Extracto
El cáncer de pulmón es una de las enfermedades más letales con una alta tasa de recurrencia y metástasis, que es probablemente debido a la existencia de células madre del cáncer de pulmón (células madre cancerosas). CSC en muchos tumores, incluyendo cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) han sido identificados usando CD44 molecular de adhesión, ya sea individualmente o en combinación con otro marcador (s). Los microARN (miARN) regulan tanto las células normales madre y células madre cancerosas y la desregulación de miRNAs se ha implicado en la tumorigénesis. Recientemente, se descubrió que el miR-34a para ser regulados a la baja en las células NSCLC, pero las funciones biológicas de miR-34a en la regulación del comportamiento de células NSCLC no han sido ampliamente estudiados. Aquí nos muestran que la transfección de sintético miR-34a, pero no el control negativo oligonucleótidos (NC) miARN (oligos) en tres líneas celulares de cáncer, es decir, A549, H460 y H1299, inhibió su formación holoclone, la expansión clonogénico, y la regeneración del tumor en vivo. Por otra parte, la sobreexpresión mediada por vector lentiviral de miR-34a en CD44 purificado
hi H460 células también excrecencia tumoral inhibido. Por el contrario, la expresión de miR-34a antagomirs (es decir, oligos antisentido) en el CD44
lo H460 células promueve el desarrollo de tumores. Nuestro estudio muestra que el miR-34a es un regulador negativo de las propiedades oncogénicas de células de NSCLC y CD44
hi células madre cancerosas de pulmón, y establece un fuerte fundamento para el desarrollo de miR-34a como un nuevo agente terapéutico contra el NSCLC.
Cita: y Shi, Liu C, Liu X, Tang DG, Wang J (2014) el microARN miR-34a inhibe el crecimiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y el CD44
hi células madre-Como NSCLC. PLoS ONE 9 (3): e90022. doi: 10.1371 /journal.pone.0090022
Editor: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Noviembre 2013; Aceptado: 24 Enero 2014; Publicado: 4 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81141096 y Grant Nº 81.372.512) y el Fondo de Proyectos llave de Shanghai Ciencia y Tecnología de la asociación, China (subvención Nº 05.119.554) a J. Wang, y el NIH (R01- CA155693), Departamento de Defensa (PC120817), CPRIT (RP120380), y el Centro MDACC de Epigenética del cáncer y el ARN Centro-Laura & amp; John Arnold Fundación otorga a la DG. Espiga. C. Liu fue apoyada, en parte, por una beca posdoctoral del Departamento de Defensa (PC121553). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
células madre del cáncer (CSC), es decir, las células de cáncer con ciertas propiedades de células madre, se han reportado en muchos tumores humanos y se cree que es responsable de la iniciación del tumor, resistencia a la terapia, la progresión, la recaída y la metástasis [ ,,,0],1] - [3]. Los microARN (miARN), ARN pequeños no codificantes, regular alrededor del 20% -30% de los genes en el genoma humano, y se han implicado en la regulación de la proliferación, la diferenciación, la migración, y la apoptosis a través de la inhibición de la traducción de proteínas y /o la inducción de la degradación del mensajero mediante la unión a las secuencias complementarias de la región 3 'no traducida (3'-UTR) en sus ARNm diana [4], [5]. miRNAs pueden actuar como ambos oncogenes y genes supresores de tumores [6], [7], y han surgido como importantes reguladores de células madre cancerosas, así
.
El microARN-34a (miR-34a) funciona como un supresor de tumores [ ,,,0],8] y se downregulated en algunos cánceres humanos, incluyendo el cáncer de mama [9], cáncer de próstata [10], osteosarcoma [11], y el cáncer de pulmón [12], [13]. El cáncer de pulmón es la neoplasia maligna más letal en todo el mundo. El trabajo en los últimos años indica que tanto células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) contienen células madre cancerosas [14], [15]. Como en la mayoría de otros tumores, potenciales células madre cancerosas de pulmón se han enriquecido y se purificó usando ensayos funcionales [16] - [18], así como marcadores de superficie celular tales como CD133, CD34, CD90, y CD44 [3]. CD44 es una glicoproteína de membrana que media una compleja gama de funciones. Algunos estudios han demostrado que el CD44
+ células se enriquecen de la capacidad de propagación del tumor y que CD44 es un marcador potencial CSC en NSCLC [19]. Liu
et al
han demostrado que el miR-34a puede inhibir células madre cancerosas de la próstata y metástasis mediante la represión directa CD44 [20]. Identificación de CD44 como diana directa y funcionalmente relevante miR-34a revela una vía de señalización poco apreciado anteriormente [20].
