ref.ref. Alta grade573.1241.964-4.969 & lt; 0.0013.8342.189-6.713 & lt; estado de los ganglios 0.001Lymph N /Nx97ref.ref. N + 233.7062.198-6.250 & lt; & lt 0.0015.0662.871-8.938; 0.001Prior recurrencia Primer74ref.ref. Recurrent461.3410.848-2.1200.211.2060.705-2.0650.494Table 2C:
RHAMMlow56ref.refhigh562.4991.556-4.013 & lt; 0,001. 3.3551.887-5.965 & lt; 0.001CD44plow55ref.ref.high550.8480.533-1.3470.8480.8770.511-1.5040.633HAS 1low49ref.ref.high461.6260.983-2.6880.0581.7310.970-3.0890.063HAS 2low53ref.ref.high531.741.080- 2.8030.0231.7941.033-3.1180.038HAS 3v1low55ref.ref.high540.5650.352-0.9060.0180.5860.340-1.0110.055Table 2. En los pacientes con tumores del músculo invasivo pobre supervivencia específica de la enfermedad se asocia con alta RHAMM y la expresión del ARNm de alta HAS2 .
niveles global y supervivencia específica de la enfermedad en pacientes con TCC urotelial estratificados de acuerdo a las características del paciente (a): edad, sexo y tabaquismo (B) Los parámetros clínicos específicos de la enfermedad: la etapa del tumor, la clasificación del tumor, los ganglios linfáticos y tumores primarios frente a la enfermedad de tumor recurrente (C) asociada a los genes HA (RHAMM, CD44, Has1, - 2 y - 3v1). Se utilizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales de supervivencia univariante de Cox para el análisis de datos, el total de n = 120. Abreviaturas: HR - cociente de riesgos instantáneos, CI - intervalo de confianza, ref. - Referente. Descargar CSV CSV
Para el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de la población de pacientes se dividió en tres grupos, que consta de 40 pacientes cada uno. Cabe destacar que el aumento significativo de la mortalidad relacionada con el cáncer se asocia con la expresión de mRNA RHAMM intermedio y alto (Figura 3A). La expresión de bajos niveles de ARNm HAS3v1 también se asoció con una pobre supervivencia específica del cáncer (Figura 3E). Por el contrario, los altos niveles de expresión ha-1, y HAS-2 mostró sólo una tendencia a la disminución de la supervivencia y CD44 no se asoció con diferencias en las curvas de supervivencia específica de la enfermedad (Figura 3B-D). Para evaluar si los niveles de expresión de genes analizados proporcionan información pronóstica independiente, se utilizaron modelos de regresión multivariable de Cox de riesgos. Parámetros, que influyen en la supervivencia en el análisis univariado, se incluyeron en los modelos multivariados. Es importante destacar que se encontraron altos niveles de expresión y de los ganglios linfáticos positividad RHAMM ARNm que se asocia de forma independiente con un mayor riesgo de mortalidad específica por cáncer (Tabla 3, HR = 2,179; IC del 95%: 1,182 a 4,017, p = 0,013, y HR = 2,389, 95% IC 1,227 a 4,651, p = 0,010).
La cohorte de pacientes se dividió en tres subgrupos que consisten en alta, intermedia y baja expresión de cualquiera RHAMM, CD44, HAS1, -2 o -3 ARNm (AE). Se realizó prueba de probabilidad de supervivencia de Kaplan-Meier que muestran un aumento significativo en el riesgo de muerte por cáncer en los subgrupos de los niveles de expresión altos e intermedios RHAMM mRNA en comparación con baja expresión de ARNm RHAMM (A). los niveles de transcripción de CD44 (B), HAS1 (C) y HAS2 (D) se asociaron con cambios significativos de la supervivencia específica de la enfermedad. En particular, la alta expresión de ARNm HAS3v1 se asoció significativamente con un menor riesgo de muerte específica por cáncer en comparación con los subgrupos con la expresión del ARNm HAS3v1 bajo e intermedio (E). Los datos de un total de n = 120 pacientes; El análisis se llevó a cabo en tres grupos (n = 40 cada uno) de expresión alta, intermedia y baja de ARNm de los genes respectivos.
la supervivencia específica de la enfermedad
de supervivencia libre de metástasis-
Variables <