Extracto
Nuclear receptor de co-represor (N-CDR) juega un papel importante en el control transcripcional mediada por varias proteínas supresoras de tumores. Recientemente, se informó de un papel de la pérdida dependiente de la conformación mal plegadas (MCDL) de N-CDR en la activación de la vía de supervivencia oncogénica en la leucemia promielocítica aguda (APL). Desde la N-CDR desempeña un papel importante en la homeostasis celular en varios tejidos, por lo tanto, la hipótesis de que un APL como MCDL de N-CDR también podría estar involucrado en otros tumores malignos. De hecho, nuestra selección inicial de la condición de la N-CDR en varias células de leucemia y tumores sólidos reveló un APL como MCDL de N-CDR en células tumorales primarias y secundarias derivadas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La pérdida específica N-CDR de células NSCLC podría ser bloqueado por Kaletra, un inhibidor de la proteasa de grado clínico y por la genisteína, un inhibidor de la N-CDR misfolding previamente caracterizado por nosotros. El mal plegada N-CDR presentado en las células NSCLC estaba vinculado a la amplificación de estrés ER y fue sometido a la degradación por la actividad de la proteasa aberrante de células específicas de NSCLC. En las células de NSCLC, mal plegada N-CDR se ha encontrado para ser asociado con Hsc70, una chaperona molecular para chaperón autofagia mediada (CMA). La inhibición genética y química de Lamp2A, una tasa de factor de la CMA limitante, bloqueó significativamente la pérdida de N-CDR en células de NSCLC, lo que sugiere un papel crucial de CMA en la degradación de N-CDR. Estos hallazgos identifican un papel importante de la degradación inducida por el CMA del mal plegada N-CDR en la neutralización de estrés ER y sugieren un posible papel de la proteína mal plegada N-CDR en la activación de la vía de supervivencia oncogénica en células de NSCLC.
cita: Ali AB, Nin DS, Tam J, M Khan (2011) el papel de acompañante mediada por la autofagia (CMA) en la degradación de la proteína mal plegada N-CDR en células no pequeñas cáncer de pulmón microcítico (CPNM). PLoS ONE 6 (9): e25268. doi: 10.1371 /journal.pone.0025268
Editor: Michael Sherman, Universidad de la Escuela de Medicina de Boston, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de mayo de 2011; Aceptado: 30 Agosto 2011; Publicado: 23 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Ali et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas SSCC-04-06 y NMRC /1213/2009 de MK de Singapur Consorcio de células Madre y el Consejo Nacional de Investigación médica de Singapur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
factores de transcripción y sus afines co-factores son los principales reguladores del desarrollo de las células epiteliales y se encuentran entre los blancos más frecuentes de insulto oncogénica en diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de pulmón [1] - [4]. Control transcripcional impartida por receptor co-represor nuclear (N-CDR) juega un papel importante en la función de supresión de crecimiento de varias proteínas supresores de tumor [5], [6]. La desregulación de la N-CDR control transcripcional mediada debido a una pérdida dependiente de conformación mal plegada (MCDL) de N-CDR ha sido implicado en la patogénesis de la leucemia promielocítica aguda (APL) [7], [8]. Curiosamente, también se encontraron algunos de los factores de transcripción y cofactores que se identificaron inicialmente como los reguladores de la hematopoyesis normal estar implicado en la regulación del crecimiento y desarrollo normal de las células epiteliales del pulmón [2] - [4]. Este hallazgo sugiere que una considerable superposición también puede existir en el mecanismo que subyace a las hemopatías malignas y cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad y morbilidad relacionada con el cáncer en humanos en todo el mundo. Con una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 15%, que es considerado como uno de los cánceres más mortales en humanos. Sobre la base de criterios histopatológicos conocidas en la actualidad, el cáncer de pulmón se clasifica ampliamente en dos subtipos principales: cáncer de pulmón de células no pequeñas [9], [10] y el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) [11]. NSCLC, que se compone de 80% de todos los cánceres de pulmón en humanos, se subdivide en los adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas adenoescamosos, y carcinomas de células grandes [12]. A pesar de ser la principal causa de la mortalidad humana y la movilidad, se sabe muy poco sobre el mecanismo subyacente a la transformación y crecimiento maligno de células que forman el grueso de la masa tumoral en el cáncer de pulmón. Esto se debe en parte a la falta de comprensión clara del mecanismo de supervivencia oncogénico que sustenta el crecimiento de células malignas en el nutriente agotado y microambiente estresante presentó ampliamente dentro de la masa sólida de tejido cáncer de pulmón.
