Extracto
Antecedentes
Castro-resistente al cáncer de próstata (CRPC) es una enfermedad letal en los pacientes que recibieron terapia de privación de andrógenos para el cáncer de próstata (PC). A pesar de numerosos estudios que muestran la expresión de la proteína HIF1α bajo normoxia en las líneas celulares PC, el papel de esta expresión HIF1α normoxia en quimio-resistencia y la migración no se ha investigado previamente. Como ningún método disponible actualmente para determinar qué tumores progresarán hasta CRPC, también se investigó el papel de HIF1α en PC y su potencial para predecir el desarrollo de CRPC.
Métodos
El efecto de proteína HIF1α desmontables en quimio-resistencia y la migración de las células PC3 se evaluó por recuento de células y ensayos Transwell, respectivamente. eficiencia de la traducción de ARNm HIF1α se determinó en células PC utilizando un constructo HIF1α 5'UTR-luciferasa. Los resultados clínicos se correlacionaron después de la tinción de 100 tumores de próstata para la expresión HIF1α.
Resultados
Las líneas celulares CRPC-como (PC3 y DU145) expresaron más proteínas HIF1α de una línea de células sensibles a los andrógenos ( LNCaP). tasa de migración y quimio-resistencia fueron más altos en las células PC3 y ambos fueron menores cuando se redujo la expresión HIF1α. Aumento de la traducción de mRNA HIF1α puede ser responsable de HIF1α sobreexpresión en células PC3. Los pacientes cuyos tumores expresado HIF1α había disminuido significativamente la supervivencia libre de metástasis y los pacientes que estaban en la terapia de privación de andrógenos habían disminución de la supervivencia libre de CRPC en el análisis de Kaplan-Meier. En el análisis multivariado HIF1α fue un factor de riesgo independiente para la progresión metastásica a PC (razón de riesgo (HR) 9,8, p = 0,017) y el desarrollo de CRPC (HR 10,0, p = 0,021) en pacientes bajo terapia de privación de andrógenos. En particular, los tumores que no expresan HIF1α no metástasis o desarrollar CRPC.
Conclusiones
HIF1α es probable que contribuya a la metástasis y la quimio-resistencia del CRPC y con objetivos de reducción de HIF1α puede aumentar la capacidad de respuesta de CRPCs a la quimioterapia. La expresión de HIF1α puede ser una herramienta útil para el desarrollo de CRPC
Visto:. Ranasinghe WKB, Xiao L, S Kovac, Chang M, Michiels C, D Bolton, et al. (2013) El papel del factor inducible por hipoxia 1α en la determinación de las propiedades de los cánceres de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 8 (1): e54251. doi: 10.1371 /journal.pone.0054251
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Agosto, 2012; Aceptado: December 10, 2012; Publicado: 16 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Ranasinghe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas 454322 (GSB), 566.555 (GSB, AS) y 628.390 (AS, OP, GSB) del Consejo de Investigación médica de Australia Nacional de Salud e. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es el segundo cáncer más común en los hombres en todo el mundo y sigue imponiendo una carga de enfermedad significativa y creciente problema de salud en todo el mundo. Sin embargo, nuestra comprensión de los mecanismos que contribuyen al desarrollo de PC es aún limitado [1]. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) son importantes reguladores de la estimulación y la supervivencia de células de cáncer de próstata. La terapia de privación de andrógenos (ADT) es la base del tratamiento para el cáncer metastásico y de próstata localmente avanzado. Sin embargo, ADT finalmente no logra mantener la supresión del cáncer de próstata en la mayoría de los hombres con esta condición.
