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PLOS ONE: El resveratrol mejora la actividad antitumoral de TRAIL en xenoinjertos de cáncer de próstata a través de la activación del factor de transcripción FOXO

2015/12/8


Extracto

Antecedentes

El resveratrol (3, 4 ', 5-tri hidroxiestilbeno), un polifenol natural, presenta una actividad antiinflamatoria, antioxidante, cardioprotectores y antitumorales. Recientemente hemos demostrado que el resveratrol puede aumentar el potencial de inducción de apoptosis de TRAIL en células de cáncer de próstata a través de múltiples mecanismos de
in vitro
. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para validar si el resveratrol puede aumentar el potencial de inducción de apoptosis de TRAIL en un modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata.

Metodología /Principales conclusiones

El resveratrol y solo RUTA crecimiento inhibido de xenoinjertos de PC-3 en ratones desnudos mediante la inhibición de la proliferación celular tumoral (PCNA y tinción Ki67) y la inducción de apoptosis (tinción de TUNEL). La combinación de resveratrol y TRAIL fue más eficaz en la inhibición de crecimiento del tumor que un único agente. En los tumores xenoinjertados, el resveratrol regula positivamente la expresión de TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, Bax y p27
/K IP1, y se inhibe la expresión de Bcl-2 y ciclina D1. El tratamiento de ratones con resveratrol y TRAIL solo inhibe la angiogénesis (como se demuestra por la reducción de número de vasos sanguíneos, y las células de VEGF y VEGFR2 positivos) y los marcadores de la metástasis (MMP-2 y MMP-9). La combinación de resveratrol con RUTA número más inhibidos de los vasos sanguíneos en los tumores, y haciendo circular el receptor del factor de crecimiento endotelial células endoteliales 2-positivas que un único agente. Además, el resveratrol inhibió la fosforilación citoplásmica de FKHRL1 que resulta en su activación mejorada como se demuestra por el aumento de la actividad de unión de ADN.

Conclusiones /Importancia

Estos datos sugieren que el resveratrol puede mejorar el potencial de inducción de apoptosis de TRAIL mediante la activación de FKHRL1 y sus genes diana. La capacidad de resveratrol para inhibir el crecimiento del tumor, la metástasis y la angiogénesis, y aumentar el potencial terapéutico de TRAIL sugiere que solo o en combinación con TRAIL resveratrol puede ser utilizado para el tratamiento del cáncer de próstata

Visto:. Ganapathy S, Chen Q, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) El resveratrol mejora la actividad antitumoral de TRAIL en xenoinjertos de cáncer de próstata a través de la activación del factor de transcripción FOXO. PLoS ONE 5 (12): e15627. doi: 10.1371 /journal.pone.0015627

Editor: Hiranmoy Das, El Centro Médico de la Universidad del Estado de Ohio, Estados Unidos de América

Recibido: 19 de septiembre de 2010; Aceptado: 17 Noviembre 2010; Publicado: December 28, 2010

Derechos de Autor © 2010 Ganapathy y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

