Extracto
Antecedentes
El carcinoma hepatocelular (HCC) es el cáncer primario de hígado que ocurre más frecuentemente y se ubica como el quinto cáncer más frecuente, en general, y la tercera causa de muerte por cáncer , en todo el mundo. En la actualidad, las opciones terapéuticas eficaces disponibles para el CHC son limitadas; en consecuencia, el pronóstico de estos pacientes es pobre. Nuestro objetivo en el presente estudio fue identificar un nuevo objetivo para la terapia con anticuerpos contra HCC.
Metodología /Principales conclusiones
Utilizamos Western blot y citometría de flujo y análisis inmunocitoquímicos para investigar la regulación de FGFR1 expresión de interferón-α /β en varias líneas celulares de cáncer hepático humano. Además, hemos probado la eficacia del tratamiento combinado con el anticuerpo monoclonal anti-FGFR1 y el interferón-α /β en un modelo de xenoinjerto murino de HCC humano. Se encontró que el interferón-α /β induce la expresión de FGFR1 en líneas celulares de HCC humanos, y que un anticuerpo monoclonal anti-FGFR1 (mAb) dirigidos de la FGFR1 inducida puede inhibir eficazmente el crecimiento y la supervivencia de células de HCC
in vitro
y
in vivo
. Por otra parte, la combinación de interferón-α, anti-FGFR1 MAB y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) ejerce un efecto antitumoral significativo
in vitro.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que el uso combinado de un anticuerpo anti-FGFR1 y el interferón-α /β es un enfoque prometedor para el tratamiento de HCC
Visto:. Sasaki S, Ishida T, M Toyota, Ota a, Suzuki H, Takaoka A, et al. (2011) El interferón-α /β y células factor de crecimiento de fibroblastos receptor Anti-1 anticuerpo monoclonal cáncer hepático en reprimir vitro e in vivo. PLoS ONE 6 (5): e19618. doi: 10.1371 /journal.pone.0019618
Editor: joven Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, República de Corea
Recibido: 9 Octubre, 2010; Aceptado: April 11, 2011; Publicado: 9 Mayo 2011
Derechos de Autor © 2011 Sasaki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica en Áreas prioritarias del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (17016060 de KI y TI); Subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (21.590.853 al SS); Grant-en-Ayudas a la investigación exploratoria de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17659218 a SS y KI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. A. Ota, M. Maeda, T. Seito son empleados de Inmuno-Biológica Laboratories Co., Ltd. Esta no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales con otros investigadores.
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es el más que ocurren comúnmente cáncer primario de hígado y se ubica como el quinto cáncer más frecuente, en general, y la tercera causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. En la actualidad, la cirugía, se emplean terapias percutáneas tales como la inyección de etanol y la ablación por radiofrecuencia, y las terapias transcatéter como quimioembolización arterial en el tratamiento de HCC. Estos enfoques pueden eliminar de forma selectiva y eliminar las células cancerosas, lo que los hace útiles para el control del tumor local; sin embargo, no son suficientes para mejorar el pronóstico de los pacientes con HCC, como la enfermedad reaparece fácilmente debido a metástasis nacido de sangre (por ejemplo, metástasis intrahepática y de infiltración vascular) o el desarrollo de nuevos HCC (carcinogénesis multicéntrica). En consecuencia, las tasas de supervivencia a 1 año y 3 años para el CHC son sólo el 36% y 17%, respectivamente [2]. Las debilidades de los actuales tratamientos de HCC incluyen la inhibición incompleta de la carcinogénesis multicéntrica, dificultades para controlar la infiltración intraportal, y la incapacidad para prevenir el deterioro de la reserva funcional hepática o fomentar su restauración. Por lo tanto el desarrollo de nuevos tratamientos que mejoran el pronóstico de los pacientes con HCC y que también se puede usar en pacientes en etapa avanzada edad avanzada y sería muy deseable.