Cáncer de próstata
resistente a la castración (CRPC) es una forma letal de PC que puede progresar rápidamente y hacer metástasis. El desarrollo de CRPC, más del 84% de los pacientes tendrán metástasis [2]. Unos biomarcadores para la predicción de la CRPC se han descrito [3], [4], y en la actualidad no existe un consenso universal sobre la identificación de los pacientes con PC progresará a CRPC. Además, los mecanismos que resultan en el desarrollo y progresión de la CRPC siguen siendo poco conocidos, en parte, debido a la limitada disponibilidad de líneas celulares que modelan de cerca CRPC. El PC3 dos líneas celulares PC ampliamente utilizados y DU145 no se consideran plenamente representativo de las células CRPC ya que no se aíslan de los cánceres de próstata que habían recaído tras la terapia de privación de andrógenos, y ya que expresan poco [5] en su caso AR [6], mientras que AR es a menudo sobreexpresada en tumores CRPC. Sin embargo, como las células PC3 y DU145 muestran algunas de las propiedades fundamentales de un tumor CRPC también la migración (metástasis), andrógeno-independencia y quimio-resistencia similar a la línea celular LNCaP CRPC C4-2 [7], y también comparten propiedades moleculares similares , incluyendo agotamiento /mutación del ADN mitocondrial, que se han correlacionado con la invasividad y la resistencia a fármacos [8], estas dos líneas celulares se refieren con frecuencia como células CRPC [9], [10], [11].
la hipoxia es una reducción en la concentración normal de oxígeno en los tejidos que se produce en muchas enfermedades incluyendo el cáncer. Un microambiente hipóxico dentro de la próstata se ha postulado que es responsable de la promoción de alteraciones genéticas secundarias y estimulación angiogénica, que conduce a un fenotipo de células más agresivas y progresión maligna [12]. La capacidad de las células para adaptarse a la hipoxia es dependiente de un conjunto de factores de transcripción inducibles por hipoxia (HIF), que consisten de un alfa reguladora (HIF1α) y una subunidad beta constitutivo (HIF1β). HIF se unen a la secuencia central 5'-RCGTG-3 'en promotores diana e inducen más de 200 funcionalmente diversos genes implicados en la supervivencia celular [13]. La síntesis de HIF1α se produce a través de mecanismos independientes de oxígeno, pero su degradación es dependiente de oxígeno e implica la prolil hidroxilasa, hidroxilasa asparaginil, la proteína de Von Hippel-Lindau y el sistema proteasomal [13].
Aunque HIF1α se sobre expresa en un número de cánceres humanos [14], [15], el papel de HIF1α en la progresión del cáncer no está claro. Las altas concentraciones de HIF1α en líneas de células renales y cáncer de mama, se mostró a aumentar la supervivencia de células de cáncer, mientras que en concentraciones del cáncer de alta HIF ováricos contribuido al aumento de la apoptosis [13]. Dai y colaboradores informaron que la hipoxia aguda aumentó la expresión HIF1α y la motilidad y capacidad invasiva de las tres líneas celulares PC [16]. Sin embargo, a pesar de numerosos estudios que demuestran la presencia de la expresión HIF1α en normoxia, y un informe de que la señalización de HIF1α está regulada positivamente en las células LNCaP C4-2 resistentes a la castración de normoxia en comparación con las células LNCaP parentales [17], el papel de la expresión HIF1α normoxic es no está bien documentada, y por lo tanto forman la base de nuestro estudio actual.
del mismo modo, a pesar de la alta expresión en los tejidos HIF1α PC [14], [18], [19], [20], [21], [ ,,,0],22], [23], [24], su asociación con el pronóstico no es concluyente [25], [24], [26], [27]. Sin embargo, el consenso es que HIF1α está regulada positivamente en los tumores de próstata [28], [24] y es un escudo inducida por tumor potente contra el estrés oxidativo o la destrucción por la privación de andrógenos, la quimioterapia o la radiación citotoxicidad [29]. Actualmente no hay estudios han informado de las relaciones entre la expresión HIF1α y el desarrollo de CRPC. Por lo tanto, el objetivo fue investigar el papel de HIF1α en la regulación del CRPC, y analizar su potencial como un marcador biológico para la predicción del desarrollo de CRPC.
Materiales y Métodos
Estudios in vitro
cultivo celular.
Las tres líneas celulares de cáncer de próstata humanas (PC3, DU145 y LNCaP) utilizadas en este estudio fueron donados generosamente por a /Prof. Ian Davis, Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Melbourne, y había sido adquirido de ATCC en 2009. Las líneas de células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Australia) suplementado con FBS al 8% y 100 U /ml de penicilina. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado con 95% de aire y 5% de CO
2. Las células hipoxia tratadas se cultivaron en la misma manera que los controles, excepto que la fase de gas contenía 94% de nitrógeno (N
2), 5% de CO
2 y 1% O
2, con concentraciones de oxígeno supervisado y ajustado automáticamente por un controlador electrónico de oxígeno (ProOx Modelo 110, Biospherix, Redfield, Nueva York).