receptor nuclear co-represor (N-CDR) es un componente vital de un represor multi-proteína esencial para la función compleja de muchos factores de transcripción y proteínas supresoras de tumores [13] - [16]. Dado que el control transcripcional impartida por factores como la N-CDR se cree que está involucrado en la regulación del crecimiento y desarrollo normal de las células en diferentes subtipos de tejidos, por lo tanto, la hipótesis de que un APL como MCDL de N-CDR también podría estar vinculado a la oncogénico el crecimiento de otros tumores humanos. Para probar esta hipótesis, se analizó el estado de N-CDR en células tumorales derivadas de leucemia humana importante y tumores sólidos y observamos una pérdida dependiente de conformación misfolded selectiva de N-CDR en varias líneas de células tumorales y tejidos de cáncer de humanos primarios derivados de NSCLC. En las células de NSCLC, mal plegada N-CDR se ha encontrado para ser asociado con Hsc70, una chaperona molecular para chaperón autofagia mediada (CMA). La inhibición genética y química de CMA dio lugar a la estabilización de la N-CDR en las células NSCLC, lo que sugiere un papel crucial en la pérdida de CMA N-CDR. Estos resultados ilustran un posible papel de la degradación de la autofagia mal plegada N-CDR en la neutralización de estrés ER, así como en la supervivencia y el crecimiento de las células de NSCLC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón utilizados en este estudio fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en medio recomendado por ATCC. La genisteína, cloroquina y la nicotina se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.), mientras que fue Kaletra de Abbott Laboratories (IL, EE.UU.). N-CDR (C-20), PDI y anticuerpos HSC-70 fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra la lámpara-2A (Abcam Inc, MA, EE.UU.) y β-actina (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) fueron adquiridos de fuentes respectivas. Se preparó recombinante marcada con FLAG N-CoR a partir de células 293T transfectadas [17] con N-CDR plásmido de expresión (vinculado con dos secuencia de bandera en tándem) con el Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza). El dúplex N-CDR y siRNA de control descrito anteriormente [18], [19] se sintetizaron con modificación menor en la secuencia N-CDR (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), y se transfectaron usando el reactivo oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU. ).
primaria muestras de tumores de pulmón humanos y las matrices tisulares
Ten diagnóstico histológico de muestras de NSCLC humanas primarias se obtuvieron desde el repositorio de tejido de la Universidad Nacional del hospital-Universidad Nacional de Singapur (NUS) Nuh-con la aprobación de la Universidad Nacional de Singapur-Junta de Revisión Institucional (IRB-NUS). Estas muestras fueron instantánea congelada dentro de los 40 minutos (en promedio) de la resección quirúrgica y se almacena a -80 ° C. cáncer de pulmón humano matriz de tejido BC04012 se adquirió de Biomax (US Biomax Inc, Maryland, EE.UU.) y se tiñó con la N-CDR (C-20) de anticuerpos usando el sistema de tinción ABC (Santa Cruz, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
tiempo de semi-cuantitativo y real el ensayo de PCR
El ARN total se aisló con RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). De cada muestra, 2 g de ARN se convirtió en ADNc por oligo (dT)
18-priming transcripción reversa utilizando superíndices II RT Kit de primeros Strand (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se describe por el fabricante. El cDNA fue objeto de análisis por PCR semi-cuantitativa usando el sistema de Taq polimerasa AccuPrime (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El análisis en tiempo real PCR se llevó a cabo utilizando el sistema de ensayo Expresión Génica Taqman® (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) y C
t valores se registraron utilizando el sistema de PCR en tiempo real ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, CA, USA) .
el análisis de PCR en tiempo real los datos
los datos se analizaron usando el comparativo C
t método que se utilizó la línea celular SAEC como muestra de referencia y el gen HPRT se utilizó como el control del gen endógeno. Los datos se representa en un gráfico de barras que trazan en escala logarítmica con una base de 10. nivel de expresión de N-CDR en diversas líneas de células se calculó en relación al nivel de N-CDR en SAEC [20] Las células que se ponen a 0. Los datos representados se obtiene a partir de la media de 3 experimentos independientes.