Orientación de moléculas de superficie celular utilizando mAbs es una estrategia emergente en la terapia del cáncer, y mAbs contra moléculas de la superficie relacionados con el cáncer tales como EGFR, HER2 y CD20 se han empleado con éxito [3], [4], [5]. Sin embargo, la expresión de la superficie celular de moléculas antigénicas es a menudo débil y heterogéneo, lo que impide la selección eficaz de los tumores [6] y, hasta la fecha, sólo unos pocos estudios piloto que examinan la expresión de antígenos asociados-HCC se han realizado [7].
los interferones (IFN), que son ampliamente utilizados para el tratamiento de neoplasias y las enfermedades virales, aumentar la expresión de varias moléculas de la superficie celular tanto
in vitro
y en [8], [9 ]. La inducción de la expresión génica de IFN es un fenómeno complejo que implica la activación de genes diana a través de la fosforilación de STAT por JAK quinasa [10]. Además, IFNs pueden inducir la expresión de factores de interferón de regulación (IRF) y los factores de transcripción, que a continuación, inducen genes implicados en la apoptosis y la respuesta inmune [11]. Los IFN ya se están utilizando para tratar la mayoría de los pacientes con hepatitis, y sus efectos sugieren que la orientación moléculas de superficie celular inducidos por el IFN puede ser una estrategia útil para el tratamiento de HCC. Nuestro objetivo en el presente estudio fue utilizar líneas celulares de HCC y un modelo de xenoinjerto murino de carcinoma hepatocelular humano para examinar los cambios en la expresión génica inducida por el IFN e identificar blancos potenciales para la terapia con anticuerpos. Nuestros hallazgos sugieren IFN-α /β-inducida de crecimiento de fibroblastos receptor del factor 1 (FGFR1) podría ser una nueva diana terapéutica para el tratamiento del CHC.
Resultados
La inducción de la expresión de FGFR1 por IFN α /β en xenoinjertos de HCC
Para identificar genes regulados por el IFN en células de HCC, se realizó un análisis utilizando microarrays de ADNc preparadas a partir de los tumores desarrollados en ratones SCID por vía subcutánea administrado células HepG2, una línea celular de cáncer hepático humano. Los resultados del análisis de microarrays se resumen en la Figura 1A. Entre los genes regulados por el IFN fue
FGFR1
, que codifica un receptor tirosina quinasa. Análisis en tiempo real PCR confirmó la inducción de
FGFR1
la transcripción por tanto IFN-α e IFN-β (Figura S1), y los correspondientes incrementos en proteína FGFR1 se observaron en HepG2, células CHC4 Huh-7 y (Figura 1B -RE). A continuación, utiliza la tinción inmunohistoquímica para examinar la distribución de IFN-α FGFR1 /β inducida dentro de los tumores y se encontró que los niveles de FGFR1 se aumentaron en la membrana celular y en el citoplasma de células de HCC (Figura 1E).
a, Resumen de genes inducidos por IFN-α en líneas celulares de cáncer hepático y HepG2-xenoinjertos. La expresión de los genes inducidos por el IFN-α se examinó mediante análisis de microchips de ADN, y la expresión de
fue encontrado FGFR1
estar fuertemente inducida. B, inmunotransferencia de tipo Western que muestra IFN-α /β expresión inducida de FGFR1 en células de cáncer hepático humano. los niveles de proteína relativos se indican a continuación. Análisis de citometría de C, de flujo que muestra IFN-α /β expresión inducida de FGFR1 en las células cancerosas hepáticas humanas: negro, sin anticuerpo; verde, no IFN; Rosa, IFN-α; Azul, IFN-β. D, Western blot que muestra el curso temporal de la expresión de FGFR1 después del tratamiento con IFN-α /β. Las inmunotransferencias se realizaron utilizando lisados totales de HepG2-xenoinjertos. E, IFN-α expresión FGFR1 /β-inducida en los tejidos extirpados de HepG2-xenoinjertos. FGFR1 se tiñó usando el anticuerpo anti-FGFR1.
Desarrollo de un anticuerpo monoclonal anti-FGFR1
Hemos desarrollado novela anti-FGFR1 anticuerpos monoclonales mediante la inmunización de ratones BALB /c con un vector de expresión FGFR1 . Seis anticuerpos que reconocen FGFR1 se aislaron de los ratones, dos de los cuales, designado A2C9-1 y A2D11-1, mostraron afinidad fuerte en ELISA y se caracterizaron adicionalmente. Para los análisis cinéticos, el dominio extracelular de FGFR1 se acopló covalentemente a un chip sensor CM-5 a baja densidad (215 unidades de respuesta de FGFR1), después de lo cual se determinó los valores de Kd para A2C9-1 y A2D11-1 ser 209 nM y 7,03 m, respectivamente (Figura S2A). Por lo tanto A2C9-1 mostró la afinidad más fuerte para FGFR1. análisis de citometría de flujo confirmó que A2C9-1 reacciona con FGFR1 (Figura 2), y análisis de transferencia Western mostró que el peso molecular de la FGFR1 expresado ectópica para ser alrededor 115 kDa (Figura S2B).