Western blot.
Las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo ( PBS) y se lisaron con 0,1-0,2 ml previamente hervida dodecil sulfato de sodio (SDS) al tampón de lisis. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a un Hybond-C extra membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare, Rydalmere, Australia). proteína HIF1α se detectó con un anticuerpo anti-HIF1α humana de ratón monoclonal (1:1000, BD Biosciences, North Ryde, Australia) seguido de un anticuerpo de rábano picante conjugado con peroxidasa anti-ratón de cabra secundario (1:5000, Bio-Rad). Como control de carga, manchas de transferencia se incubaron con una peroxidasa de rábano (HRP) de conejo conjugada con anticuerpo anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Las bandas se visualizaron en un lector de imagen LAS 3000 (Fujifilm, Brookvale, Australia), con un kit ECL Western Blot detección anticipada (GE Healthcare). El análisis densitométrico de las bandas de proteínas se realizó con software multigalga (Fujifilm).
Ensayo de proliferación.
Para la medición de los niveles basales de proliferación, 2 × 10
5 células se cultivaron en una 6 así placa de Petri en medio de cultivo suplementado con FBS. Las células se lavaron con PBS a 24 horas y se cultivaron durante 48 horas en medio libre de suero. Las células que iban a recibir el tratamiento se cultivaron como antes, y los medios de comunicación se retiró a las 24 horas y se complementaron con los medios de FBS-libre antes del tratamiento con peróxido de hidrógeno (H
2O
2), cloruro de cobalto, 5-fluorouracilo (5-FU) o hipoxia (1% o
2) durante 48 horas. Las células se contaron usando un contador de células automatizado (Countess®, Invitrogen).
ensayos de migración /invasión Transwell (ensayo) guía
células de cáncer de próstata se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células en 250 l por pocillo de medio de cultivo libre de suero a la cámara superior de membranas de filtro de tereftalato de polietileno recubiertos con fibronectina. Las cámaras superiores se insertaron en los pocillos de cultivo de tejidos y se añadieron 750 l de medio de cultivo libre de suero a la cámara inferior. Después de una noche de incubación a 37 ° C, las células no migratorias en la superficie de la membrana superior se eliminaron con un hisopo de algodón, y las células que habían migrado a través de los poros de la membrana e invadió la parte inferior de la membrana se fijaron con 90% de metanol y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para la evaluación cuantitativa, fue entonces contó el número de células teñidas, que emigran con un microscopio. Cinco campos de baja potencia por filtro se contaron en tres ocasiones separadas por tres experimentos independientes.
Estable HIF1α tumbar en las células PC3.
Los plásmidos que codifican la HIF1α shRNA (Mission® números de clones y TRCN0000003810 TRCN0000010819, que codifican un tipo de horquilla siRNA) y un plásmido de control negativo (SHC002) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Las células fueron transfectadas con un plásmido de HIF1α shRNA o el plásmido de control negativo usando el método de transfección Neon® (Invitrogen). Brevemente, 1 × 10
6 se tripsinizaron las células, se lavaron con PBS, y se sedimentaron antes de la resuspensión en 100 l de tampón de resuspensión de neón. se añadieron HIF1α o control shRNA plásmido (5 g) y se mezclaron bien en la suspensión de células antes de la transfección. Las células transfectadas se sembraron en medio completo y se seleccionaron con 1,0 mg /ml de puromicina (Sigma-Aldrich) durante 7 días antes de ensayos adicionales. Desmontables de la proteína HIF1α se demostró por Western Blot, y mediante la medición de su producto derivado, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
eficiencia de la traducción.