Aunque hay pruebas de que el miR-34a se reduce en el CPNM, las funciones biológicas de este miARN en el CPNM siendo escasamente investigado. En este estudio, usando una variedad de ensayos biológicos combinados con experimentos de xenoinjertos de tumores extensos, nos informan de que el miR-34a regula negativamente las propiedades asociadas-CSC, así como la capacidad iniciadoras del tumor de tres células de NSCLC.
Materiales y Métodos
Animales y experimentos con animales
inmunodeficientes NOD-SCID ratones (graves diabéticos no obesos con deficiencia inmune combinada) se produjeron en su mayoría de nuestras propias colonias de cría y se mantuvieron en condiciones estándar de acuerdo con la directrices institucionales. Todos los estudios relacionados con los animales de este proyecto han sido aprobados por el M. D. Anderson Cancer Center IACUC (Institucional Cuidado de Animales y el empleo; ACUF#08-05-08132). La investigación actual no involucra sujetos humanos (es decir, las personas que viven o información privada identificable). Todos los otros estudios presentados en este informe fueron la iniciada por el investigador y no requieren la aprobación de otros organismos reguladores.
Las células y los procedimientos experimentales básicos
Las tres líneas celulares de cáncer humano (A549, H460, H1299 y ) se obtuvieron de ATCC. Todas las células se mantuvieron en medios recomendados por ATCC suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Las células se incubaron en un incubador humidificado a 37 ° C se suministra con 5% de CO
2. Las células se mantuvieron rutinariamente en 75 cm
2 frascos de cultivo de tejidos (Corning Incorporated, EE.UU.) y se recogieron usando tripsina al 0,05%. La mayoría de los procedimientos experimentales básicos se han descrito en nuestras publicaciones anteriores [20], [21].
La transfección transitoria con oligonucleótidos sintéticos (oligos)
Estamos transfectadas las células a granel o el CD44 purificado
+ células de NSCLC con 33 nM de miR-34a o no director de control de miARN (miR-NC) oligos negativos (Ambion, Austin, TX) usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Alternativamente, transfectadas las purificados CD44
- células de NSCLC con 33 nM de anti-miR-34a (anti-34a) o oligos contra-miR-NC (anti-NC) (Ambion). Por lo general, recogieron las células transfectadas in vitro o para los estudios in vivo después de cultivar durante 48 h.
sobreexpresión mediada por Lentiviral de miR-34a
Un vector lentiviral que codifica pre-miR-34a (Lenti -34a) y el vector de control (lenti-CTL) se obtuvieron a partir de sistemas de Biociencias (OSI) [20]. Lentivirus fue producido en 293FT células de empaquetamiento y los títulos determinados para GFP usando células HT1080. células de NSCLC se infectaron a una MOI de 25 en presencia de 8 mg /ml de polibreno y se recogieron 48-72 h post-infección.
RT-PCR cuantitativa
miARN maduro y CD44 mRNA niveles se cuantificaron utilizando TaqMan ensayos microARN (Applied Biosystems) [20]. Brevemente, el ARN total fue aislado utilizando el kit de aislamiento de Mirvana PARIS miRNA (Ambion). los datos de expresión de genes miARN cuantitativos se normalizaron a miRNAs internos 'limpieza', es decir, el miR-24 y miR-103. los datos de expresión de ARNm cuantitativos se normalizaron a 'limpieza' de ARNm interna, es decir, GAPDH. Las diferencias entre el es decir, los valores DDCT, para cada uno de los miRNAs o mRNAs fueron convertidos a porcentaje de expresión utilizando la fórmula 2
-ddCt [20].