análisis de citometría
de flujo que muestra el nivel de expresión de FGFR1 y la especificidad de mAb A2C9-1. A la izquierda: los gráficos muestran los resultados obtenidos con lisados de células NIH3T3 en el que M19B2 ADNc introducidos (control). A la derecha: los gráficos muestran los resultados con lisados de células NIH3T3 en el que de longitud completa se introdujo FGFR1 cDNA
Anti-FGFR1 mAb inhibe el crecimiento celular in vitro HCC
A continuación examinó. los efectos de A2C9-1 y A2D11-1 mAbs sobre el crecimiento de células de cáncer hepático (Figura 3). IFN-α mostró alguna actividad antitumoral contra las células de cáncer hepático, y la supresión del crecimiento débil se observó cuando se añadieron A2C9-1 o A2D11-1 a cultivos en ausencia de IFN-α. Por otro lado, el tratamiento con una combinación de A2C9-1 y IFN-alfa reduce significativamente la supervivencia celular, en comparación con el tratamiento con IFN-α solo (
P
= 0,01) (Figura 3). El efecto de A2D11-1 en combinación con IFN-α no fue mayor que el efecto de IFN-α solo
.
En el gráfico, se muestra la tasa de supervivencia entre las células HepG2 de HCC cultivadas en el eje vertical, y el tiempo de incubación después de la administración de los fármacos indicados se muestra en el eje horizontal. PBS es el control negativo. Los símbolos y las barras representan las medias ± SD. Tenga en cuenta que el tratamiento con una combinación de A2C9-1 y IFN-alfa reduce significativamente la supervivencia celular, en comparación con el tratamiento con IFN-α solo (
P
= 0,01).
Efectos de A2C9-1 con y sin IFN-α en un modelo de tumor de xenoinjerto de ratón
a continuación se probó los efectos antitumorales de un anti-FGFR1 mAb en un modelo de xenoinjerto de ratón de HCC humano (Figura 4A y B). En los ratones tratados con solamente A2C9-1 o IFN-α, los volúmenes tumorales no fueron diferentes del grupo de control administrado PBS. Sin embargo, el tratamiento con IFN-α + A2C9-1 tenía un efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral, aunque la supresión no fue estadísticamente significativa. Por último, en los ratones tratados con + A2C9-1 + PBMCs IFN-alfa (células mononucleares de sangre periférica), hubo un efecto antitumoral significativo, en comparación con los grupos tratados con PBS (p = 0,026), INF-α (p = 0,03) , PBMCs A2C9-1 (p = 0,014), PBMC (p = 0,022) o IFN-a + (p = 0,007). De hecho, el tumor desapareció en 2 de los 4 animales ensayados. Durante el curso de los experimentos que hemos detectado ninguna citotoxicidad contra hepatocitos normales (datos no mostrados). El análisis histológico reveló la infiltración marcada por las células mononucleares de los tejidos tumorales residuales de los ratones tratados con IFN-alfa + A2C9-1 + PBMCs, pero no se observó tal infiltración en los tejidos tumorales de los ratones en los otros grupos (Figura S3).
A, fotos representativas de injertos tumorales en ratones SCID. B, En el gráfico, los tamaños de los tumores en cada grupo (n = 4 ratones por grupo) se muestran en el eje vertical, y el tiempo transcurrido después del tratamiento con los fármacos y las células indicadas se muestra en el eje horizontal. Los símbolos y las barras son medias ± SD. C, volúmenes de los tumores después del tratamiento con los medicamentos y las células indicadas. PBS es el control negativo. Los datos son medias ± SD.