Para determinar si el 5'UTR de ARNm HIF1α tiene ningún papel en HIF1α sobreexpresión en células de la próstata se construyó un plásmido indicador en el que toda la 5'UTR y 238 pb de la secuencia del promotor HIF1α fue clonado aguas arriba de
Firefly
luciferasa secuencias en el plásmido informador pGL4.10 codificación. El constructo informador se transfectó en la actividad de luciferasa de luciérnaga dirigido por el vector reportero HIF1-UTR LNCaP y células PC3 y y
Renilla luciferasa
(pTK-Renilla reportero de control de vector) se determinaron después de 24 horas de incubación. mRNA total se extrajo de las células transfectadas y se determinó la cantidad de ARNm de luciferasa usando PCR en tiempo real. Luciferase mRNA en las células transfectadas con el vector vacío pGL4 se utilizó como el control basal. eficiencia de la traducción se calculó dividiendo el
Firefly
actividad de la luciferasa (proporcional a la proteína luciferasa) por la concentración de
Firefly
mRNA de luciferasa. Esta relación se corrigió aún más la eficiencia de transfección, tomando en cuenta la
Renilla
actividad luciferasa.
Estudios resultado clínico
muestras de tejidos humanos.
Para el evaluación de las asociaciones entre la expresión HIF1α y los resultados clínicos, 100 tumores de próstata humanos procedentes de pacientes que habían proporcionado consentimiento informado por escrito se recogieron después de una prostatectomía radical o resección transuretral de la próstata (RTUP) en nuestra institución entre 2000 y 2011. Todas las muestras se obtuvieron de la Biobanco cáncer victoriano y o el Departamento de Anatomía Patológica del hospital Austin, Victoria, Australia. La aprobación para el uso de muestras biológicas y datos del paciente sin identificación para este estudio se obtuvo del Comité Ético de Investigación Austin salud humana.
La inmunohistoquímica.
Secciones de tejido
embebidos en parafina-se-des encerado en histolene e hidratada con concentraciones decrecientes de etanol. Las láminas fueron lavadas en solución salina tamponada con Tris /Tween 20 (TBST) y los antígenos fueron recuperados por calentamiento en tampón de ácido cítrico (pH 6,0) en el microondas durante 2 minutos en alto medio y 13 minutos a fuego medio. Los portaobjetos se dejó enfriar y peroxidasas endógenas en las muestras se bloquearon por tratamiento con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos en la oscuridad. Los portaobjetos se lavaron en agua, equilibrada en tampón TBST, se bloquearon con ultravision (Thermo Fisher Scientific) durante 10 minutos y se tiñeron para HIF1α usando un anticuerpo policlonal HIF1α (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante la noche . Después de la incubación del anticuerpo, los portaobjetos se trataron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Dako) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. Los portaobjetos se lavaron con TBST después de 5 minutos de incubación con 3,3-diaminobencidina (DAB) cromógeno (1 gota /ml de tampón sustrato, Dako) para completar el desarrollo del color. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina durante 1 minuto, se lavan en agua y el agua del grifo de Scott correr durante 1 minuto cada uno, deshidratados y la cubierta se deslizó. Los investigadores estaban cegados a la condición de muestras individuales, y los tumores fueron divididos de acuerdo a la presencia o ausencia de HIF1α en lugar de tinción débil o fuerte como para reducir la variación entre observadores.
Resultados.
Las metástasis a distancia fueron definidos por anomalías documentadas en el hueso-scan o tomografía computarizada. CRPC se definió como 2 subidas consecutivas de antígeno prostático específico (PSA) desde el nadir de PSA. El tiempo para el desarrollo de metástasis a distancia se midió a partir de la cirugía, mientras que el tiempo de desarrollo de CRPC, quimio-resistencia y la muerte-PC específica se mide desde el inicio de la privación de andrógenos. PSA pre-intervencionista se definió como PSA inmediatamente antes de obtener la muestra de tejido, y T3 y T4 puesta en escena se definió como el cáncer de próstata localmente avanzado como en la Comisión Mixta Americana de 2002, sobre un sistema de estadificación del cáncer [30].