ensayos clonales y clonogénico positivo y poblaciones negativos correspondiente,
Para los ensayos de holoclone [22], nos chapado en células de NSCLC con una densidad clonal (es decir, 50 células /pocillo) en una placa de 6 pocillos, se contaron el número de holoclones varios días más tarde, y presentan el porcentaje de Las células que establecieron un holoclone la eficacia de clonado. Para los ensayos clonogénicos [20], en primer lugar, mezclamos metilcelulosa (MC) con medio libre de suero suplementado con 5 mg ml-1 de insulina, 20 ng ml-1 EGF y 10 ng ml-1 bFGF (Sigma). A continuación, hacemos enchapado en células generalmente a 1.000 células /pocillo en mezcla MC en relación 1:10 en 24 pocillos de ultra bajo de fijación (ULA) y placas de colonias enumerados 2-3 semanas después de la siembra. Para todos los experimentos anteriores, se corre un mínimo de pocillos por triplicado para cada condición y repetimos los experimentos siempre que sea posible.
La citometría de flujo y análisis de células activadas por fluorescencia (FACS)
La expresión de marcadores de CSC se evaluó por citometría de flujo. Las células se tiñeron en vivo en la solución de tinción que contenía BSA y FITC-conjugado monoclonal anti-CD44 (clon#G44-26; BD Bioscience) o conjugado con PE monoclonal anti-CD133 (clon#AC133; Miltenyi Biotech) a la concentración recomendada por el fabricantes. Correspondientes isotipo inmunoglobulinas de ratón se utilizaron como controles negativos (BD Bioscience). Se analizaron al menos 10.000 células. Para la clasificación de células, el etiquetado de los marcadores de superficie celular se realizó en condiciones esterilizadas y las células fueron ordenadas según la BD FACSVantage Cell clasificador (BD Bioscience). El 10% más brillantes se tiñe y se seleccionaron los 10% de células teñidas más tenue de fondo como las poblaciones positivas y negativas, respectivamente. Clasificación de pureza de más del 90% se aseguró para su posterior in vitro e in vivo. Todos los datos fueron analizados mediante el software FlowJo (versión 7.6.1).
Aldefluor ensayo
El kit de ensayo Aldefluor (Aldagen, Inc. Durham, Carolina del Norte) se utilizó para el perfil de la aldehído deshidrogenasa ( ALDH) actividad en las células de NSCLC [23]. Las células se incubaron en tampón de ensayo que contiene el Aldefluor ALDH sustrato de proteína BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA) durante 40 min a 37 ° C. Las células que podrían catalizar BAAA a su producto fluorescente BODIPY aminoacetato (BAA) se consideraron ALDH
+. Ordenación de Puertas de FACS se extrajeron con relación a la línea de base de fluorescencia células, que se determinó mediante la adición del inhibidor específico diethylaminobenzaldehyde ALDH (DEAB) durante la incubación y muestras tratadas con DEAB sirvieron como controles negativos. Las células no viables se identificaron mediante yoduro de propidio (PI) positividad. Las células fueron ordenados por BD FACSVantage Clasificador células.
experimentos de trasplante del tumor
Las células se inyectaron en 60 l de mezcla de medium:Matrigel (01:01) por vía subcutánea (sc) en ratones NOD /SCID ( 6-8 semanas de edad). Estamos transfectadas H460 mayor, A549 o células H1299 con miR-34a o oligos miR-NC (33 Nm). 48 h más tarde, tres dosis diferentes de células en 500 000, 50 000, o 5000 se implantaron. Para células H460, 2 millones de células adicionales cada uno (n = 7) fueron implantados. Además de la transfección oligo, también infectados algunas células con lenti-34a o lenti-CTL vectores (MOI 25) [20], y, 48 h después, tres dosis de células a 500.000, 50.000, 5.000 fueron implantados. Por último, transfectadas purificados H460 células CD44
he aquí con anti-34 o oligos contra-NC (33 nM) y también infectada purificado CD44
hi H460 células con Lenti-34a o vectores lenti-CTL (MOI 25). 48 h más tarde, se implantaron células a diferentes dosis. El crecimiento tumoral se controló semanalmente y los volúmenes tumorales individuales se midieron usando un calibrador digital y aproximada de acuerdo con la fórmula V = 1 /2ab
2 (a ser el diámetro largo y el diámetro corto b del tumor). Al final de los experimentos, los ratones fueron sacrificados y se recogieron los tumores, medidos y fotografiados.