IFN mejora la acumulación de anticuerpos anti-FGFR1 mAb dentro de los tumores
Para confirmar aún más que la regresión observada de los xenoinjertos se relaciona con el tratamiento con A2C9-1 mAb, Alexa Fluor 680 A2C9-1 conjugado se inyectó en las venas de la cola de ratones SCID portadores de tumores, después de lo cual se evaluó la orientación del tumor por A2C9-1 en los mismos animales en diferentes puntos de tiempo usando un sistema de imagen óptica molecular (Figura 5A y B). En los ratones tratados previamente con IFN-α, A2C9-1 selectiva y dependiente del tiempo acumulado dentro de los tumores durante el período comprendido entre las 24 h hasta 192 h después de su administración. Por el contrario, sólo se detectaron niveles insignificantes de mAb en los ratones control administrados A2C9-1 + PBS. También confirmó que no había acumulación de un anticuerpo de control 680 conjugado con Alexa Fluor (datos no mostrados). Por tanto, parece que el IFN-α aumenta la acumulación de mAb anti-FGFR1
in vivo
, muy probablemente por hasta la regulación de FGFR1.
A, ratones SCID fueron xenoinjerto con 1 × 10
6 células HepG2, después de lo cual 50 g de Cy5 conjugado con mAb A2C9-1 se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Ratones fueron incluidas en la imagen bajo anestesia. B, Evolución temporal de la intensidad de la señal Cy5.
Discusión
En este estudio, se encontró que FGFR1 puede servir como un nuevo objetivo para la terapia de anticuerpos en el CHC. Más específicamente, el tratamiento combinado con IFN-α /β y un anti-FGFR1 MAB (A2C9-1) mostró fuertes efectos supresores del crecimiento en células de HCC humanos
in vitro
y
in vivo
. Se conocen cinco isoformas del receptor de transmembrana FGFR (FGFR1-4 y FGFR5 /1 l) que se expresa en los mamíferos [12]. Cada uno consta de tres dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina, un dominio transmembrana, y dos dominios de tirosina quinasa intracelular. FGF se une al FGFR a través de dos de los dominios de tipo inmunoglobulina (II y III). Durante expresión FGFR, splicing alternativo de
FGFR
transcripciones de empalme produce múltiples variantes con diferentes especificidades de ligandos específicos de tejido [13]. Entre ellos, FGFR1 se ha demostrado que se expresa en HCC y es conocido por promover el desarrollo de HCC en respuesta a la estimulación cancerígeno [14]. FGFR1 no se expresa en hepatocitos no cancerosos. señalización FGFR1 mediada está implicado en el crecimiento de células de cáncer y la infiltración, así como en la angiogénesis [15], que ya es un objetivo para las terapias antitumorales [16]. Además, estudios previos han mostrado elevada expresión de ligandos de FGFR, incluyendo FGF1 y FGF2, en los tejidos HCC primarios y líneas celulares de cáncer hepática [17], [18], [19], [20], lo que sugiere fuertemente la señalización de FGF desempeña una clave papel en el desarrollo de HCC. Estas características hacen que FGFR1 una atractiva diana molecular para el tratamiento de HCC.
Un problema importante con la terapia de anticuerpos contra el cáncer es la expresión débil y heterogéneo de los antígenos de la superficie celular. Para superar este problema, se examinaron los genes hasta reguladas por IFN en xenoinjertos de HCC. Hemos encontrado que la expresión de FGFR1 es inducida por IFN-α /β y que el tratamiento de células de HCC con una combinación de IFN-α /β y un anti-FGFR1 mAb inhibe eficazmente el crecimiento y la supervivencia de células de HCC. Por lo tanto, una de las razones para el efecto terapéutico insuficiente de medicamentos contra el cáncer dirigidos FGFR1 parece ser que es, sin inducción, expresión de FGFR1 en las células cancerosas no es suficiente para un tratamiento eficaz. En consonancia con esta idea, nuestro análisis inmunohistoquímico mostró expresión de FGFR1 a ser muy baja en las células no tratadas con HCC. Notablemente, epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) es también hasta reguladas por IFN [21], y esto sobre regulación de EGFR es un factor crucial que subyace a la susceptibilidad de las células de cáncer de afectados para terapia con anticuerpos anti-EGFR [22]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con una combinación de IFN y un anticuerpo pueden ser una estrategia terapéutica eficaz contra varios tipos de cáncer.