Estadística el análisis.
el análisis estadístico se llevó a cabo bajo la dirección del servicio de asesoramiento estadístico, Universidad de Melbourne, Australia. análisis de Chi-cuadrado de Pearson y la prueba exacta de Fisher se realizaron utilizando de dos en dos tablas (puntuación de Gleason, positividad HIF1α, el estadio tumoral y el número de pacientes que inician la terapia de privación de andrógenos) en el software SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) a probar la asociación entre las características de los pacientes y la expresión HIF1α. El análisis univariante y multivariante se realizó mediante modelos de regresión de Cox para todas las variables. Con el fin de superar la falta de convergencia del modelo de regresión de Cox en el análisis de HIF1α la positividad y la puntuación de Gleason (ya que no hubo resultados en el grupo negativo HIF1α y las bajas puntuaciones de Gleason), estos análisis univariante y multivariante se calcularon mediante regresión de Cox con el método de máxima verosimilitud Firth penalizado con el paquete R, (R bases para la Computación de estadística versión 2.14.0). La supervivencia se calculó para cada resultado mediante curvas de Kaplan-Meier con la prueba de log rank en el paquete estadístico SPSS (IBM SPSS versión 17). Las evaluaciones de las pruebas de diagnóstico con análisis de sensibilidad y especificidad se realizaron utilizando el software estadístico MedCalc (MedCalc Software, Bélgica http://www.medcalc.org/).
in vitro
los datos se presentan como medios ± SEM. La significación estadística para las comparaciones individuales de datos distribuidos normalmente se determinó mediante la prueba de la t de Student o de datos que no se distribuyen normalmente por Mann-Whitney rango suma de prueba. Para comparaciones múltiples se realizaron ANOVAs unidireccionales seguido de la corrección de Bonferroni. Todas las estadísticas se analizaron con el programa SigmaStat (Jandel Scientific).
Resultados
HIF1α expresión se correlaciona con la Tasa de migración en las células PC
HIF1α expresión de la proteína se analizó en andrógeno-sensibles (LNCaP) y andrógenos insensible (PC3 y DU145) células CRPC similares. La expresión basal HIF1α bajo normoxia fue superior en 12 ± 6 veces y 10 ± 4 veces, respectivamente, en el CRPC-como las líneas celulares PC3 y DU145 en comparación con células LNCaP sensibles a andrógenos (Figura 1A). Es interesante la observación de que la tasa de crecimiento basal de células LNCaP en condiciones libres de suero fue mucho mayor que las células PC3, que expresan más HIF1α, indica que el aumento de expresión de HIF1α no conduce necesariamente a una mayor proliferación (Figura 1B). Para investigar el potencial metastásico de las líneas celulares PC, la migración de la CRPC líneas celulares PC3 y DU145 se comparó con células LNCaP sensibles a andrógenos usando un ensayo Transwell. La observación de que la migración de las células PC3 y DU145 fue 177 ± 6% y 215 ± 17%, respectivamente, del valor de las células LNCaP (100%) (Figura 1C) indicó que la sobreexpresión de HIF1α se asocia con aumento de la migración.
concentraciones A) proteína basal HIF1α en las líneas celulares humanas PC LNCaP, DU145 y PC3 en condiciones de normoxia se analizaron por Western blot. (B) La proliferación se ensayó mediante recuento de las células después de 24 y 48 horas. (C) Las tasas de migración /invasión se midieron mediante ensayos Transwell a las 24 horas. Los valores en (A) y (C) se expresan como el aumento de veces en comparación con las células LNCaP, mientras que los valores en (B) se expresan como un porcentaje del tiempo 0 de valor. Todos los valores son la media ± SEM de al menos tres tratamientos separados. las tasas de (D) de supervivencia de células PC expuestos a condiciones citotóxicos. La supervivencia de las células PC3 (que tienen mayor contenido de proteína HIF1α basal) cuando se exponen a estrés oxidativo con peróxido de hidrógeno (H
2O
2) o quimiotoxicidad con 5-fluorouracilo (5-FU) se comparó con la supervivencia de LNCaP las células (que tienen expresión HIF1α inferior). La supervivencia se evaluó contando el número de células a las 24 horas. Los valores se expresan como un porcentaje del control no tratado y son la media ± SEM de al menos tres tratamientos separados. #, P & lt;. 0,05 frente a las células LNCaP tratadas
Mayor HIF1α expresión se correlaciona con un aumento de la supervivencia de la célula
Una de las características del CRPC es su resistencia a la quimioterapia y la radioterapia. Para investigar si HIF1α es responsable del aumento de la supervivencia de las células CRPC-como
in vitro
, la supervivencia celular después del tratamiento de células PC3 o LNCaP con dos agentes citotóxicos, H
2O
2 (una fuente del estrés oxidativo) y 5-fluorouracilo (5-FU, un fármaco quimioterapéutico) se midió. Ensayos de proliferación celular (Figura 1D) revelaron que las tasas de supervivencia de 60 ± 14% y 42 ± 8% de las células PC3 después del tratamiento con 100 M H
2O
2 o 15 mM de 5-FU, respectivamente, fueron significativamente mayores que las respectivas tasas de supervivencia de 17 ± 4% y el 3 ± 1,6% en las células LNCaP sensibles a los andrógenos.