El resveratrol (3, 4 ', 5 tri- hidroxiestilbeno), un polifenol de origen natural, exhibe beneficios para la salud pleiotrópicos que incluyen actividades anti-inflamatorio, antioxidante, cardioprotectores y antitumorales [1], [2], [3], [4]. En la actualidad, numerosos hallazgos preclínicos sugieren resveratrol como un agente prometedor para la prevención y /o tratamiento del cáncer. Como un agente potencial contra el cáncer, el resveratrol se ha demostrado para inhibir o retardar el crecimiento de varias células cancerosas
in vitro
e implantados en tumores en vivo [5], [6], [7], [8] , [9]. Resveratrol se ha demostrado que inhiben la activación de JAK2-STAT3, Src-STAT3, AKT y las vías de IKK-NFkB y para inducir la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer [10], [11], [12], [13]. Recientemente hemos demostrado que el resveratrol downregulated la expresión de Bcl-2, Bcl-X
L y survivina y upregulated la expresión de Bax, Bak, PUMA, Noxa, y Bim y receptores de muerte (TRAIL-R1 /TRAIL DR4 y R2 /DR5) [1], [14], [15]. Además, el tratamiento de la próstata células cancerosas con resveratrol resultó en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la translocación de Bax a la mitocondria y la posterior caída en el potencial de membrana mitocondrial, la liberación de proteínas mitocondriales (citocromo c, Smac /DIABLO, y AIF) a citosol , la activación de efector caspasa-3 y caspasa-9, y la inducción de la apoptosis [1], [14], [15]. la producción de ROS Resveratrol inducida, la actividad de caspasa-3 y la apoptosis se inhibe por la N-acetilcisteína, lo que sugiere la producción de ROS, al menos en parte, desempeña un papel en la mediación de las actividades contra el cáncer de resveratrol [1], [14], [15]. Resveratrol mejora el potencial inductor de apoptosis de TRAIL en las células PC-3 y células LNCaP de cáncer de próstata resistente a TRAIL sensibilizados
in vitro
[1], [14], [15]. En general, estos datos sugieren que el resveratrol puede regular múltiples vías de señalización y posee varios beneficios terapéuticos.
Señalización
PI3K juega un papel fundamental en las vías de transducción de señales intracelulares que participan en la transformación celular, crecimiento celular, y la tumorigénesis [16], [ ,,,0],17]. La inactivación de los resultados de Akt en la desfosforilación y la activación de factores de transcripción FOXO, informó de mediar la detención del ciclo celular, reparación del ADN, y la apoptosis [18], [19]. Estos factores de transcripción, pertenecen a la 'O' subgrupo de /forkhead familia de factores de transcripción alas de hélice, representados principalmente por cuatro miembros FoxO1, FOXO3A, foxo4, y FOXO6 [20]. proteínas FOXO se conservan evolutivamente factores de transcripción implicados en varios procesos celulares fundamentales, que funciona como punto final para los programas transcripcionales implicados en la apoptosis, la respuesta al estrés y la longevidad [21], [22]. Desde la abrogación de la función FOXO se observa frecuentemente en el cáncer humano, la reactivación de proteínas FOXO será una estrategia atractiva para la terapia del cáncer y la prevención. Las proteínas FOXO integran entradas de regulación de una variedad de vías de señalización aguas arriba, lo más importante en respuesta al factor de crecimiento y el estrés de señalización [23]. Recientemente, los factores FOXO se han establecido como supresores de tumores, la promoción de la transcripción de moléculas pro-apoptóticas como FasL y Bim cuando la vía PI3K /AKT está regulado por disminución debido al hambre de nutrientes o el suero y el estrés celular [24], [25]. modelos triples ratón knockout demostraron las propiedades supresoras de tumores de Foxos, ya que los ratones que carecen de forma simultánea los principales miembros de la subfamilia de mamíferos FOXO, FoxO1, FOXO3a y foxo4, son propensos a desarrollar los hemangiomas y enfermedades linfoproliferativas [26]. Por el contrario, el individuo o la inactivación emparejada de FoxO1, FOXO3a o foxo4 dieron como resultado un fenotipo menos grave, apoyando la idea de la redundancia funcional de estos factores FOXO [26]. Además, la expresión forzada de FOXO se ha demostrado que inhibe la tumorigénesis en modelos de xenoinjerto en ratones desnudos [27], [28]. Por lo tanto, la reactivación de FOXO basado en sus propiedades supresores de tumores se considera como una estrategia muy atractiva anti-cáncer. Desde que se informó de proteínas FOXO ser mediadores importantes de la apoptosis inducida por medicamentos contra el cáncer, que postula que la expresión FOXO o actividad transcripcional podrían ser acontecimiento importante en la mediación de los efectos del resveratrol.

ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL ) se ha demostrado que TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5 [29]. Nosotros y otros han demostrado que TRAIL puede inducir la apoptosis en varios tipos de células de cáncer [29], [30], [31], [32], [33]. Con base en los datos preclínicos, parece que TRAIL tiene una gran promesa como un agente contra el cáncer selectiva [31], [32]. El resveratrol se ha demostrado para mejorar el potencial terapéutico de TRAIL
in vitro
[14], [34]. Las interacciones de resveratrol y TRAIL fueron bloqueados por cualquiera dominante FADD negativo o caspasa-8 siRNA [14], [15]. La combinación de resveratrol y TRAIL mejorado las disfunciones mitocondriales durante la apoptosis. tratamiento Resveratrol puede activar la vía de la muerte extrínseca mediada por TRAIL-receptor, lo que aumenta la sensibilidad a TRAIL en células de cáncer de próstata. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los que el resveratrol puede mejorar el potencial terapéutico de TRAIL
in vivo
no ha sido examinada.