ensayo in vitro de la escisión N-CDR
extractos celulares en bruto que contiene proteasas activas se obtuvieron mediante la incubación, las células de cáncer de pulmón o de pulmón primario humana crio-conservados cáncer de los tejidos en tampón RSB [10 mM Tris (pH 8,0), NaCl 10 mM, MgCl 3 mM
2, 0,1% NP-40] a 4 ° C durante 10 min y los núcleos se separaron por centrifugación. Los sobrenadantes se recogieron y el contenido de proteína se determinó posteriormente. sustrato N-CDR fue preparado por transfección de células 293T con la Bandera de etiquetado plásmido N-CDR. ensayo de escisión optimizado se realizó en NaCl 300 mM, Tris 50 mM (pH 8,0), a 37 ° C para varios duración de tiempo. La reacción se terminó por calentamiento a 50 ° C en tampón de muestra SDS, y las proteínas se resolvieron con SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF para transferencia Western.
inmunoprecipitación
Dos enfoques se han diseñado para detectar la interacción física entre la N-CDR y Hsc70. En un enfoque, la proteasa empobrecido fracciona de HPLC y de H2170 células se incubaron con la bandera de etiquetado N-CDR en tampón IP [40 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, MgCl 0,75 mM
2, 0,25% NP-40] durante 5 minutos con rotación a 4 ° C. Se añadieron Anti-Flag perlas de gel de afinidad M2 (Sigma) y se incubaron adicionalmente durante 2 horas con rotación a 4 ° C. En segundo enfoque, vehículo o tratados con Kaletra H2170 células (en 5 mM durante 96 horas) se sometieron a ultrasonidos en tampón de lisis [NaCl 150 mM, 0,5% de NP40, EDTA 1 mM, Tris 20 mM (pH 7,4), mM NaF 1, 1 Na mM
2VO
4, 20 mM β-glicerolfosfato, 1,5 mg /ml de IAA, cóctel inhibidor de la proteasa] durante 10 s. Los lisados se aclararon por centrifugación y posteriormente se incubaron con Hsc70 o anticuerpos de control durante 2,5 horas con rotación a 4 ° C. Proteína G perlas se añaden seguidos por 1,5 rotación horas a 4 ° C. Los inmunoprecipitados se resolvieron en gel de SDS-PAGE y N-CDR y Hsc70 fueron detectados por Western Blot.
inmunofluorescencia tinción
Las células se colocan en un portaobjetos de vidrio usando centrifugación cytospin, se fijaron con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas utilizando 0.2% de Triton X-100 en PBS a 4 ° C. Las células fijadas se tiñeron posteriormente con anticuerpos primarios relevantes seguidos de FITC o anticuerpos secundarios conjugados con rodamina (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). ADN se tiñó con DAPI (sondas Invitrogen molecular) y las señales de fluorescencia se capturaron mediante microscopía confocal.
solubilidad de la proteína de ensayo
ensayo de solubilidad N-CDR se realizó como se ha descrito previamente con algunas modificaciones [8 ]. brevemente Brevemente, las células se sometieron a ultrasonidos en tampón de lisis celular [mM Tris 50 (pH 8,0), MgCl 5 mM
2, NaCl 100 mM, 0,5% NP-40 y el inhibidor de la proteasa cóctel] y se mantuvo en hielo durante 30 minutos. Las fracciones solubles e insolubles se separaron a través de centrifugación a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. La fracción insoluble se trató con ADNasa I durante 30 minutos a 37 ° C. Las fracciones solubles e insolubles fueron resueltas por SDS-PAGE y se tiñeron con anticuerpos anti-N-CDR (C-20).