HIF1α Derribo Disminuye la célula de supervivencia y migración de células PC3
Para confirmar que el aumento de la supervivencia y la migración de las células PC3 se debió a una mayor expresión de la proteína HIF1α, la expresión de HIF1α en células PC3 fue derribado usando vectores shRNA. La transfección de células PC3 con un vector que expresa HIF1α shRNA redujo la expresión de la proteína HIF1α a 12 ± 3% en el clon 1 y 16 ± 3% en el clon 2 en comparación con células PC3 de tipo salvaje (100%) (Figura 2A). VEGF, un producto aguas abajo de HIF1α, también se redujo en los clones HIF1α desmontables, lo que confirma la reducción de la actividad HIF1α (datos no mostrados). La observación de que no había diferencia en la tasa de proliferación basal entre HIF1α shRNA-expresando células PC3 y células PC3 transfectadas con un vector de control mezclado es consistente con la conclusión de que no había correlación entre la mayor expresión HIF1α y tasa de proliferación (Figura 1B). Tras H
2O
2 tratamiento sólo 22,5 ± 3% de las células PC3 HIF1α desmontables shRNA (clon 1) sobrevivió a la supervivencia en comparación con 58,5 ± 10% en las células revueltos de control de vectores transfectadas PC3 (Figura 2B). De manera similar, 5-FU redujo la supervivencia de las células a 27 ± 2% en las células HIF1α desmontables, en comparación con la supervivencia celular 62 ± 9% en células PC3 transfectadas con un vector de control mezclado. No hubo ningún cambio significativo en la expresión de HIF1α tras el tratamiento de las células PC3 transfectadas con control de shRNA con 100 mM H
2O
2 o 15 mM 5-FU en comparación con células PC3 no tratados (Figura 2C). Sin embargo, hubo 2,3 ± 0,2 veces y 6,6 aumentos ± 1 veces en la expresión de HIF1α siguientes el tratamiento de células PC3 con 1% O
2 o 300 mM CoCl
2, respectivamente (Figura 2C). Como se muestra en la Figura 2A la expresión basal de HIF1α en HIF1α shRNA expresando células PC3 es indetectable, y por lo tanto no es factible para determinar el efecto del tratamiento con 100 mM H
2O
2 o 15 mM 5-FU en HIF1α shRNA-expresando clones PC3.