El análisis estadístico
Hemos utilizado no apareado de
t-test
de Student de dos colas comparar las diferencias en el número de células, la eficiencia de clonación, pesos de los tumores, y otros parámetros relacionados. Se empleó el test de Chi-cuadrado para comparar la incidencia y la latencia. Se utilizó ANOVA (F-test) para comparar las diferencias en varios grupos. En todos estos análisis, un
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados y Discusión
miR-34a inhibe la formación de células NSCLC holoclone y la capacidad clonogénico
.
miR-34a se ha demostrado que poseen funciones de tumor supresor [8], [20], [21], [24] - [33] y estar bajo-expresado en algunos tumores, así como ciertas subpoblaciones tumorigénicos [ ,,,0],10], tales como CD44
+ células madre cancerosas de próstata [20]. miR-34a es un objetivo directo de p53 [32] y su promotor es silenciada en algunas células del cáncer [30]. Ha habido una cierta evidencia experimental de que el miR-34a está regulado por disminución en las células NSCLC [12], [13]. Para dilucidar el potencial consecuencia biológica de la pérdida de la expresión miR34a en las células NSCLC, primero transfectadas tres células de NSCLC, A549 (p53 de tipo salvaje), H460 (p53 de tipo salvaje), y H1299 (p53 mutante), con madura sintético miR 34a o oligos miR-NC (33 nM) [20] durante 48 h, y luego se sembraron las células por triplicado a una densidad clonal (es decir, 50 células /pocillo) en placas de 6 pocillos. Luego se evaluó la formación de holoclones, que se han demostrado que el puerto auto-renovación de células madre cancerosas que se puede propagar a largo plazo tumores [22], 12 días (d) después de la siembra. Como se muestra en la Figura 1 (A-C), miR-34a sobreexpresión inhibió significativamente establecimiento holoclone en los tres modelos de NSCLC. De importancia, aunque el miR-NC transfectaron células de NSCLC formaron grandes y holoclones muy juntas, las células transfectadas con CPNM miR-34a fundada mucho más pequeñas y /o menos compacta paraclones (véase la Figura 1B para ejemplos). Posteriormente, se realizó, ensayos más rigurosos, independientes de anclaje clonogénicos en metilcelulosa (MC), que han sido ampliamente utilizados para medir la actividad de las células autónoma de potenciales células madre cancerosas [3]. Al igual que en los ensayos clonales, la sobreexpresión de miR-34a inhibió en gran medida la capacidad de formación de esferas de mayor A549, H460 y H1299 células (Figura 1D-E).
(A-C) ensayos clonales. Las células transfectadas con miR-34a o oligos miR-NC (33 nM) se sembraron por triplicado a 50 células /pocillo en placas de 6 pocillos. El experimento se terminó en 12 d y los pocillos se Giemsa-manchado (A). Se muestra en B son imágenes representativas. Los resultados mostrados en A y B eran representativos de dos experimentos independientes. (C) la presentación cuantitativa de los resultados en A. Las barras representan la media ± S. D. (D-E) ensayos por clonación en MC. Un total de 1.000 células por pocillo se colocaron en placas para el ensayo clonogénico. Las fotografías fueron tomadas en el día 15 después de la siembra y se muestran en D son campos representativos. (E) la presentación cuantitativa de los resultados en D. Las barras representan la media ± S. D.
Los resultados experimentales anteriores proporcionan evidencia de que la restauración de la expresión de miR-34a en las células NSCLC inhibe ambas propiedades clonales y clonación. Como las células de NSCLC 3 poseen diferente estado de p53, los resultados también sugieren que los efectos inhibidores de miR-34a son independiente de p53. Como era de esperar, las células transfectadas con los oligonucleótidos de miR-34a mostraron de manera espectacular aumento de los niveles de miR-34a tal como se evaluó mediante análisis de qPCR de madura miR-34a (Figura 2A). Curiosamente, sin embargo, los 3 tipos de células de NSCLC muestran una amplia variación en los niveles incrementados miR-34a, con células H1299 de retención la mayor cantidad de exógena miR-34a 48 h después de la transfección (Figura 2A). Como se discutió anteriormente, miR-34a es una diana transcripcional directa de p53 [32] y H1299 células tienen p53 mutante. Una posibilidad es que los niveles tanto de p53 y miR-34a en células de cáncer de pulmón deben ser estrictamente controlada. En consecuencia, en las células A549 y H460 que tienen p53 de tipo salvaje, p53 incluso introducido exógenamente se degrada rápidamente mientras que en las células H1299 p53 mutante, los oligos madura miR-34a transfectadas sobreviven mucho más tiempo (Figura 2A).
