Extracto
Recientemente hemos descrito la localización mitocondrial y la importación del receptor de la vitamina D (VDR) en la proliferación de células HaCaT activa por primera vez, pero su papel en el orgánulo sigue siendo desconocido. Muchos intermediarios metabólicos que favorecen la proliferación celular son proporcionados por la mitocondria; en consecuencia, la identificación de proteínas que regulan las vías metabólicas mitocondriales es de gran interés, y hemos tratado de entender si VDR puede modular estas vías. Nos genéticamente silenciados VDR en células HaCaT y estudiaron los efectos sobre el crecimiento celular, el metabolismo mitocondrial y rutas biosintéticas. VDR caída resultó en la inhibición del crecimiento robusto, con acumulación en la fase G0G1 del ciclo celular y la disminución de la acumulación en la fase M. Los efectos de VDR silenciamiento sobre la proliferación se confirmaron en varias líneas celulares de cáncer humano. VDR expresión se observó una disminución consistente en dos modelos diferentes de la diferenciación celular. El deterioro del crecimiento de células HaCaT silenciado fue acompañada por un fuerte aumento en el potencial de membrana mitocondrial, que sensibiliza las células al estrés oxidativo. Se encontró que la transcripción de las subunidades II y IV de la citocromo c oxidasa fue significativamente mayor en VDR silenciamiento. En consecuencia, el tratamiento de células HaCaT con vitamina D downregulated las dos subunidades, lo que sugiere que VDR puede inhibir la cadena respiratoria y redirigir intermedios TCA hacia la biosíntesis, contribuyendo así al interruptor metabólico que es típico de las células cancerosas. Para explorar esta hipótesis, se examinaron diversas rutas biosintéticas acetil-CoA-dependientes, como la vía del mevalonato (medida como la biosíntesis del colesterol y la prenilación de las pequeñas GTPasas), y los niveles de acetilación de histonas; todas estas vías fueron inhibidas por VDR silenciamiento. Estos datos proporcionan evidencia del papel de VDR como un guardián de la actividad cadena respiratoria mitocondrial y un facilitador de la desviación de la acetil-CoA a partir del ciclo TCA productoras de energía hacia las vías biosintéticas que son esenciales para la proliferación celular.
cita: Consiglio M, Destefanis M, D Morena, Foglizzo V, Forneris M, Pescarmona G, et al. (2014) El receptor de vitamina D inhibe la cadena respiratoria, contribuyendo al interruptor metabólico que es esencial para la proliferación de células cancerosas. PLoS ONE 9 (12): e115816. doi: 10.1371 /journal.pone.0115816
Editor: Makoto Makishima, Escuela de Medicina de la Universidad de Nihon, Japón
Recibido: 9 Agosto, 2014; Aceptado: 27 Noviembre 2014; Publicado: December 29, 2014
Derechos de Autor © 2014 Consiglio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el receptor de la vitamina D (VDR), junto con los otros miembros de la familia de receptores de hormonas esteroides, en general ha sido descrito como un factor de transcripción ligando modulada clásica. Los efectos diferenciales de la VDR son provocados por la translocación nuclear inducida por ligando y la unión a sitios de vitamina D elemento sensible (VDRE) en genes regulados, en asociación con los socios de heterodimerización, coactivadores y correpresores. Las diferencias en la unión corepressor y la metilación del ADN reflejan la profunda variabilidad de VDR respuestas antiproliferativos en diferentes modelos de células [1]. La resistencia a los efectos nucleares de la vitamina D se ha informado en varios modelos de cáncer, incluyendo cánceres de próstata, de mama y de la vejiga, en el que el aumento de corepressor expresión y localización se ha considerado que es responsable de la falta de sensibilidad a la hormona [2] - [4 ].