El objetivo de nuestro estudio fue investigar los mecanismos moleculares por los que el resveratrol mejora la potencial terapéutico de TRAIL en xenoinjertos de cáncer de próstata en ratones desnudos. Nuestros resultados indican que el resveratrol inhibe la PC-3 de crecimiento de xenoinjerto y los marcadores de la metástasis, y la angiogénesis a través de la activación de factores de transcripción FOXO. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que el resveratrol puede ser utilizado solo o en combinación con TRAIL para la gestión de de cáncer de próstata.

Resultados

Resveratrol aumenta la actividad antitumoral de tumor TRAIL en PC-3 xenoinjertos
in vivo

recientemente hemos demostrado que el resveratrol puede mejorar el potencial de inducción de la apoptosis de TRAIL
in vitro
. Por lo tanto, en el presente estudio, se examinó si el resveratrol puede aumentar la actividad antitumoral de TRAIL
in vivo
. las células PC-3 fueron xenoinjerto en ratones Balb c ratones desnudos. Después de la formación de tumores, estos ratones fueron tratados con resveratrol, TRAIL, o más resveratrol TRAIL durante 6 semanas y se examinaron los efectos de estos agentes sobre el crecimiento del tumor. Resveratrol y TRAIL solo inhibía el crecimiento de xenoinjertos de PC-3 (Fig. 1). En comparación, la combinación de resveratrol y TRAIL fue más eficaz en la inhibición de crecimiento del tumor que un único agente.

(A), se inyectaron células PC-3 en los flancos derecho de ratones Balb c ratones desnudos. Después de la formación de tumores (alrededor de 100 mm
3), los ratones fueron tratados con solución salina, el resveratrol (30 mg /kg, tres días por semana), TRAIL (15 mg /kg, cuatro veces durante las tres primeras semanas) o resveratrol más TRAIL . El volumen del tumor se midió semanalmente. Los datos representan la media ± SE. *,#Y $ son significativamente diferentes de control, p. & Lt; 0,05) guía empresas
Estos datos sugieren que el resveratrol puede aumentar la actividad antitumoral de TRAIL en el cáncer de próstata

Reglamento del tumor. proliferación celular y la apoptosis por el resveratrol y /o TRAIL en PC-3 xenoinjertos

proliferación de células tumorales y la apoptosis puede regular el tamaño del tumor en cualquier momento dado. Por lo tanto, se realizó inmunohistoquímica en tejidos tumorales para medir la expresión de Ki67 y PCNA, y el ensayo de TUNEL para medir la apoptosis (Fig. 2A). la proliferación de células del tumor se midió contando las células Ki67 y PCNA positivas, y la apoptosis se midió contando TUNEL células positivas (Fig. 2B-D). El tratamiento de ratones con resveratrol y TRAIL solo dio lugar a la inhibición de la proliferación de células tumorales, y la inducción de la apoptosis. La combinación de resveratrol y TRAIL fue más eficaz en la inhibición de proliferación de células tumorales y la inducción de la apoptosis de un único agente. Estos datos sugieren que el resveratrol, aunque es eficaz por sí solo, puede mejorar la actividad antitumoral de TRAIL en el cáncer de próstata.

(A), inmunohistoquímica se realizó en tejidos tumorales derivadas de control, resveratrol y /o ratones tratados mapa en semana 6 para medir la proliferación celular por Ki67 y PCNA tinción y la apoptosis mediante el ensayo TUNEL. (B, C y D), la cuantificación de Ki67, PCNA y las células tumorales positivas TUNEL. tumor diapositivas de diferentes grupos de tratamiento se visualizaron bajo microscopio, y se cuantificaron las células positivas Ki67, PCNA y TUNEL. Los datos representan la media ± SE. * Y ** son significativamente diferentes de sus respectivos controles, p. & Lt; 0,05) guía empresas

En vivo
regulación de los receptores de muerte TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5 por resveratrol y /o TRAIL