(A) células de NSCLC recién transfectadas con oligos miR-34a mostraron niveles miR-34a varios órdenes de magnitud más alta que las transfectadas con oligos miR-NC. Las células de NSCLC indicadas fueron transfectadas con miR-34a o oligos miR-NC, y 48 h más tarde, se recogen y se utilizan en los experimentos tumorales (abajo) mientras que un pequeño número de células se dejaron de lado y se utiliza en la medición de QRT-PCR de miR los niveles de ARNm de 34a. Se muestran los niveles de miR-34a medias (en escala logarítmica; n = 2) en las células transfectadas miR-34a en relación con los de las células transfectadas miR-NC (valores medios reales indicados en los bares). (B-D) miR-34a oligo transfección inhibido el crecimiento del tumor A549. (Números de los tumores desarrollados /de las inyecciones;%) indicadas son la incidencia del tumor, tiempo de cosecha (incluyendo las fechas de inyección y terminación reales), el peso medio del tumor (en gramos), y los
P valores Opiniones de pesos de los tumores. imágenes de tumor macroscópico no están a la misma escala. (E-G) miR-34a oligo transfección inhibe el crecimiento del tumor H460. (H-L) miR-34a oligo transfección inhibido el crecimiento del tumor H1299.
Evidencia que la sobreexpresión de miR-34a también inhibe el desarrollo de tumores
A continuación, evaluaron los posibles efectos de inhibidor de tumores miR-34a en los tres tipos de células de NSCLC in vivo (Figura 2). Estamos transfectadas 33 nM de miR-34a o oligos miR-NC en células A549 durante 48 horas y entonces se implantan 50.000 (50 K) células por vía subcutánea (s.c.) en NOD inmune deficiente /ratones SCID. Como se muestra en la Figura 2B-D, las células miR-34a transfectadas desarrollaron tumores que sólo había alrededor de la mitad de los tamaños de los tumores de miR-NC y la antigua también creció más lentamente. Cabe señalar que la diferencia de pesos de los tumores no fue estadísticamente significativa debido a los relativamente pequeños tamaños de muestra. Del mismo modo, la sobreexpresión de miR-34a células H460 desarrolló mucho más pequeñas y tumores de crecimiento más lento en comparación con el miR-NC transfectaron células H460 (Figura 2E-G). células H460 infectadas con un vector lentiviral miR-34a (es decir, lenti-34a) también se regeneran más pequeños y más lentos que los tumores de crecimiento de las células infectadas por el control de vectores (Figura S1 A-C). Es importante destacar que la sobreexpresión de miR-34a en las células H460 redujo la incidencia de tumores (75% en el miR-NC vs. 50% en el miR-34a,
P Hotel & lt; 0,01; Figura 2E). Por último, se realizó un ensayo de tumor limitando dilución mediante la implantación de 5 k, 50 k, o 500 k de miR-NC o miR-34a transfectaron células H1299 en ratones NOD /SCID y en cada dosis de células que observaron tumores que crecen más pequeños y más lentos derivan desde el miR-34a sobreexpresan las células en comparación con los tumores de miR-NC transfectadas las células H1299 (Figura 2H-L). Una vez más, la sobreexpresión de miR-34a reduce la incidencia de tumores en dos dosis de células implantadas (es decir, 5 K y 500 K,
P Hotel & lt; 0,01; Figura 2I). De hecho, el miR-34a transfectaron células H1299 exhibieron significativamente menor frecuencia iniciadoras del tumor (TIF) que los controles de miR-NC correspondiente (
P
= 4.64E-179) como se determina mediante el uso de la función Limdil del paquete Statmod (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html). Los efectos inhibidor de tumores relativamente más fuertes de miR-34a en las células H1299 con respecto a la incidencia de tumores están probablemente relacionados con niveles mucho más altos de miR-34a exógeno en células H1299 transfectadas (Figura 2A).