lisosomal ensayo de captación de
Los lisosomas se aislaron de las células H2170 utilizando el lisosoma Kit de enriquecimiento (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). El ensayo de absorción de lisosomal, usando la bandera de etiquetado N-CDR como sustrato, se realizó esencialmente como se describe en otro lugar [21]
Resultados
pérdida post-transcripcional de la N-CDR en las células tumorales. derivado de NSCLC
Análisis del estado de N-CDR en diversas células de cáncer de pulmón reveló una aparente pérdida de la N-CDR a nivel de proteína en varias líneas de células tumorales derivadas de NSCLC, pero no en DMS-79; una línea celular derivada de SCLC (fig. 1A, información de apoyo S1). Un patrón similar de pérdida de N-CDR también se observó en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas normales (SAEC) después del tratamiento con nicotina, el agente cancerígeno ampliamente relacionado con el cáncer de pulmón (Fig. 1B). La pérdida de la N-CDR observado en las células NSCLC era más probable un evento post-transcripcional desde el nivel de la N-CDR transcripción, según lo determinado por PCR en tiempo real, no fue significativamente las reguladas en comparación con su nivel en las células SAEC DMS-79 o (Fig. 1C). patrón idéntico de pérdida de N-CDR a nivel de proteínas también se observó en nueve de cada diez confirmado histológicamente las células NSCLC humanas primarias, lo que sugiere que la pérdida de la N-CDR no fue un evento exclusivo limitado a líneas celulares de cáncer (Fig. 1D, información de apoyo S1) . La pérdida N-CDR observado en células H2170 podría ser bloqueado por Kaletra, un inhibidor de la proteasa del VIH grado clínico y un inhibidor documentada de crecimiento de células de NSCLC (Fig. 1E) [22]. pérdida de N-CDR también fue bloqueada por la genisteína (Fig. 1F), un inhibidor de la N-CDR misfolding previamente caracteriza por nosotros [23]. Este hallazgo sugiere que la pérdida de mal plegada N-CDR podría ser causalmente ligada al crecimiento y la supervivencia de las células NSCLC
A & amp.; B, Nivel y la integridad de longitud completa de proteínas N-CDR en varias células de cáncer de pulmón se determinó mediante ensayo de Western Blot. Nivel de β-actina se determinó como control experimental. DMS-79 se deriva de SCLC mientras que los restos de células se derivan de NSCLC. B, se determinó Nivel de longitud completa de proteína N-CDR en SAEC tratados con nicotina durante 48 horas en una forma dependiente de la dosis. C, Nivel de N-CDR transcripción en líneas celulares utilizadas en la Figura 1 A & amp; B se cuantificó mediante PCR en tiempo real. La identidad de las células utilizadas en la figura 1A & amp; C se presenta en la información de apoyo S1. D, Nivel de larga duración proteína N-CDR de cada diez confirmado histológicamente las células NSCLC humanas primarias se determinó en el ensayo de Western Blot con anticuerpos N-CDR. La identidad de las muestras humanas se presenta en la información de apoyo S1. E y F, nivel de proteína N-CDR intacto en H2170 células tratadas con Kaletra (E) o genisteína (F) se determinó se determinó en el ensayo de Western Blot.
La estabilización de la N-CDR por la genisteína sugiere que la pérdida específica N-CDR celulares de cáncer fue probablemente provocada por el mal plegamiento como ya se observó en la LPA. Para confirmar esto, se determinó la conformación de la proteína N-CDR estabilizada por Kaletra o genisteína. En conformación nativa, N-CDR se limita al núcleo y permanece soluble en tampón que contiene detergente orgánico; mientras que en la conformación plegada incorrectamente, N-CDR se convierte en insoluble y se transloca al retículo endoplasmático [7], [8]. Se han utilizado estos criterios para determinar si la N-CDR que fue sometido a la degradación en células de NSCLC se mal plegada. Una parte significativa de N-CDR estabilizada por Kaletra se encontró en la fracción insoluble de las células H2170, lo que sugiere que las células H2170 albergaban una proteína mal plegada N-CDR (Fig. 2A). Por otro lado, N-CDR estabilizada por genisteína fue en gran medida de detergente soluble, lo que sugiere que la genisteína podría rescatar el nativo conformación N-CDR (Fig. 2B). Una