Desde el resveratrol aumenta el potencial terapéutico de TRAIL induciendo la apoptosis
in vivo
, tratamos de examinar los mecanismos moleculares por los que el resveratrol aumenta la actividad antitumoral de TRAIL en PC- 3 xenoinjertos. A continuación examinó los efectos del resveratrol y /o TRAIL en la expresión de receptores de muerte (TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5) por inmunohistoquímica en tejidos tumorales derivadas de
in vivo
experimento (Fig. 3A , la izquierda y la derecha paneles). El tratamiento de ratones con resveratrol mejora la expresión de DR4 y DR5. TRAIL induce ligeramente la expresión de DR4 y DR5. Por otro lado, el tratamiento de ratones con una combinación de resveratrol más TRAIL mostró significativamente mejoradas expresiones de proteínas DR4 y DR5 que la de los ratones tratados con resveratrol solos o TRAIL solo.

(A), inmunohistoquímica se realizó a medir la expresión de TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5 en tejidos tumorales derivadas de ratones control y tratados en la semana 6. la cuantificación de DR4 y DR5 células positivas también se muestran en el panel derecho. (B), las expresiones de TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5 y β-actina en los tejidos tumorales derivadas de la semana 6. El análisis de transferencia Western se realizó para medir la expresión de los DR (panel izquierdo). La cuantificación de DR4 y DR5 células tumorales positivas (panel derecho). (C), la medición de DR4 y DR5 por ELISA. extractos de proteínas se prepararon y las expresiones de los proyectos de resolución se midieron según las instrucciones del fabricante.

Hemos confirmado los datos de inmunohistoquímica mediante el examen de la expresión de estas proteínas mediante el análisis de Western blot (Fig. 3B). El tratamiento de ratones con resveratrol y TRAIL solo resultó en la regulación positiva de los receptores de muerte DR4 y DR5. En comparación, el resveratrol más TRAIL tratamientos tenían más efectos sobre la inducción de DR4 y DR5 en comparación con un único agente. Estos datos están de acuerdo con los datos de inmunohistoquímica, donde fueron regulados al alza los pro-apoptóticos proteínas DR4 y DR5.

A continuación confirmó los datos de transferencia Western inmunohistoquímica y mediante el examen de las expresiones de los proyectos de resolución por ELISA (Fig. 3C, panel derecho). El tratamiento de ratones con resveratrol y TRAIL solo upregulated la expresión de receptores de muerte (DR4 y DR5). En comparación, la combinación de resveratrol inducida por TRAIL además más expresiones DR4 y DR5 que un único agente. Estos datos están de acuerdo con la inmunohistoquímica y Western blot datos donde los pro-apoptóticos proteínas DR4 y DR5 se upregulated por el resveratrol y TRAIL. Sobre regulación de los DR puede aumentar el potencial de inducción de apoptosis de TRAIL.


En vivo
regulación de los miembros de la familia Bcl-2 y proteínas reguladoras del ciclo celular por el resveratrol y /o TRAIL

desde Bcl-2 miembros de la familia juegan un papel importante en la apoptosis, hemos tratado de examinar la expresión de Bax y Bcl-2 en tejidos tumorales derivadas de resveratrol y /o ratones TRAIL tratados (Fig. 4A, panel izquierdo). El tratamiento de ratones con resveratrol y TRAIL solo resultó en la regulación positiva de Bax, y la inhibición de Bcl-2 expresión. En comparación, la combinación de resveratrol más TRAIL fue más eficaz en la regulación positiva de Bax y la inhibición de Bcl-2. A continuación confirmó la Western blot datos mediante el examen de las expresiones de estas proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica (Fig. 4A, medias y paneles de la derecha). El tratamiento de ratones con resveratrol upregulated la expresión de Bax y se inhibe la expresión de Bcl-2. En comparación, el tratamiento de ratones con una combinación de resveratrol más TRAIL tenía más efectos sobre la regulación al alza de Bax y la inhibición de Bcl-2 de un único agente.