Al igual que en el caso de las células A549, las diferencias en los pesos tumorales en miR-34a vs. miR-NC transfectadas H460 y H1299 células no alcanzó significación estadística, probablemente debido a los tamaños de muestra relativamente pequeños (Figura 2E y 2I, respectivamente), que es un muy común fenómeno en tales ensayos de tumores de xenoinjertos. Otra explicación plausible es que los oligos transfectadas se convirtieron gradualmente degradados in vivo, como hemos observado repetidamente en experimentos similares utilizando tumorales miR-34a [20] y let-7 [21] oligos. En apoyo, los tumores residuales derivados de células transfectadas miR-34a no mostraron aumento de miR-34a (datos no se muestra) en contraste con recién transfectadas las células (Figura 2A). Una observación interesante fue que las células H1299-p53 mutante conservan niveles significativamente más altos de exógena miR-34a (Figura 2A), que también parecía manifestar los efectos más fuertes inhibidor de tumores en esta línea celular (comparar Figura 2I vs Figura 2B y 2E ).
sobreexpresión de miR-34a inhibe CD44
hi H460 regeneración del tumor mientras que los anti-34a promueve el crecimiento tumoral en CD44 purificado
lo H460 células
fuerte evidencia experimental
ha habido que miR-34a puede manifestarse efectos inhibidor de tumores de células madre cancerosas de orientación [10], [20], [21] y los cultivos de células de NSCLC se ha demostrado que el puerto células cancerosas madre-como [3], [14] - [19]. Por lo tanto, nos preguntamos si los efectos biológicos de miR-34a en las células NSCLC 3 (Figura 1 y 2) podría estar relacionado con su acción sobre las células cancerosas madre-similares. Para abordar esta cuestión, primero se determinó el porcentaje de células positivas para Aldefluor, CD44, CD133 y, ensayos o marcadores utilizados con frecuencia para enriquecer células madre cancerosas de pulmón. Hemos observado ~1-2% Aldefluor H460 positivo y las células H1299, que fueron en gran medida 'ablated' en presencia de la DEAB inhibidor de ALDH (Figura 3). Por razones desconocidas, varios experimentos repetidos mostraron que & gt; 90% de las células A549 se Aldefluor-positivas y este porcentaje no se vio afectada por DEAB (Figura 3). Prácticamente 100% de A549, las células H460 y H1299 eran CD44-positivos (valores medios de ser 97.2%, 99.3% y 99.2%, respectivamente; n = 3) (Figura 3). Por el contrario, casi no hubo expresión de CD133 en estas tres líneas celulares de cáncer (Figura 3C). Es interesante que estos ensayos pueden identificar poblaciones superpuestas de células madre similares a NSCLC como ALDH purificada
hi células H1299 exhibieron mayores niveles de ARNm de CD44 (Figura S1D). En estudios preliminares, se implantó 5 K o 10 K purificadas células ALDH
HI y la ALDH correspondiente
lo H1299 en ratones NOD /SCID. En 5 k, la ALDH
HI y ALDH
células Lo desarrollaron 4/5 (1,22 g, 0,32 g, 0,24 g, y 0,12 g) y 1/7 tumores (0,99 g), respectivamente. A los 10 k, la ALDH
HI y ALDH
Lo células desarrollaron 3/8 (0,36 g, 0,2 g, 0,1 g) y 1/8 de los tumores (0,03 g), respectivamente. Estos resultados preliminares sugieren que los ALDH
hi células H1299 poseen mayor capacidad de regeneración del tumor, un importante rasgo de CSC.
(top) El ensayo Aldefluor en 3 células de NSCLC. muestras tratadas con DEAB sirvieron como controles negativos. ~1-2% De células H460 y H1299 eran Aldefluor-positiva, mientras que & gt; 90% de las células A549 fueron Aldefluor-positivo. (Medio) Representante flujo citometría de perfil de expresión de CD44 (FITC) en 3 células de NSCLC. Prácticamente 100% de A549, las células H460 y H1299 eran CD44-positivos (valores medios de ser 97.2%, 99.3% y 99.2%, respectivamente; n = 3). (Abajo) Citometría de flujo análisis de la expresión de CD133 (PE) en las células 3NSCLC. Casi no hubo expresión de CD133 en estas tres líneas celulares de cáncer.