(a) concentraciones HIF1α se redujeron en 2 clones independientes de células PC3 siguiente expresión estable de HIF1α shRNA como se evaluó mediante Western blot. Los valores son la media ± SEM de al menos tres experimentos separados y se expresan como un porcentaje de las células PC3 de tipo salvaje. *, P & lt; 0,05 frente a las células PC3 de tipo salvaje. (B) La supervivencia de las células PC3 después de la exposición al estrés oxidativo (peróxido de hidrógeno (H
2O
2)) o quimiotoxicidad (5-fluorouracilo (5-FU) durante 24 horas se redujo siguiente knockdown HIF1α comparación con revueltos células PC3 de control transfectadas con vector valores son la media ± SEM de al menos tres experimentos separados y se expresan como un porcentaje de tratada revueltos células PC3 transfectadas con vector de control #, P & lt;.. 0.05 versus control (C) expresión de la proteína HIF1α en. células PC3 transfectadas con control de shRNA después del tratamiento con 1% de O
2, 300 mM CoCl
2, 100 M H
2O
2, y 15 micras lisados 5-FU. celulares se sometieron a electroforesis en SDS geles de poliacrilamida y se transfirieron con HIF1α anticuerpo. expresión de GAPDH se utilizó como control de carga. las transferencias de Western mostrados son representativos de al menos tres experimentos separados. Band densidades se determinaron mediante análisis densitométrico de HIF1α /GAPDH y se presentan en relación con el valor para no tratada células. Los datos representan la media ± SEM, * p & lt; 0,05 vs células PC3 tratadas. (D) Las tasas de migración /invasión de las células PC3 desmontables HIF1α se redujeron en comparación con las células PC3 transfectadas con el vector de control revueltos, evaluadas por el ensayo Transwell. Los valores son la media ± SEM de al menos tres experimentos separados y se expresan como un porcentaje de las células PC3 transfectadas vector de control revueltos no tratados. *, P & lt; 0,05 versus control. (E) La inducción de HIF1α en células LNCaP por la hipoxia (barras gris oscuro) o por cloruro de cobalto (luz barras grises) aumento de la supervivencia después de la exposición al estrés oxidativo con H
2O
2 o quimiotoxicidad con 5-FU para 24 horas cuando se compara con las células control LNCaP (barras negras). Los valores son la media ± SEM de al menos tres tratamientos separados y se expresan como un porcentaje del control no tratado LNCaP. #, P & lt; 0,05 frente a las células LNCaP tratadas. *, P & lt; 0,05 frente a las células LNCaP tratadas con 1% O
2 y 5-FU. expresión de la proteína (F) HIF1α en las células LNCaP tratadas con 1% O
2 y 300 mM CoCl
2 en combinación con 100 mM H
2O
2 o 15 mM 5-FU. Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS y se transfirieron con anticuerpo HIF1α. expresión de GAPDH se utilizó como control de carga. Las transferencias de Western mostrados son representativos de al menos tres experimentos separados. banda densidades se determinaron por análisis densitométrico de HIF1α /GAPDH y se presentan en relación con el valor para las células de normoxia sometidos al mismo tratamiento. Los datos representan la media ± SEM; * P & lt;. 0,05 frente al control no tratado, 100 M H
2O células LNCaP
2 o 15 mM de 5-FU tratados
Anteriormente, un 1,8 veces se observó una mayor tasa de migración en células PC3 en comparación con células LNCaP sensibles a andrógenos. Para determinar si esta diferencia fue mediada por HIF1α, se comparó la migración de las células PC3 transfectadas-caída y el control de vectores HIF1α. Desmontables expresión HIF1α de interferencia por ARN se redujo la migración PC3 a 37 ± 10% (clon 1) y 14 ± 7% (clon 2), en comparación con las células control de vector-PC3 transfectadas (100%) (Figura 2D).
inducción de HIF1α en las células LNCaP célula aumenta la supervivencia
Para determinar si la inducción de la expresión en células LNCaP HIF1α sensibles a los andrógenos puede aumentar su supervivencia tras el tratamiento con agentes citotóxicos, se indujo la expresión HIF1α utilizando la hipoxia (1 % o
2) o el cloruro de hipoxia mimético de cobalto (Figura 2E). La incubación de las células LNCaP, ya sea con 100 mM H
2O
2 o 15 mM 5-FU redujo la supervivencia a 17 ± 4% y 26 ± 2%, respectivamente, comparado con el control sin tratar (100%). Sin embargo, las tasas de supervivencia en presencia de 100 mM H
2O
2 después del tratamiento de las células LNCaP, ya sea con 1% O
2 o cloruro de cobalto aumentó a 40 ± 8% y 49 ± 11%, respectivamente. La supervivencia (113 ± 23%) de células LNCaP tratadas con 300 mM CoCl
2 en combinación con 15 mM 5-FU fue significativamente mayor en comparación con la supervivencia (54 ± 10%) observada en células LNCaP tratadas con 1% O
2 en combinación con 15 mM 5-FU. Curiosamente, 300 M CoCl
2 en combinación con 15 mM 5-FU indujo una ligeramente superior 3.3 aumento ± 0,5 veces en la expresión HIF1α en las células LNCaP en comparación con el aumento de 2,1 ± 0,4 veces inducida por 1% O
2 en combinación con 15 mM de 5-FU, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 2F).