(A), se realizó análisis de transferencia de Western para medir la expresiones de Bax y Bcl-2 en los tejidos tumorales derivadas de control, el resveratrol y /o ratones tratados mapa en la semana 6 (panel izquierdo). La inmunohistoquímica se realizó para medir la expresión de Bax y Bcl-2 en los tejidos tumorales derivadas de ratones control y tratados con fármaco sobre semana 6 (panel medio). La cuantificación de Bax y células positivas en células tumorales 2 Bcl-(panel derecho). (B), se realizó análisis de transferencia de Western para medir la expresión de p27
/KIP1 y ciclina D1 en los tejidos tumorales derivadas de ratones de control y de drogas tratada en semana 6 (panel izquierdo). La inmunohistoquímica se realizó para medir la expresión de p27
/KIP1 y ciclina D1 en los tejidos tumorales derivadas de ratones control y tratados con la droga en la semana 6 (panel central). La cuantificación de las células p27
/Kip1 y ciclina D1 positivos en los tejidos tumorales (panel derecho).

A continuación examinó los efectos del resveratrol y /o TRAIL en la expresión de p27
/KIP1 y ciclina D1 en los tejidos tumorales por transferencia de Western e inmunohistoquímica (Fig. 4B). El tratamiento de ratones con resveratrol resultó en la inducción de ciclo celular p27 inhibidor
/KIP1 y la inhibición de la expresión de ciclina D1 (Fig. 4B). En comparación, TRAIL no tuvo efecto significativo sobre la expresión de p27, pero ligeramente inhibió la expresión de la ciclina D1 en comparación con grupo de control. Sin embargo, la combinación de resveratrol y TRAIL mostró regulación al alza de p27, y la inhibición de la ciclina D1 en comparación con un único agente. A continuación confirmó la Western blot datos con los datos de inmunohistoquímica mediante el examen de las expresiones de estas proteínas (Fig. 4B, medias y paneles de la derecha). TRAIL no tiene ningún efecto significativo sobre la expresión de p27, pero ligeramente inhibido la expresión de ciclina D1. En comparación, el resveratrol indujo la expresión de p27, y se inhibe la expresión de ciclina D1. Estos datos sugieren que el resveratrol puede regular el ciclo celular por hasta la regulación de la expresión de p27 y la inhibición de la expresión de ciclina D1.


In vivo
regulación de MMP-2 y MMP-9 expresión por resveratrol y /o TRAIL

expresiones elevadas de las metaloproteinasas de matriz (MMP) están asociados con un mayor potencial metastásico en muchas células tumorales [35], [36], [37]. Por lo tanto, tratado de examinar los efectos del resveratrol en MMP-2 y MMP-9 expresiones en tejidos tumorales procedentes de ratones inmunodeficientes xenoinjertados por inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western. El tratamiento de ratones con xenogrfated resveratrol resultó en la inhibición de MMP-2 y MMP-9 expresiones que los de control o grupo tratado TRAIL (Fig. 5A y B). La combinación de resveratrol y TRAIL fue más eficaz en la inhibición de MMP-2 y MMP-9 expresiones que un único agente. A continuación confirmó los datos de inmunohistoquímica mediante el examen de la expresión de estas proteínas por análisis de transferencia Western (Fig. 5C). TRAIL no tiene ningún efecto significativo sobre la expresión de MMP-2 y MMP-9. En comparación, el resveratrol o resveratrol más TRAIL inhibe la expresión de MMP-2 y MMP-9. Estos datos sugieren que el resveratrol y /o TRAIL pueden inhibir la metástasis del cáncer de próstata mediante la inhibición de MMP-2 y MMP-9
.
(A), inmunohistoquímica se realizó para medir la expresión de MMP-2 y MMP-9 en tejidos tumorales derivadas de control, resveratrol y /o ratones TRAILtreated en la semana 6. (B), la cuantificación de MMP-2 y MMP-9 células positivas en los tejidos tumorales. (C), se midieron las expresiones de MMP-2, MMP-9 y β-actina en los tejidos tumorales en la semana 6 por el análisis de Western blot.


En vivo
regulación de angiogénesis por resveratrol y /o TRAIL

Ya sea de regresión en el crecimiento del tumor por el resveratrol y /o TRAIL era debido a la inhibición de la angiogénesis, se analizaron los marcadores de la angiogénesis por inmunohistoquímica en tejidos tumorales derivadas de ratones control y tratados (Fig . 6). En primer lugar, examinamos los efectos de resveratrol y /o tratamiento TRAIL en el número de vasos sanguíneos en los tejidos tumorales mediante la utilización de tres enfoques diferentes (Fig. 6A). Los vasos sanguíneos se examinaron por tinción de los tejidos tumorales por H & amp; E, anticuerpo anti-CD31, y anti-vWF anticuerpo. El tratamiento de ratones con resveratrol o TRAIL provocó una inhibición en el número de vasos sanguíneos. En comparación, el tratamiento de ratones con una combinación de resveratrol, más TRAIL inhibe aún más el número de los vasos sanguíneos.