En las células de cáncer de próstata PC3, casi 100% de las células son positivas para CD44 [34]. Sin embargo, existen células PC3 que expresan niveles muy altos de CD44 de la superficie celular (es decir, CD44
hi) y los bajos niveles de CD44 (es decir, CD44
lo). De importancia, CD44
hi células PC3 demostraron el potencial clonogénico clonales y significativamente más altos que los isogénicas CD44
células PC3 he aquí [34]. Sobre la base de esta analogía, purificamos a cabo CD44
hi (es decir, superior al 10%) y CD44
lo (es decir, inferior al 10%) H460 células (Figura 4A). Como era de esperar, el CD44
hi células H460 expresan altos niveles de CD44 mRNA de la LO H460 células CD44
(
P = 0,0009
) (Figura 4B). Sorprendentemente, lentiviral mediada por la sobreexpresión de miR-34a en el CD44
hi células H460 significativamente inhibió el crecimiento tumoral (Figura 4 C, E, y F). Más impresionante aún, los antagomirs anti-miR-34a [20] promovidos drásticamente la tasa de crecimiento de la regeneración del tumor y el tumor de CD44
lo H460 células en las tres dosis de células (100 k, 10 k, y 1 k) prueba (Figura 4D , G-J).
(A-B) el nivel de expresión de CD44. (A) diagramas representativos de citometría de flujo análisis de CD44 expresión (FITC) en células H460. (B) los niveles de ARNm de CD44 en células purificadas hi H460 CD44
y CD44
lo evaluados por QRT-PCR. (C, E, F) sobreexpresión de miR-34a en CD44 purificado
hi H460 células de la infección lentiviral regeneración tumoral inhibido. (C) indicados son la incidencia de tumores (tumores desarrollados /número de inyecciones;%), tiempo de cosecha (incluyendo las fechas de inyección y terminación reales), el peso medio del tumor (en gramos, F), y los
valores de P para
pesos de los tumores. imágenes de tumor macroscópico no están a la misma escala. (E) La curva de crecimiento del tumor. (D, G-J) anti-miR-34a promueve el crecimiento del tumor de CD44 purificado
lo H460 células. (D) indicados son la incidencia de tumores (tumores desarrollados /número de inyecciones;%), tiempo de cosecha (incluyendo las fechas de inyección y terminación reales), el peso medio del tumor (en gramos, G), y los
valores de P para
pesos de los tumores. imágenes de tumor macroscópico no están a la misma escala. (H-J) La curva de crecimiento del tumor en tres dosis diferentes de células.
En resumen, hemos demostrado que la sobreexpresión de miR-34a inhibe la formación de células NSCLC holoclone y expansión clonogénico in vitro y, sobre todo, tumor la regeneración in vivo. Estos efectos inhibitorios de miR-34a puede ser debido a sus efectos sobre las células madre de NSCLC similar. En apoyo de esta posibilidad, la expresión forzada de miR-34a específicamente en CD44
hi H460 células inhibidas en gran medida su actividad regeneradora del tumor mientras que los antagonistas de miR-34a promoverse de manera espectacular la regeneración del tumor en CD44
lo H460 células. Estas observaciones son consistentes con CD44 siendo un objetivo directo y funcional de miR-34a en la próstata [20] y algunos otros tipos de cáncer [31] las células y sugieren que miR-34a regula negativamente la capacidad iniciadoras de tumores de NSCLC en los CAC. El trabajo futuro se tratará de dilucidar los mecanismos subyacentes y las interacciones entre el miR-34a y la expresión de CD44 en las células NSCLC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
miR-34a inhibe el crecimiento del tumor H460 y ALDH
hi células H1299 expresar niveles más altos de ARNm de CD44. (A-C) Lentiviral mediada por la sobreexpresión de miR-34a en células H460 inhibió el crecimiento del tumor. (A) Los pesos de los tumores de punto final. (B y C) las curvas de crecimiento del tumor en dos dosis diferentes de células. (D) Los niveles de ARNm de CD44 en
HI y correspondientes ALDH
lo H1299 células purificadas ALDH evaluados por QRT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090022.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecemos T. Davis para la asistencia en todos los experimentos tumorales y P. Whitney para FACS. Agradecemos también a otros miembros del laboratorio Tang útil para los debates y apoyo.