El mecanismo molecular por el que IFN-α /β induce la expresión de FGFR1 sigue siendo desconocido. Se sabe, sin embargo, que los antitumorales y antivirales efectos de IFN implican cambios en la regulación transcripcional de varios genes [23], y que los genes de IFN-inducible contiene un elemento de respuesta de interferón (ISRE) en sus regiones promotoras [24]. Mediante el uso de un programa de transcripción factor de búsqueda, se identificaron varios ISREs putativos en el 5 'UTR de FGFR1, lo que sugiere que FGFR1 podría ser un objetivo directo de IFN de tipo I (datos no mostrados). El estudio adicional será necesario determinar con precisión cómo interferón induce FGFR1.
También todavía no entendemos completamente el mecanismo molecular por el cual nuestros anticuerpos ejerció su efecto anti-tumoral, aunque hay varias posibilidades. Muchos de los objetivos expresados-tumorales de anticuerpos terapéuticos son receptores de factores de crecimiento. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR, incluyendo Cetuximab, se ha demostrado que bloquear la señalización del factor de crecimiento mediante la prevención del ligando de unión a su receptor, o mediante la prevención de la dimerización del receptor [25]. Es muy probable que A2C9-1 suprime el crecimiento de las células tumorales a través de un mecanismo similar por la orientación FGFR1 inducida por IFN. También se informó de que la unión de un anticuerpo a un receptor del factor de crecimiento da como resultado la internalización del complejo anticuerpo-receptor, y la baja regulación de la señalización aguas abajo [26]; sin embargo, se observó que no internalización A2C9-1 inducida en células de cáncer (datos no mostrados). En tercer lugar, los anticuerpos contra los receptores del factor de crecimiento también ejercen crecimiento supresión de efectos a través del sistema inmune [27]. Aquí, por ejemplo, se demostró que IFN-α /β aumenta la expresión superficial de FGFR1, tal vez que permite un efecto contra el cáncer basado en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos para acompañar a la unión de anticuerpos anti-FGFR1 mAb al receptor. Los resultados de nuestro
in vivo
experimento que muestra la importancia de las PBMC a los efectos antitumorales de A2C9-1 es consistente con la idea de que este anticuerpo estimula fuertemente la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos.
en resumen, hemos encontrado que el IFN-α /β induce la expresión de FGFR1 y que el tratamiento con una combinación de IFN-α /β y un anti-FGFR1 mAb suprime el crecimiento de células CHC
in vitro
y
In
vivo. También confirmó que el IFN-α /β aumenta la acumulación de los anti-FGFR1 mAb dentro de los tumores. Este protocolo de tratamiento inhibe selectivamente el crecimiento de células de HCC sin afectar a las células normales, lo que sugiere que podría ser utilizado en el tratamiento de HCC sin reducir el rendimiento preliminar hepática. Por lo tanto sugerimos que nuestros resultados pueden servir de base para un enfoque novedoso para el tratamiento de la HCC, para los que no existe una terapia efectiva en el momento.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y experimental animales
líneas celulares de cáncer hepático humano (HepG2, Huh-7 y CHC4) se obtuvieron de la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (Tokio, Japón) y se cultivaron como se recomienda. Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino y penicilina /estreptomicina a 37 ° C bajo una atmósfera de aire humidificado con 5% de CO
2. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de voluntarios sanos utilizando Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Suecia) y se utilizaron como células efectoras en ratones SCID. Todos los donantes previstas consentimiento informado por escrito antes de la recogida de conformidad con la Declaración de Helsinki y todos los protocolos que utilizan muestras humanas fueron aprobados por el comité de revisión institucional de la Universidad Médica de Sapporo. Whole PBMCs (1 × 10
7) suspendido en 0,2 ml de RPMI 1640 se inyectaron intraperitonealmente en cada ratón SCID. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las normas aceptadas de cuidado de los animales y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Médica de Sapporo.