parte importante de N-CDR en células epiteliales normales de las vías respiratorias pequeñas (SAEC) se encontró en la fracción soluble, mientras que en las células de SCLC derivados DSM-79, N-CDR era en gran parte insoluble (Fig. 2C). Coherente con la conclusión del ensayo de solubilidad, N-CDR muestra una distribución predominantemente citosólico en múltiples células NSCLC derivados (Fig. 2D, la señal roja) e histológicamente confirmado secciones de tejidos humanos de NSCLC primario (Fig. 2E, paneles 2-6). Por el contrario, la N-CDR se localizó principalmente en el núcleo en las células epiteliales de pulmón humano normal (Fig. 2E, el panel 1) y en células SAEC (Fig. 2F, paneles de la izquierda). La nuclear de la N-CDR encuentra en las células SAEC se transloca a la sala de emergencia después del tratamiento de nicotina, lo que sugiere que la nicotina puede desencadenar la N-CDR mal plegamiento (Fig. 2F, paneles de la derecha). En conjunto, estos hallazgos sugiere que la N-CDR que fue sometido a la degradación en las células NSCLC era más probable una proteína mal plegada
A, B & amp.; C, Solubilidad (S) /insolubilidad (I) de N-CDR o β-actina en Kaletra (A) o genisteína (B) tratado H2170 células, así como en las células SAEC DMS-79 o (C), se determinó por ensayo de solubilidad de la proteína. D, la distribución subcelular de N-CDR (señal roja) en NSCLC (H2170, H1299, H358, H596, H650, H1869 y H1666) y SCLC (DMS-79), las células se determinó por el ensayo de inmunofluorescencia realizado con el anticuerpo N-CDR. ADN (señal azul) fue teñido con DAPI. E, la distribución subcelular de N-CDR en confirmado histológicamente secciones de tejido de NSCLC primario humanos (paneles 2-6) y sección de tejido de pulmón humano normal (panel 1) se determinó por inmunohistoquímica (IHC) ensayo realizado con el anticuerpo N-CDR. La tinción de color marrón en el citosol señalado por la flecha negro representa la señal N-CDR (paneles 2-6). N-CDR tinción en la sección normal de tejido pulmonar es visible como puntos negros superpuestos el núcleo (panel 1). El segundo panel muestra una sección transversal que contiene tanto el tejido de cáncer (mitad izquierda) y tejido de pulmón normal (derecho medio) de lado a lado. F, la distribución subcelular de N-CDR y PDI en las células SAEC tratados con vehículo o nicotina durante 48 horas se determinó por microscopía confocal.
específica pérdida N-CDR de células NSCLC está vinculada a retículo endoplásmico (ER ) el estrés
En la LPA, la pérdida de la N-CDR fue el resultado de la UPR citoprotector que fue mediado por la actividad de la proteasa aberrante de células específicas de APL que eventualmente protegido células APL de la apoptosis inducida por el estrés ER [7]. Para investigar si la pérdida de la N-CDR en las células NSCLC también se vio facilitada por la actividad de la proteasa aberrante similares, se realizó un ensayo de escisión N-CDR optimizado. En este ensayo, marcado con FLAG N-CDR expresó ectópica en células 293T se incubó con el extracto de H2170 células, una línea celular derivada de NSCLC que exhibió la pérdida de la N-CDR, o DMS-79 células, una línea de células SCLC derivados que no lo hicieron exhibir cualquier pérdida N-CDR, y el nivel de N-CDR digerido durante esta incubación se determinó a través de ensayo Western Blot. Bandera de etiquetado N-CDR incubó con el extracto de células H2170 se digirió de manera dependiente del tiempo y un fragmento N-CDR escindida de 100 kDa fue generado (Fig. 3A, carriles 6-8), mientras que N-CDR-Flag incubó con el extracto de células DMS-79 no se digirió (Fig. 3A, carriles 2-4). Curiosamente, la actividad de escisión de N-CDR presentado en H2170 células fue completamente desactivado por ebullición, lo que sugiere que la actividad puede ser un calor proteasa lábil (Fig. 3A, carril 9). Según se observó con NSCLC derivada H2170 células, extractos de dos células de NSCLC humanas primarias, en las que no se detectó larga duración N-CDR, actividad contenida que digiere completamente la proteína N-CDR bandera de etiquetado (Fig. 3B). actividad de escisión de la N-CDR-lábil al calor idéntica se encuentra también en otras tres células de NSCLC representante HLF-a, H23 y H1650 (Fig. 3C).