los receptores de esteroides también poseen una modalidad no genómico de acción, sobre todo en la membrana plasmática o sitios mitocondriales, como el VDR no es una excepción. De hecho, los rápidos, efectos no genómicos de vitamina D parecen estar mediados por el VDR [5] - [7]. Muchos receptores de esteroides y factores de transcripción nucleares entrar en el compartimento mitocondrial, en los que o bien ejercen la regulación transcripcional del ADN mitocondrial o el control de la biogénesis mitocondrial y el metabolismo de [8] - [11]. Recientemente hemos descrito la localización mitocondrial de la VDR en una línea celular de queratinocitos proliferantes humana (HaCaT) por primera vez y demostró que la importación mitocondrial del receptor está mediada por el complejo de poros de transición de permeabilidad [12]. Sin embargo, la función de la VDR en este orgánulo que queda por esclarecer. Las mitocondrias son orgánulos multifuncionales y la actividad mitocondrial es importante para la proliferación celular y la fisiología. Por ejemplo, las mitocondrias desempeñan un papel esencial en la producción de energía celular (ATP) a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) acoplado a la fosforilación oxidativa (OXPHOS), así como durante la apoptosis a través de especies de oxígeno reactivo de liberación c (ROS) de generación y el citocromo. Varios estudios han indicado que la disfunción mitocondrial contribuye al desarrollo y la progresión de diversas enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [13]. Una característica distintiva de las células tumorales se altera el metabolismo de soporte proliferación celular rápido [14]. Muchos intermediarios metabólicos que favorecen la proliferación celular son proporcionados por la mitocondria [15]; en consecuencia, la identificación de proteínas que regulan las vías metabólicas mitocondriales es de gran interés, y hemos tratado de entender si el VDR puede modular estas vías
.
En el presente estudio, usando nuestro modelo descrito anteriormente (HaCaT la célula proliferante línea), que genéticamente silenciado el receptor y examinó los efectos sobre el crecimiento celular, el metabolismo mitocondrial y rutas biosintéticas. Los datos recogidos proporcionan pruebas de un nuevo papel de la VDR como un regulador negativo de la actividad de la cadena respiratoria, y que ponen de relieve las repercusiones para el anabolismo celular y el crecimiento producido por el VDR en la respiración mitocondrial. Sobre la base de nuestras observaciones, llegamos a la conclusión de que el VDR, mediante la restricción de la actividad respiratoria mitocondrial, permite a la célula de sobra intermediarios metabólicos, que puede ser desviada de metabolismo oxidativo hacia un destino biosintética, apoyando el crecimiento celular. Hemos validado el papel general de la VDR como un potenciador de la proliferación celular se extiende nuestras observaciones a varias líneas celulares de cáncer humano.
Resultados
silenciamiento VDR en las células HaCaT obstaculiza la proliferación celular
Debido a que previamente hemos caracterizado VDR importación mitocondrial en las células HaCaT, se utilizó este modelo para investigar la función VDR mediante silenciamiento genético. La reducción de los niveles de VDR a la entrega de lentiviral shRNA que había sido levantado en contra de la VDR humano fue notable, como lo demuestra el ARNm y análisis de proteínas en la fig. 1A y 1B, y desencadenan la detención del crecimiento potente en células HaCaT, según se evaluó usando un ensayo de proliferación, lo que pone de relieve una disminución evidente en la tasa de crecimiento en las células silenciadas-VDR en comparación con las células control (Fig. 1C). la detención del crecimiento celular se caracteriza por la acumulación de la población de células VDR derribar en la fase G0 /G1 del ciclo celular y una disminución en la población de células en fase M (fig. 1D). No hay signos de células apoptóticas o que sufren fueron evidentes en las células silenciadas, como se ha demostrado por análisis del ciclo celular, que no reveló un pico sub-G0, y el ensayo de toxicidad MTT, que reveló la viabilidad idéntica en el control y las células silenciadas (fig. 1E).