Microarray análisis
Para el análisis de microarrays, las células HepG2 (1 x 10
6 células) fueron inicialmente en xenotransplantes de inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Tres semanas más tarde, cuando el tumor resultante alcanzó 6-7 mm de diámetro, IFN-α (OIF®; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokushima, Japón) se inyectó por vía subcutánea a una dosis de 2.000 U /ratón. Las muestras de tejido tumoral se recogieron antes y 24 horas después de la inyección del IFN-α. Se extrajo ARN de los tejidos recogidos utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se transcribió inversamente en cDNA utilizando Superíndice III (Invitrogen). El cDNA se hizo reaccionar el uso de genes de ADNc Navigator conjunto de filtros-humana cáncer (Toyobo, Osaka, Japón) y se sometió a análisis de microchips de ADN usando un Fluor-S Multi Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).
real-time RT-PCR análisis
HepG2 (1 × 10
6 células), las células fueron xenoinjertado por vía subcutánea en la espalda de ratones SCID. Cuando el tumor inoculado alcanzó los 10 mm de diámetro, IFN-α (OIF®) o IFN-β (Feron®; fabricado por Toray Industries, Inc., Tokio, Japón) se administró por vía intravenosa a una dosis de 2.000 U /ratón, y muestras de tejido tumoral se recogieron 0, 1, 3, 8, 24 y 48 h después de la administración. ARN total fue purificado de las muestras usando un kit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania), y un solo capítulo cDNA fue sintetizado a partir de 1 g de ARN total usando un kit primer capítulo de síntesis de cDNA (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Suecia) . análisis cuantitativo en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green I (Roche, Basilea, Suiza) con un sistema de PCR en tiempo real LightCycler (Roche). Los niveles de FGFR1 y OAS1 expresión (control) mRNA se normalizaron a la expresión de GAPDH ARNm. Los conjuntos de cebadores para FGFR1 (sentido, 5'-GGA CGA TGT GCA GAG CAT CAA CTG-3 '; anti-sentido, 5'-AAC TTC ACT GTC TTG GCA GCC GG-3'), OAS1 (sentido, 5'-CAT CCG CCT AGT CAA GCA CTG-3 '; anti-sentido, 5'-CCA CCA CCC AAG TTT CCT GTA-3') y GAPDH (sentido, 5'-GAA GAA GGT GGT CGG AGT C-3 '; antisentido , 5'-GAA GAT GAT GGT GGG ATT-TC-3 fueron sintetizados en Greiner Bio-One (Tokio, Japón). ')
Western blot
HepG2, Huh-7 o células CHC4 se incubaron durante 48 h en presencia de IFN-α o IFN-β (1000 IU /ml), después de lo cual las células se lisaron en tampón de muestra (50 mM Tris-HC1, pH 6,8, 6% de 2-mercaptoetanol, 2% de SDS, 0,004% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol). Las proteínas en las muestras de lisado se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida 7,5% y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories). Después de bloquear la membrana con 2% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, se incubó con anticuerpo FGFR1 anti-humana (sc-121, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. La mancha fue desarrollado con 0,005% de H
20
2-3, 3'-diaminobenzidina utilizando un kit de inmunoperoxidasa ABC (kit Vectastain ABC, Vector Labs, Burlingame, CA, EE.UU.).
análisis de citometría de flujo
Cuarenta y ocho horas después de la administración de IFN-α, la expresión de FGFR1 se evaluó mediante citometría de flujo. Las células en suspensión (4 × 10
5 células /tubo) se lavaron con 2 ml de tampón de lavado (0,2% de albúmina de suero bovino, 0,1% NaN
3/10 mmol /L de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4) y se centrifugó a 300
g
durante 5 min a 4 ° C, después de lo cual se eliminó el sobrenadante. El sedimento celular restante se fijó en 0,25% de paraformaldehído durante al menos 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente, se lavó dos veces con 2 ml de tampón de lavado, se incubaron durante 1 h en 70% de metanol a 4 ° C, y después se lavó de nuevo. Para examinar la expresión de FGFR1, las células fijadas se incubaron primero con el anticuerpo anti-FGFR1 (1:100 dilución) durante 1 hora a 4 ° C. Después, las células se lavaron dos veces y se incubaron durante 30 min en 4 ml de fluoresceína de cabra conjugado con isotiocianato de anti-IgG de ratón en hielo en la oscuridad. Después de lavar de nuevo las células dos veces, se suspendieron en 1 ml de tampón de lavado para el análisis utilizando un (Sistema de Becton Dickinson Immunocytometry, San Jose, CA, EE.UU.) FACScan.