A, las células H2170 albergan actividad de escisión de la N-CDR. Procesamiento de Bandera de etiquetado N-CDR incubaron con los extractos de DMS-79 (carriles 2-5) o H2170 (carriles 6-9) células para la duración como se ha mencionado se determinó por el ensayo de Western Blot realizado con el anticuerpo de la bandera. El extracto cargado en los carriles marcados como "cocido" se calentó a 100 ° C durante 10 minutos antes de la incubación. Un volumen igual de tampón carente de extracto de células se utilizó en el carril marcado como "buffer". La flecha marca la posición del fragmento escindido 100 kDa N-CDR. B, Bandera de etiquetado de procesamiento N-CDR incubó con los extractos de las tres primeras células NSCLC humanas primarias (Tabla 2) se determinó por Western Blot con anticuerpos de la bandera. C, ensayo de escisión N-CDR, utilizando extractos de células de NSCLC HLF-a, H23 o H1650, se realizó esencialmente como se describe en la leyenda de la Figura 2A. D, nivel de estrés ER en diversas células de cáncer de pulmón se analizó mediante la determinación de los niveles de GRP-78 y PDI (basal y HMW: peso molecular alto). E, N-CDR localizada a ER se visualizó por tinción H2170 células con N-CDR (rojo) y PDI anticuerpos (verde). El ADN se tiñeron con DAPI (azul). F, Nivel de PDI en H2170 o DMS-79 células expuestas a trepar o N-CDR siRNA se determine Blot (panel superior) occidental. La eficiencia knock-down N-CDR en cada subconjunto de células fue confirmada por el ensayo de RT-PCR (paneles inferiores). G, nivel de transcripción en las células PDI SAEC tratados con nicotina durante 48 horas, se determinó mediante análisis de RT-PCR.
Siguiente para probar si las células NSCLC específica pérdida de N-CDR estaba vinculado al estrés ER como se observa en la LPA, el nivel de estrés ER a través de células de NSCLC se comparó con la de las células DMS-79 mediante la medición de los niveles de proteínas GRP78 y PDI, dos marcadores de buena fe de estrés ER [24], [25]. Los niveles de GRP78 y PDI, tanto normal como una variante de alto peso molecular (HMW) específicamente se encuentran en las células sometidas a estrés ER, fueron significativamente más altos en todas las células de NSCLC que exhibían pérdida de N-CDR, mientras que estas dos proteínas eran casi indetectables en DMS-79 las células (Fig. 3D). Un posible papel de mal plegada N-CDR en la amplificación de estrés ER fue sugerido por la co-localización de la N-CDR y PDI en H2170 células (Fig. 3E), y por la reducción del nivel de PDI después de la N-CDR desmontables (Fig . 3F). Por otra parte, el tratamiento de las células con la nicotina SAEC a una concentración que provocó la pérdida de la N-CDR llevó a un máximo nivel de regulación de la PDI, lo que sugiere que la pérdida de la N-CDR inducida por la nicotina también podría estar relacionado con el estrés ER (Fig. 3G). Estos hallazgos sugieren colectivamente una relación entre la pérdida de N-CDR y la amplificación de estrés ER en las células NSCLC. También sugirió que la degradación del mal plegada N-CDR puede haber contribuido a la atenuación del estrés ER y la eventual protección de las células de NSCLC de ER apoptosis inducida por el estrés que se encuentran previamente en APL.
mal plegada N-CDR se degrada a través chaperón autofagia mediada
para obtener más información sobre el mecanismo subyacente a la pérdida de la N-CDR y de entender la consecuencia funcional de la pérdida de la N-CDR, decidimos identificar las proteínas que pueden tener asociados con mal plegada N-CDR proteínas antes de su degradación. Para lograr este objetivo, un ensayo de co-inmunoprecipitación especialmente diseñado se realizó utilizando extracto citosólico de la proteasa-agotado de células H2170 y la bandera de etiquetado N-CDR expresó ectópica en células 293T. Bandera de etiquetado N-CDR incubó con el extracto citosólico de la proteasa-agotado de las células H2170 se inmunoprecipitó con anticuerpo bandera y la identidad de las proteínas asociadas con la N-CDR se determinó por espectrometría de masas (MS), después de su separación en SDS-PAGE. Curiosamente, de varias proteínas co-precipita con Bandera de etiquetado N-CDR, uno fue identificado como Hsc70 (Fig 4A.), Una chaperona molecular esencial para la translocación de sustratos específicos CMA a los lisosomas [26] - [28]. Para probar la asociación directa entre la N-CDR y Hsc70, una alícuota del extracto citosólico de la proteasa-agotado de H2170 células se incubó con el extracto de células 293T transfectadas con el plásmido N-CDR bandera de etiquetado, y el nivel de Hsc70 precipitó con N-CDR se determinó en el ensayo de Western Blot. cantidad significativa de proteínas Hsc70 (Fig. 4B, panel superior) fue co-precipitado junto con la Bandera de etiquetado N-CDR (Fig. 4B, panel inferior) precipitada por anticuerpos de la bandera. La asociación entre la N-CDR y proteínas Hsc70 se confirmó en el ensayo de co-inmunoprecipitación realizado con los extractos de vehículo o Kaletra tratado H2170 células (Fig. 4C). Por otra parte, en el ensayo de inmunofluorescencia indirecta, se observó significativa co-localización entre la N-CDR y Hsc70, lo que sugiere su asociación in vivo en células H2170 (Fig. 4D).