Las células subconfluentes HaCaT fueron infectadas con lentivirus shRNA VDR 3 y partículas shRNA de control. Siete días después de la infección y selección de puromicina, la expresión de VDR se evaluó en los extractos celulares. (A) los niveles de expresión de ARNm se cuantificaron utilizando análisis en tiempo real de transcritos de VDR, y los valores se expresan como cambios veces en las células silenciadas en comparación con los controles. (B) la expresión de VDR en las fracciones mitocondriales (paneles de la izquierda) y los lisados totales (paneles de la derecha) a partir de células transfectadas VDR-shRNA control y transfectadas con shRNA se analizó mediante Western Blot. Tubulina detectada en extractos totales y niveles de VDAC en fracciones mitocondriales se utilizaron como controles internos para la carga de proteínas. Los efectos de VDR silenciamiento sobre la proliferación se evaluó usando un ensayo de cristal violeta en células que habían sido teñidas en diversos momentos después de la siembra (C), así como el uso de análisis del ciclo celular (D) en las células que fueron cosechadas en el día 7 después de la infección . (E) La viabilidad celular se evaluó usando el ensayo de MTT en el día 7 después de la infección y los valores se expresan como el porcentaje de absorbancia del control shRNA. Los datos se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 comparado con el control
El diferenciador y la acción antiproliferativa de la vitamina D in vitro se ha descrito previamente en la literatura. Tales efectos están mediados por control de la transcripción, que está precedido por la translocación nuclear y no se produce en las células HaCaT D estimulada vitamina [12]. células HaCaT parecen ser resistentes a los efectos antiproliferativos nucleares de la vitamina D, y en consecuencia, se encontró que el tratamiento con vitamina D no alteró la tasa de crecimiento de las células HaCaT (como se muestra en S1 fig.). Así, las células HaCaT representan un modelo de resistencia a las propiedades de diferenciación de la vitamina D, y no hay ninguna incongruencia entre el papel antiproliferativo nuclear de la vitamina D se describe en la literatura y los efectos proliferativos ejercidas por VDR en nuestro modelo celular. Los resultados de nuestros experimentos muestran que el silenciamiento de VDR en las células HaCaT aumenta el crecimiento celular.
mitocondrial localización de la VDR es una característica común de las líneas celulares de cáncer humano, y el silenciamiento del receptor inhibe la proliferación celular
para evaluar si las mitocondrias pueden ser considerados como un objetivo regular de la VDR, se evaluó su expresión en un panel de líneas celulares de cáncer humano y las células HaCaT anteriormente mencionados (Fig. 2A). En cada línea celular que dio positivo para la expresión VDR, los extractos mitocondriales se analizaron mediante Western Blot y revelaron la presencia del receptor. La hipótesis de que si el VDR era una característica de las células en proliferación y tenía el potencial de facilitar el crecimiento celular, como lo sugiere el fenotipo observado en las células HaCaT silenciados, entonces podría fácilmente ser salvo, o incluso eliminar, en un estado diferenciado. Por lo tanto, se evaluó VDR niveles de expresión en dos modelos, lo que permite el examen de proliferación de las células humanas y sus homólogos diferenciados: Se comparó HaCaT la proliferación de células de queratinocitos a totalmente diferenciada queratinocitos primarios y células de rabdomiosarcoma RD18 que habían sido inducidas a diferenciarse por la expresión condicional de miR-206 [16]. extractos mitocondriales de ambas poblaciones de células diferenciadas reveladas disminuyeron la expresión del receptor en comparación con los niveles observados en la proliferación de las células (fig. 2B).