el aumento de la eficacia de traducción del ARNm HIF1α es Responsable de HIF1α sobreexpresión en células PC3
aunque la regulación de la traducción por el 5'UTR es un mecanismo importante para la regulación post-transcripcional de la expresión génica, la eficacia de la traducción de ARNm HIF1α en las células de la próstata no se ha informado anteriormente. Como se muestra en la Figura 3A la relación de
Firefly
a
Renilla
actividad de la luciferasa después de la transfección de reportero HIF1α 5'UTR-LUC y vectores de control pTK-Renilla era 20 ± 3 veces y 26 ± 3 veces en las células LNCaP y PC3, respectivamente, en comparación con las células transfectadas con el vector vacío pGL4. Sin embargo la expresión de ARNm de luciferasa fue 33 ± 1,4 veces en LNCaP y 9 ± 2,1 veces en las células PC3 en comparación con células transfectadas con vector vacío pGL4 (Figura 3B). Además, la eficiencia de la traducción de ARNm en HIF1α células PC3 era 2,9 ± 0,4 veces mayor en comparación con las células LNCaP cuando se evaluó utilizando el índice de actividad de la luciferasa /contenido mRNA relativa (Figura 3C).
(A)
Firefly
y
Renilla
actividades de luciferasa en células de cáncer de próstata después de la transfección de una construcción 5'UTR-luciferasa HIF1α y el reportero control de vectores pTK-Renilla se determinaron utilizando un ensayo de luciferasa dual. (B) PCR en tiempo real (RT-PCR) análisis de mRNA de luciferasa en las células PC transfectadas con el constructo de 5'UTR-luciferasa HIF1α. Después de la transfección, se aisló ARN, y la expresión de ARNm de luciferasa detectada por tiempo real de RT-PCR y normalizado por la expresión 18S mRNA. (C) eficiencia de traducción representa la relación de
Firefly
/
Renilla
actividad de la luciferasa, dividida por la concentración de ARNm de luciferasa relativa en las células PC. La eficiencia de traducción de mRNA de luciferasa dirigido por la región 5'UTR del HIF1α en células PC3 es mayor que en las células LNCaP. Los valores son la media ± SEM de al menos tres experimentos separados. *, P & lt;. 0,05 frente a las células LNCaP tratadas
HIF1α Expresión de proteínas en la próstata humana tumores de cáncer de
Un centenar de muestras de PC humanos se dividieron en dos grupos en función de su puntuación de Gleason (≤ 7 (38) y & gt; 7 (62), Tabla 1) y el estado HIF1α. La expresión de HIF1α se evaluó por inmunohistoquímica (Figura 4A). Figura 4A (a) muestra un positivo, y la Figura 4A (b) muestra una tinción negativa HIF1α en dos tumores típicos con una puntuación de Gleason 9 (cuadro de inserción, vista X20). Figura 4A (c) muestra un positivo, y la Figura 4A (d) demuestra un negativo (d), la tinción HIF1α en dos tumores típicos con puntuación de Gleason 6. La tinción positiva en células PC3 (Figura 4A (e)) y la tinción negativa en LNCaP células (Figura 4A (f)) y en desmontables células PC3 HIF1α (Figura 4A (g)) demostraron la especificidad del anticuerpo HIF1α. Además, HIF1α se expresa en todo el tumor con una mayor expresión en las principales glándulas prostáticas (indicada por la flecha en la figura 4A (a)) y en las metástasis de ganglios linfáticos (indicado por la flecha en la figura 4A (h)). En las muestras positivas HIF1α expresión era homogénea en toda la zona del tumor.
(A) inmunohistoquímica resultados representativos que muestran la expresión de HIF1α en muestras de cáncer de próstata y líneas celulares. Positivo (Aa) y negativo (Ab) tinción para HIF1α se observó en dos tumores típicos con una puntuación de Gleason 9 (cuadro de inserción, vista X20).