A, se purificó en columna extractos citosólicos de H2170 Las células se incubaron con la bandera de etiquetado N-CDR ectópica expresada en células 293T. N-CDR se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-bandera y proteínas co-precipitado con N-CDR se resolvieron en SDS-PAGE, se cortó y su identidad fue determinada por la EM. B, La asociación entre la Bandera de etiquetado N-CDR y Hsc70 fue ratificado en ensayo de co-inmunoprecipitación realizado esencialmente como se describe en la leyenda de la figura 4A. Después de la detección de Hsc70 co-precipitado con anticuerpo Hsc70 (panel superior), la membrana se volvieron a sondar con el anticuerpo indicador para cuantificar la cantidad de proteína N-CDR precipitado (panel inferior). En los carriles "Entrada", se cargó una alícuota del extracto de células enteras. C, Hsc70 se inmunoprecipitó de los extractos de vehículo o 5 M Kaletra tratados H2170 células y el nivel de co precipitado-N-CDR se determinó con el anticuerpo N-CDR (panel superior). La membrana se volvieron a sondar con el anticuerpo Hsc70 (panel inferior). En los carriles "Entrada", se cargó una alícuota del extracto de células enteras. D, N-CDR (rojo) y Hsc70 (verde) de distribución en H2170 células se determinó mediante el análisis de inmunofluorescencia usando microscopía confocal. La intensidad de las señales de color amarillo significa el grado de co-localización de dos proteínas. ADN se marcó con DAPI (azul).
La mayoría de los sustratos conocidos de CMA contienen una orientación motivo lisosomal bioquímicamente relacionados con KFERQ [21], [29]. Este motivo consiste en una Q flanqueada a ambos lados por cuatro aminoácidos que consiste en una base, un ácido, un hidrófobo voluminoso, y un aminoácido hidrofóbico básico o voluminosos repetido. Un análisis de secuencia del péptido N-CDR reveló la presencia de un lisosómica comprende motivo casi idéntica de QEIFR pentapéptido, lo que sugiere que la N-CDR podría ser un sustrato de CMA (Fig. 5A). En CMA, asocia en primer lugar Hsc70 con su carga mal plegada en el cytosole y luego compleja Hsc70 de carga es transportada a los lisosomas [29], [30]. Una vez entregado a la membrana lisosómica por Hsc70, las proteínas mal plegadas de carga son transferidos a la cavidad lisosomal con la ayuda de Lamp2A, un factor limitante de la velocidad de CMA [26] - [28]. Para demostrar que la N-CDR se degradó a través de la vía lisosomal Lamp2A mediada, se determinó el efecto de Lamp2A ablación en el nivel de proteína N-CDR. la pérdida de la N-CDR se invirtió significativamente (Fig. 5B, paneles superiores) después de la ablación Lamp2A con un eficaz anti-Lamp2A siRNA (Fig. 5B, paneles inferiores), lo que sugiere un papel importante de Lamp2A en la pérdida de la proteína N-CDR. Además, el tratamiento de células con H2170 cloroquina, un inhibidor químico de la función lisosomal [31], bloqueó significativamente la pérdida de la proteína N-CDR (Fig. 5C).