expresión VDR
(A) fue analizada en un panel de varias líneas de células humanas utilizando el Western Blot en lisados totales (TOT VDR) y extractos mitocondriales (Mitoc VDR). Para las células RD y MCF7, detección VDR requiere una mayor duración de la exposición a la ECL. (B) Se utilizaron dos modelos de diferenciación celular para evaluar los niveles de VDR en los lisados totales y fracciones mitocondriales: Las células humanas en proliferación HaCaT frente a los queratinocitos diferenciados primarios humanos y células de diferenciación RD18-inducible que llevan un miR-206 que expresan el vector lentiviral inducible por doxiciclina en ausencia (no inducido: nI) o presencia de doxiciclina para cuatro (indujeron: IND4) y seis días (inducido: IND6). Tubulina detectada en extractos totales y niveles de VDAC en fracciones mitocondriales se utilizaron como controles internos para la carga de proteínas. Las transferencias son representativos de un conjunto de tres experimentos independientes
Después de haber detectado la expresión mitocondrial generalizada del VDR, hemos tratado de confirmar que la ablación VDR compromete la proliferación celular.; Por lo tanto, la expresión de VDR abolido en todas las líneas celulares de cáncer utilizando el silenciamiento genético. expresión VDR fue silenciado en todas las líneas celulares VDR-positivas, así como las células HaCaT, y la expresión del receptor se reduce una vez más fuertemente, como se evaluó tanto en los extractos totales y las fracciones mitocondriales (Fig. 3A). Las observaciones hechas en las células HaCaT fueron fuertemente apoyados por los resultados de estos experimentos desmontables debido a la proliferación de todas las células fue marcadamente inhibida por VDR silenciamiento. De hecho, hemos sido capaces de demostrar una reducción general de la tasa de proliferación de todas las células silenciadas, que era similar a la observada en las células HaCaT, cuando se evaluó su crecimiento entre 72 h y 5 días, en comparación con la de los salvajes células de tipo (fig. 3B). El fenotipo silenciado se confirmó usando un shRNA diferente para el VDR (ShRNA 4, como se describe en la sección Métodos), que fue tan eficiente en el silenciamiento del VDR como ShRNA 3 y también disminuyó el crecimiento celular (S2 fig.). Por otra parte, cuando emitido shRNA que era ineficaz en términos de VDR silenciamiento (ShRNA 2, como se describe en la sección Métodos) la proliferación de las células HaCaT no estaba limitada (S2 fig.).
(A) las células se infectaron con lentiviral VDR shRNA 3 o shRNA control y la eficacia de silenciamiento se examinó tanto en los extractos totales y mitocondriales utilizando el Western Blot. Tubulina detectada en extractos totales y niveles de VDAC en fracciones mitocondriales se utilizaron como controles internos para la carga de proteínas. (B) Tanto los silenciados y las células de control se sometieron a ensayos de proliferación de siete días después de la infección y selección. Las células se tiñeron a las 72 horas o cinco días después de la siembra, y los valores de las células silenciadas se expresan como el porcentaje de sus respectivos controles. Los datos se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
silenciamiento VDR mejora la respiración mitocondrial
Otros receptores de esteroides se han indicado anteriormente para regular la transcripción mitocondrial y la actividad [17] - [19], nos llevó a investigar si el VDR, que se localiza en el compartimiento mitocondrial (similar a sus análogos de la familia), controla el metabolismo mitocondrial. En primer lugar, se evaluó la actividad respiratoria mitocondrial de las células HaCaT mediante la medición de las variaciones en el potencial de membrana a través de análisis de JC-1 utilizando citofluorimetría. Como se muestra en la fig. 4A, VDR silenciamiento aumentó fuertemente el potencial de membrana mitocondrial, y cuando sometimos estas células al estrés oxidativo (H
2O
2), su potencial se vio afectada en un grado mayor que el de células de tipo salvaje sometidas a la misma tratamiento (fig. 4A). Sin embargo, cuando las células fueron expuestas a una tensión diferente, no oxidativa (por ejemplo, sorbitol inducida por estrés osmótico), el potencial mitocondrial de tanto de tipo salvaje y derribar células disminuyeron en la misma medida (fig. 4B). Basándose en estas observaciones, se concluyó que el VDR inhibe el potencial de membrana mitocondrial y es probable que contuvo la producción de ROS, la protección de la célula de estrés oxidativo adicional. Por el contrario, la pérdida de VDR aumentó el potencial respiratoria, pero las células prestados más propensos a un colapso potencial oxidante de motor. Esta posibilidad fue apoyada por el consumo significativamente menor de glutatión (GSH) en las células de tipo salvaje, como se revela por los niveles más altos de la molécula antioxidante que se midieron en las células de tipo salvaje en comparación con las células silenciadas (S3 fig.).