Análisis de la expresión de FGFR1 en xenoinjertos de cáncer hepático humano
células HepG2 (1 × 10
6 células) se xenotransplantes en ratones SCID. Cuando el tumor resultante alcanzó los 10 mm de diámetro, IFN-α (OIF®) o IFN-β (Feron®) se administró por vía intraperitoneal o por vía intravenosa a una dosis de 100 U /g, y 24 h más tarde se recogieron los tejidos tumorales. a continuación, análisis de transferencia de Western e inmunohistoquímicos se realizaron utilizando un anticuerpo anti-humano FGFR1. (sc-121; Santa Cruz Biotechnology)
Preparación de Anticuerpos Anti-FGFR1
Un polinucleótido que codifica la región que se extiende desde amino ácido 1 hasta 822 de FGFR1 y representada por SEQ ID NO. 1 se amplificó por PCR utilizando de longitud completa FGFR1 (nº de acceso NM_000604) como molde con los cebadores 5'-No. 3 [(SEQ ID NO 3.): 5'-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3 '] y N ° 3' 3 [(SEQ ID NO 4.): 5'-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3 ']. El polinucleótido amplificado se insertó en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) para construir un vector de expresión que se administró como el antígeno inmunizante a una dosis de 50 mg /ratón en un volumen de 50 l al 1- o 2- intervalos de una semana. El antígeno para la inmunización inicial se mezcló con adyuvante completo de Freund, mientras que los antígenos para la segunda y posteriores administraciones se mezclaron con adyuvante incompleto de Freund. Spleen células monocíticas de ratón inmunizado y una pareja de fusión, X63-Ag8-653, se fusionaron mediante la fusión celular mediada por polietilenglicol, que fue seguido por la selección de un hibridoma usando el método de Kinebuchi et al. [28]. Las células que habían reaccionado con el FGFR1 inmovilizado se cultivaron en medio libre de suero GIT (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón) para producir mAbs hasta 80% de las células había muerto. Las células fueron luego eliminadas de este medio por centrifugación (1000 rpm, 15 min), y se añadió sulfato de amonio a 50% de saturación y dejaron durante la noche a 4 ° C. Los precipitados resultantes se recuperaron por centrifugación (1000 rpm, 30 min) y se disolvieron en doble diluido (Protein AMAPS kit II) tampón de unión, después de lo cual la IgG se adsorbió sobre una columna de proteína A (GE Healthcare vida Science). Después de eluir los mAbs de la columna, el eluato se dializó frente a PBS durante la noche para purificar los anticuerpos, que produjo un número de mAbs que reconocen FGFR1. Uno de estos anticuerpos monoclonales se designó A2C9-1 y se confirmó a reconocer FGFR1 por Western Blot y FACS utilizando muestras de FGFR1 expresan en células NIH3T3.
Affinity medición
La afinidad de los mAb anti-FGFR1 para FGFR1 se determinó basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando un dispositivo de Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). El dominio extracelular de FGFR1 se acopló covalentemente a un chip sensor CM-5 a baja densidad (215 unidades de respuesta de FGFR1). cinética de unión fueron entonces evaluó mediante diluciones seriadas al doble de anticuerpo en concentraciones que van desde 500 hasta 0,08 nM en tampón de desarrollo (PBS, pH 7,4, 0,005% (v /v), polisorbato 20 - filtrada y desgasificada) a 25 ° C y un flujo de velocidad de 25 ml /min. El procedimiento de regeneración consistió en tres inyecciones de 10 ml de clorhidrato de 2,5 M de guanidina, después de lo cual el chip sensor se lavó durante 5 minutos con tampón de desarrollo. Las estadísticas y el procesamiento de datos se realizaron utilizando el software de evaluación BIA 4.0.1 y GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Todos los experimentos de SPR se realizaron a Biaffin GmbH & amp; Co. KG (Kassel, Alemania).
Evaluar el efecto de anticuerpos anti-FGFR1 mAb en la célula hepática del cáncer viabilidad
Para examinar el efecto de la administración de IFN-α (OIF®) en combinación con anti-FGFR1 mAb (A2C9-1 o A2D11-1) a las células de HCC, se evaluó la tasa de supervivencia de las células HepG2 en presencia y ausencia de IFN-α y /o anti-FGFR1 mAb. células HepG2 se sembraron en los pocillos de una placa de 24 pocillos a una densidad de
/pocillo, después de lo cual, se añadió IFN-α o anti-FGFR1 mAb + IFN-α 1 × 10 4 células anti-FGFR1 mAb, y el cultivo se continuó durante 0 a 6 días. Después las células se separaron usando tripsina, y la tasa de supervivencia se evaluó mediante ensayos de MTT. medio de cultivo libre de anticuerpos se añadió como control negativo, y las células a las que se añadió nada se utilizaron como un control adicional.