A, N-CDR contiene una lisosomal consenso de orientación motivo. El motivo de orientación lisosomal en la secuencia del péptido N-CDR está resaltada en negrita subrayado. B, Lamp2A ablación bloqueado pérdida de N-CDR en células H2170. nivel de N-H2170 CDR en células expuestas a anti-Lamp2A o controlar siRNA durante 72 horas, se determinó con el anticuerpo N-CDR (panel superior) después de confirmar Lamp2A ablación mediante análisis de RT-PCR (panel inferior). C, la inhibición química de la función lisosomal estabilizado N-CDR. Nivel de N-CDR en H2170 células tratadas durante 72 horas con vehículo o 25 cloroquina mu M, un inhibidor selectivo de la función lisosomal, se determinó con el anticuerpo N-CDR. D, la bandera de etiquetado-N-CDR se incubó con lisosomales purificada o no lisosomales fracciones de H2170 (izquierda) o DMS-79 (derecha) las células y nivel de degradación N-CDR se determinó con el anticuerpo bandera. Nivel de Lamp2, una proteína lisosómica, se determinó para demostrar la pureza de cada fracción. E, N-CDR ocupado por quimostatina lisosomas tratados se protegió de la proteinasa K digestión. Bandera de etiquetado N-CDR o Hsc70 incubó con los lisosomas aislados de forma H2170 células pretratadas con quimostatina se sometió a digestión con proteinasa K y el nivel relativo de protección N-CDR o Hsc70 se determinó con la bandera o el anticuerpo Hsc70. nivel lamp2 se determinó para cuantificar la cantidad de lisosomas en cada muestra.
A fin de probar que los lisosomas eran la fuente de actividad de escisión de la N-CDR presentado en las células NSCLC, la digestión de la Bandera de etiquetado N-CDR se incubaron con el extracto de lisosomales o no lisosomales fracciones de células H2170 se determinó. Bandera de etiquetado N-CDR se incubó con el extracto de la fracción lisosomal de H2170 células fue digerido por completo, mientras que la Bandera de etiquetado N-CDR incubó con fracciones no lisosomales no era (Fig. 5D, panel izquierdo), lo que sugiere que la actividad de escisión de la N-CDR fue muy probablemente localizada en los lisosomas. Bajo condiciones de ensayo idénticas, Bandera de etiquetado N-CDR incubó con la fracción lisosomal de las células DMS-79 no fue digerido (Fig. 5D, panel derecho). Para demostrar que la N-CDR es de hecho un sustrato de CMA, se realizó un ensayo de absorción de lisosomal, en el que los sustratos CMA tomadas por los lisosomas quimostatina tratados estarían protegidas de digestión con proteinasa K, [21]. Bandera de etiquetado N-CDR o Hsc70, un sustrato conocido CMA, se incubó con proteinasa K y lisosomas isolaed de quimostatina tratada H1270 células, y el nivel de proteínas N-COR o Hsc70 protegidos de la digestión de proteinasa K se determinó por Western Blot. Una cantidad significativa de Bandera de etiquetado N-CDR, así como Hsc70 fue protegido de la digestión con proteinasa K cuando se incubaron con lisosomas tratada quimostatina, lo que sugiere que la N-CDR, como Hsc70, puede ser translocado a la cavidad lisosomal (Fig. 5E).
a partir de los datos descritos hasta ahora en este informe, el papel potencial de la degradación inducida por el CMA del mal plegada proteína N-CDR en la supervivencia y el crecimiento de las células de NSCLC se ilustra a través de un modelo esquemático (Fig. 6). Este modelo pone de relieve cómo la pérdida de la N-CDR podría contribuir a la supervivencia y el crecimiento de células de NSCLC mediante un mecanismo dual. La degradación de la proteína mal plegada N-CDR, por un lado, podría contribuir indirectamente a la supervivencia de células de NSCLC mediante la neutralización de la tensión ER causada por la acumulación intracelular de la proteína N-CDR mal plegadas. Al mismo tiempo, la pérdida de la función N-CDR debido a mal plegamiento puede dar lugar a la activación de las vías de supervivencia oncogénicos que normalmente son reprimidos por una proteína N-CDR nativa plegada y funcional. Por otra parte, mal plegada N-CDR y sus fragmentos degradados también podrían activar directamente diversos mecanismo oncogénico relacionado con el crecimiento y la supervivencia de células de NSCLC. De este modo la degradación, inducida por el CMA del mal plegada N-CDR puede contribuir al crecimiento y la transformación de células de NSCLC mediante una combinación de pérdida y ganancia de función de los mecanismos.
Este modelo ilustra cómo la degradación de N- mal plegada inducida por CMA CDR podría contribuir a la supervivencia y el crecimiento de las células de NSCLC a través de la pérdida de la función normal y el aumento del mecanismo de la función aberrante.
Discusión
la inestabilidad N-CDR o mal plegamiento observado en el CPNM