células HaCaT fueron infectadas con el control de shRNA o VDR shRNA 3 y el potencial de membrana mitocondrial se examinó utilizando JC-1 evaluación cytofluorimetric, en presencia o ausencia de dos factores de estrés diferentes: (a) control y las células silenciadas se trataron con mM H 10
2O
2 o (B) 0,5 M de sorbitol. En ambas figuras, una imagen representativa del análisis citofluorimétrico se muestra en el panel superior, mientras que los resultados de tres experimentos separados se representan en el gráfico en el panel inferior. La relación FL-2 /FL-1 se calculó, y los valores se expresan como un porcentaje del control no tratado shRNA. * P & lt; 0,05 comparado con el control sin tratar shRNA,
$ P & lt; 0,05 comparado con el control shRNA tratada. (C) el análisis en tiempo real de la COX II (COX II) y IV (COX IV) expresión de la subunidad de transcripción en el control y las células silenciadas. Plegables cambios se representan en los gráficos como las medias ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 comparado con el control shRNA. las células (D) HaCaT fueron cultivadas en la presencia o ausencia de 10 nM expresión vitamina D y COX II y COX IV transcripción fueron evaluados utilizando el análisis en tiempo real después de 24 y 48 horas de tratamiento. Los valores representados en los gráficos representan el cambio veces en la expresión de transcripción en tratados frente a las células no tratadas y se muestran como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
§ P & lt; 0,05 y
§§ P. & Lt; 0,01 en comparación con las células no tratadas
potencial mitocondrial es sostenida por el gradiente de protones que se crea por la actividad de la cadena respiratoria; por lo tanto, decidimos examinar la expresión de dos subunidades del complejo IV: citocromo c oxidasa (COX) subunidades II y IV, cuyos transcritos son de mitocondrial (la primera) y nuclear (el último) origen. Ambas proteínas nucleares y mitocondrial codificados son necesarios para la formación de complejos respiratorios activos. ARNs mitocondriales se transcriben como precursor transcripciones largas, polycistronic que luego se procesan para liberar los ARNr y ARNm individuales. Por lo tanto, hemos considerado la COX II a ser un marcador de la actividad de transcripción mitocondrial y COX IV ser un marcador de la contribución nuclear a la modulación de la cadena respiratoria.
se observó aumento de expresión de ambas subunidades en las células silenciadas en comparación con las células control el uso de PCR (fig. 4C) en tiempo real. Con el fin de confirmar que el VDR afectada negativamente la COX transcripción, se trataron células HaCaT tipo salvaje con la vitamina D y observamos que los niveles de todas las transcripciones se redujeron (fig. 4D). Dado el hecho de que la transcripción de la subunidad IV es nuclear, mientras que la subunidad II está codificada por el ADN mitocondrial (ADNmt), llegamos a la conclusión de que la vitamina D control transcripcional se ejerce en ambos niveles, lo cual no es sorprendente dado el hecho de que la energía nuclear y mitocondrial la transcripción de las proteínas de la cadena respiratoria está finamente sintonizado [20].
Debido a que la modulación de la transcripción mitocondrial por el VDR no se ha descrito previamente, se consideró la posibilidad de la unión directa del receptor de ADNmt.
in silico
análisis se realizó con el objetivo de cribado para identificar ADNmt elemento sensible a los sitios de vitamina D (ERVD). Se utilizó una secuencia de VDRE representado por un conjunto de matrices de peso de posición (como se describe en la sección Métodos y se muestra en la Tabla S1B) para calcular la afinidad de la VDR para la secuencia de ADNmt. Se encontró que sólo dos sitios ERVD tener puntos de corte de alta afinidad (89% y 82% de la puntuación máxima) y ambos se encuentra en el circuito de desplazamiento (D-loop), un no codificante y la región reguladora. También se identificaron un total de 40 ERVD sitios con puntuaciones de baja afinidad (& gt; 60% del máximo) agrupado en unas pocas regiones (véase el cuadro 1 para una descripción de los sitios ERVD de mayor afinidad y la tabla S1 A para la lista completa). En algunos casos, estos sitios VDRE están formados por múltiples repeticiones, que indica una presencia importante de sitios en estas regiones de unión. Es de destacar que la gran mayoría de los sitios VDRE se encontraron en la hebra inversa, que es probablemente debido a la asimetría de la distribución de nucleótidos ADNmt. Además, los sitios de baja afinidad se enriquecieron en el segmento hipervariable 1 (p = 0,01425). La alta afinidad de los sitios identificados ERVD permite la posibilidad de control de la transcripción directa mediada por VDR de ADNmt. se planean más estudios para investigar las características de esta unión.