experimento terapéutico con células humanas de cáncer hepático-xenotransplantes de ratón
células HepG2 ( 5 × 10
6 células /ratón) fueron xenoinjertado por vía subcutánea en la espalda de ratones CB17-scid /scid. Cuando los volúmenes de los tumores alcanzaron 100 mm
3, los ratones fueron divididos en 7 grupos de tratamiento: 1) Los ratones en el grupo de PBS recibió inyecciones intravenosas de PBS (250 l) y IgG de ratón normal (100 g). 2) El grupo de IFN-α recibieron inyecciones intraperitoneales de IFN-α (OIF®: 2000 U) y IgG de ratón normal (100 g). 3) El grupo de anticuerpos recibió inyecciones intravenosas de PBS y anti-FGFR1 mAb (100 mg; A2C9-1). 4) El grupo de IFN-α + anticuerpo recibieron inyecciones intraperitoneales de IFN-α (2000 U) y las inyecciones intravenosas de mAb anti-FGFR1 (100 g). 5) El grupo + PBMC anticuerpos IFN-α + recibieron inyecciones intraperitoneales de IFN-α (2000 U), inyecciones intravenosas de anti-FGFR1 MAB (100 mg) y la administración intravenosa de PBMC (1 × 10
7 células). 6) El grupo de IFN-α + PBMC recibieron inyecciones intraperitoneales de IFN-α (2000 U) y la administración intravenosa de PBMCs (1 × 10
7 células). 7) El grupo PBMC recibió la administración intravenosa de PBMCs (1 × 10
7 células). Los tratamientos se administraron 5 veces en total, a partir del día 0 y luego 1 semana más tarde (w1), 2 semanas más tarde (w2), 5 semanas más tarde (W5) y 6 semanas más tarde (w6). Sólo en w6, la dosis de anticuerpos se aumentó a 200 mg /ratón. Cada grupo contenía 4 animales, y el tamaño del tumor se midió como x (eje mayor) (eje menor) x 2 semanal después de la administración inicial. Los tumores se cosecharon 1 semana después del tratamiento final.
Immunophotodetection en ratones portadores de tumores
HCC células humanas HepG2 (1 × 10
6 células) se xenoinjertado en la espalda de ratones SCID . Tres semanas más tarde, cuando el tumor inoculado había alcanzado alrededor de 10 mm de diámetro, IFN-α (OIF; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) a una dosis de 20.000 U /ratón o PBS (control) se administró por vía intraperitoneal. Después de 24 h, 50 g de Alexa Fluor 680-conjugado anti-FGFR1 mAb se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Los ratones fueron incluidas en la imagen bajo anestesia utilizando un sistema de imágenes IVIS LUMINA (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE.UU.).
Apoyo a la Información
Figura S1.
Inducción de
FGFR1
transcripciones de IFN-α e IFN-β. células HepG2 (1 × 10
6 células) se xenoinjertado por vía subcutánea en la espalda de ratones SCID. Cuando el tumor inoculado había alcanzado 10 mm de diámetro, IFN-α o IFN-β se administró por vía intraperitoneal o por vía intravenosa a una dosis de 2.000 U /ratón. Los tejidos tumorales se recogieron después de 0, 1, 3, 8, 24 y 48 h después de la administración. A, curso de tiempo de FGFR1 y OAS1 (control) la expresión de ARNm después de la administración de IFN-α. FGFR1 ARNm (línea azul) se incrementó 3 h (151%), 8 h (202%) y 24 h (119%) después de la administración. OAS1 mRNA (línea roja) se incrementó 3 h (162%), 8 h (133%) y 24 h (150%) después de la administración. Se muestran las medias de dos muestras idénticas del tiempo real RT-PCR. B, curso de tiempo de expresión FGFR1 y mRNA OAS1 después de la administración de IFN-β. FGFR1 ARNm (línea azul) se incrementó 8 h (348%) y 24 h (337%) después de la administración, mientras que OAS1 ARNm (línea roja) se incrementó 3 h (262%) y 8 h (511%) después de la administración. Los niveles de expresión de ARNm se normalizaron a la de GAPDH ARNm.