El aumento del potencial de membrana que se observó en las células silenciadas, combinado con la expresión inducida de COX transcripciones, demostró que la cadena respiratoria se potenció en silenciados células HaCaT.
en conjunto, nuestros resultados indican que el VDR desempeña un papel en la modulación negativa de la expresión de la cadena respiratoria y la actividad respiratoria, que ambos moderados potencial de membrana y tiene un efecto protector contra el estrés oxidativo.
silenciamiento VDR minimiza la utilización de acetil-CoA en las rutas biosintéticas
en un esfuerzo por vincular el crecimiento celular reducida y el aumento del potencial mitocondrial que se observó en VDR derribar las células, la hipótesis de que la intensa actividad de la cadena respiratoria estimula el ciclo de TCA en las células silenciadas. En las células quiescentes, la función fundamental de la mitocondria es producir ATP a través de una cadena de transporte electrónico de ciclo de la alimentación de TCA y la fosforilación oxidativa con el fin de suministrar energía para una variedad de funciones celulares; en contraste, las células cancerosas no dependen en gran medida de la fosforilación oxidativa por sus demandas de energía y volver a dirigir intermediarios del ciclo TCA para preservar su función biosintética. Por lo tanto, en la proliferación de las células, las vías mitocondriales se rewired para apoyar la proliferación.
Nuestros datos sugieren que el VDR, la reducción de las demandas metabólicas de la cadena respiratoria, puede volver a programar el ciclo de TCA y sus intermedios puede ser utilizada en los procesos biosintéticos . Con el fin de probar esta hipótesis, se analizaron las vías biosintéticas que dependen de la acetil-CoA desviado de catabolismo mitocondrial. En primer lugar, se consideró que los productos de la cascada de mevalonato, es decir, el colesterol, la ubiquinona y unidades isoprenicas esenciales para las modificaciones post-traduccionales de las proteínas. El colesterol y la ubiquinona
de novo síntesis se midió en las células HaCaT. derribar las células de control y VDR se marcaron con [
3H] acetato de etilo y el contenido de lípidos de las células fue ensayada mediante TLC. VDR silenciamiento disminuyó la
de novo
síntesis de colesterol (fig. 5A), mientras que la tasa de biosíntesis de ubiquinona no fue afectada por el silenciamiento (fig. 5B). La síntesis de las unidades de isoprenicas se midió como el estado de la prenilación de dos pequeñas GTPasas: RhoA y Ras. VDR silenciamiento produjo una reducción de la prenilación de ambas proteínas, mientras que su expresión en general se mantuvo sin cambios (Fig. 5C).
Las células HaCaT fueron infectadas con el control de shRNA o VDR shRNA 3 y rutas biosintéticas se examinaron siete días después de la infección. La vía del mevalonato se evaluó como la
de novo síntesis del colesterol (A) y la ubiquinona (B). Los valores representan la media ± SD de tres experimentos independientes. (C) unidades isoprenoides producidos por la misma vía se analizaron como incorporación resto prenil en la pequeña GTPasas RhoA y Ras. Control y células silenciadas se recogieron y los lisados se sometieron a TX-114-fase de extracción con el fin de separar las formas prenilados. Las proteínas totales y prenilados se analizaron mediante transferencia Western. VDAC y la expresión de actina demostraron la carga equivalente de proteína de los extractos de fase y el total de hidrofóbicos, respectivamente. (D) los niveles de acetilación de histonas se evaluaron mediante análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-acetil H4 y tubulina como control de carga. Las transferencias son representativos de un conjunto de tres experimentos independientes.
Finalmente, se evaluó la disponibilidad de unidades de acetilo para fines biosintéticos como la acetilación de histonas y el silenciamiento VDR también disminuyó este proceso, que se midió como la histona H4 acetilación (fig. 5D).
en conjunto, estas observaciones indican que al VDR silenciamiento, el aumento de la actividad de la cadena respiratoria oxida intermediarios metabólicos, impidiendo su utilización en vías de biosíntesis. Hemos demostrado la desviación ejemplar de acetil-CoA, la incorporación de los cuales se reduce durante la biosíntesis del colesterol, eventos prenilación y la remodelación de las histonas.
Discusión
Nuestro trabajo previo en las células HaCaT demostró VDR localización mitocondrial y el mecanismo de importación. En el presente estudio, hemos identificado un nuevo papel sorprendentemente importante para el receptor de la función de orgánulos y el metabolismo celular debido a que ha mostrado una actividad VDR profundamente impactos que la proliferación.
funciones mitocondriales han sido previamente descrito para otros receptores de esteroides, varios de que estimulan la respiración mitocondrial y por lo tanto son considerados ya sea diferenciar los receptores de hormonas (es decir, el receptor de tiroides, receptor beta de estrógeno y el receptor de andrógenos) o potenciadores de gasto de energía y los proveedores (es decir, el receptor de glucocorticoides) [17], [21], [22]. estímulo hormonal afecta la transcripción de la fosforilación oxidativa mitocondrial codificada tanto indirectamente, mediante la inducción de señales nucleares (tales como factores de transcripción mitocondrial, que regulan positivamente la transcripción del genoma mitocondrial), y directamente, mediante la localización en el orgánulo y la interacción con los elementos de respuesta en el ADN mitocondrial [ ,,,0],23]. Hasta la fecha, la función de VDR en las mitocondrias permanece sin caracterizar.
En el presente estudio, hemos demostrado que el VDR promueve la proliferación, como su silenciamiento fuertemente afecta a la tasa de crecimiento de HaCaT y otras líneas celulares de cáncer que expresa una VDR mitocondrial. A partir de las células HaCaT previamente caracterizados y extendiendo el análisis a otros modelos celulares, encontramos que la localización mitocondrial del receptor es una característica generalizada de las células en proliferación, y la asociación del VDR con la proliferación se vio reforzada por los resultados de nuestro análisis de las diferenciada Células. Se observó disminución de los niveles de VDR mitocondriales en dos modelos diferentes de células diferenciadas (cultivos primarios de queratinocitos representan la diferenciación fisiológica, mientras que las células inducidas RD18-miR-206 representan un estado diferenciado miARN-conducido). En nuestra opinión, esto es una observación interesante que merece una mayor investigación de los efectos metabólicos y los mecanismos moleculares que regulan VDR regulación a la baja en las células quiescentes.
La literatura anterior describió las propiedades diferenciadoras de la vitamina D, tradicionalmente mediada por efectos nucleares de VDR en la transcripción. Sin embargo las células de cáncer a menudo son resistentes a las propiedades antiproliferativas y diferenciadoras de la vitamina D, como resultado de la mayor asociación de la VDR con corepressors en chromatine [24]. Esto ha sido reportado para el cáncer de piel, entre los otros [25]. La línea celular de queratinocitos proliferantes humano HaCaT no responde a la acción antiproliferativa de la vitamina D (S1 fig.), Y que previamente demostró que la translocación nuclear de la VDR, que es un requisito previo para la actividad transcripcional, no es inducida tras la estimulación de ligando [12 ], lo que indica ineficaz, o débil, la señalización de VDR nuclear en estas células. Por lo tanto, las células HaCaT representan un buen modelo que se puede utilizar para examinar los efectos de la actividad mitocondrial VDR en un fondo eran las propiedades diferenciadoras de la vitamina D se han perdido.
silenciamiento genético del VDR en las células HaCaT producido dos efectos que fueron vinculado: proliferación que correspondía a un aumento en la expresión de la cadena respiratoria y el potencial de membrana mitocondrial reducida. Tuvimos evidencia de que el VDR equilibra actividad de la cadena de electrones, lo que resulta en doble ventaja para la célula: protección contra el estrés oxidativo y el apoyo para la proliferación a través de intermediarios biosintéticos fácilmente disponibles. Se llegó a la conclusión anterior cuando se observó la mayor vulnerabilidad de las células silenciadas a un fuerte insulto oxidativo, acompañada de una disminución de la piscina GSH intracelular. La última interpretación, el otro principal hallazgo de nuestro trabajo, fue sugerido por los experimentos encaminados a evaluar la capacidad de biosíntesis de las células HaCaT silenciados. Se analizaron diferentes rutas biosintéticas que dependen de la acetil-CoA de origen mitocondrial. Acetil-CoA es un elemento vital para la biosíntesis endógena de ácidos grasos y colesterol y participa en modificaciones de las proteínas a base de isoprenoides; acetil-CoA también se requiere para reacciones de acetilación que modifican proteínas, tales como la acetilación de histonas. Se encontró que el VDR derribar células muestra una tasa de biosíntesis reducido de la vía del mevalonato, medida como la reducción de la producción de moléculas de colesterol y prenil para ser empleadas en la modificación de proteínas. Se excluyó el hecho de que en nuestros experimentos nos (HMG-CoA) reductasa, una enzima clave en la cascada de mevalonato borrando modulación positiva de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A porque los niveles de uno de los productos de la ruta, ubiquinona (CoQ), no fueron afectados por el silenciamiento VDR. En lugar de ello, atribuimos la tasa de biosíntesis obstaculizado a la disminución de la disponibilidad de acetil-CoA, y esta posibilidad ha sido validada por la observación de que el silenciamiento VDR también disminuyó la acetilación de histonas. La insensibilidad de la síntesis de ubiquinona a una disminución en los niveles de acetil-CoA, que es crítica para otros lípidos, puede ser debido a las diferencias en los valores de Km de las enzimas de punto de ramificación en la vía del mevalonato. El principio de la hipótesis de desviación de flujo clásica indica que las variaciones en el tamaño de la piscina precursor se influyen principalmente la síntesis de colesterol debido a que la Km de la escualeno sintasa por su sustrato es alta, mientras que todas las otras enzimas rama de punto presentan baja valores de Km y de la enzimas limitantes de la velocidad de la rama de biosíntesis de CoQ pueden tener las tarifas más valores de Km. Por desgracia, los datos detallados de la síntesis de CoQ en los tejidos animales aún no se han dilucidado.
Llegamos a la conclusión de que el VDR, mediante la restricción de la actividad respiratoria mitocondrial, perdona a los intermediarios metabólicos mitocondriales, que pueden ser objeto de desviación del metabolismo oxidativo hacia un destino biosintética . Los productos finales que resultaron ser afectados por este cambio en el presente estudio son esenciales para la proliferación; en particular, el colesterol, que se incorpora de forma continua en las membranas, y varios informes indican que colesterogénesis se eleva mucho en diversas células de cáncer [26] - [28]. Además, prenilación es una modificación post-traduccional de varias GTPasas pequeñas y es esencial para el atraque y la actividad de estas enzimas; obstaculizar la actividad GTPasa interfiere con la proliferación, que se ha informado ampliamente para las dos pequeñas GTPasas que fueron analizadas en el presente estudio, RhoA y Ras, la prenilación de que se requiere para su capacidad para inducir la transformación maligna, la invasión y la metástasis [29] . Por último, el estado de acetilación de histonas es un aspecto importante de la proliferación, ya que representa una estrategia de control epigenético remodelación de la cromatina. follows:
5′-CCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATCTCGAGATCATTCACACGAACTGGAGGTTTTT-3′,
5′-CCGGCTCCTGCCTACTCACGATAAACTCGAGTTTATCGTGAGTAGGCAGGAGTTTTTG-3′,