, ratones Panel izquierdo, cortes de tejido tumoral derivadas de control, el resveratrol y /o TRAIL tratados (A) en semana 6 fueron teñidas con H & amp; E y el número de vasos sanguíneos se contaron en 400 magnificación X. Cada columna representa la media ± SD. * O ** = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. Panel central, la cuantificación de los vasos sanguíneos en los tumores derivados de semana 6. secciones tumorales de ratones control y tratados con fármaco se tiñeron con anticuerpo anti-CD31, y se contó el número de vasos sanguíneos CD31-positivo. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar. * O ** = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. Panel derecho, las secciones tumorales de ratones control y tratados con fármaco obtenidos en semana 6 se tiñeron con anti-von Willebrand Factor anticuerpo (vWF) para evaluar los vasos sanguíneos. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar. * O ** = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (B), el panel izquierdo, inmunohistoquímica se realizó para medir la expresión de VEGF en los tejidos tumorales derivadas de ratones de control y de drogas tratado en la semana 6. Panel derecho, la cuantificación de células VEGF positivos en los tejidos tumorales. panel de la derecha, la cuantificación de células positivas de VEGF. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar. * O ** = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. Panel inferior, las expresiones de VEGF y β-actina en los tejidos tumorales derivadas de semana 6 se midió por el análisis de transferencia de Western. (C), receptor de VEGF 2 (VEGF-R2) -positivo células endoteliales circulantes en ratones en la semana 6. Las células sanguíneas de la sangre periférica unida a la corredera se tiñeron con anticuerpo anti-VEGF-R2, y el número de VEGF-R2 células positivas se contaron bajo un microscopio. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar. * O ** = significativamente diferente del control, p. & Lt; 0,05

A continuación examinó la expresión de VEGF mediante técnicas de inmunohistoquímica y Western blot (Figura 6). El examen de los tejidos tumorales mediante inmunohistoquímica mostró que los ratones de control habían aumentado las células endoteliales VEGF-positivo en comparación con resveratrol o ratones tratados con TRAIL (Fig. 6B, los paneles izquierdo y derecho). La combinación de resveratrol, más TRAIL mostraron significativamente menos tinción de VEGF que un único agente. A continuación confirmó los datos de inmunohistoquímica de la expresión de VEGF mediante el examen de los niveles de proteína por Western blot (Fig. 6B, panel inferior). El tratamiento de ratones con resveratrol y TRAIL solo inhibe la expresión del VEGF. En comparación, el resveratrol más TRAIL inhibieron la expresión de VEGF.

Hemos demostrado que los números de circulación vascular del receptor del factor de crecimiento endotelial 2 (VEGF-R2) células endoteliales positivas a correlacionan directamente con el aumento de la angiogénesis tumoral y pueden servir como
in vivo
indicadores de la angiogénesis del tumor [31], [38]. Como se esperaba, los ratones de control habían aumentado las células endoteliales VEGF-R2-positivas circulantes en comparación con los ratones tratados con resveratrol (Fig. 6C). El resveratrol, más TRAIL grupo tratado con células mostraron significativamente menos VEGFR2-positivo que el del grupo de resveratrol o TRAIL tratada. Estos datos demuestran claramente que el resveratrol puede inhibir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis, y pueden también promover la actividad antitumoral de TRAIL
in vivo
.


En vivo
regulación del factor de transcripción FKHRL1

AKT se ha mostrado para fosforilar FKHRL1, y la inhibición de la fosforilación de FKHRL1 provoca su translocación nuclear, la unión mejorada de ADN y la actividad transcripcional [39]. A continuación examinó si las actividades antitumorales de resveratrol y /o TRAIL se ejercen a través de la activación de FKHRL1 (Fig. 7). Resveratrol y TRAIL inhibieron la fosforilación de FKHRL1; sin embargo, el resveratrol fue más eficaz que TRAIL. La combinación de resveratrol y TRAIL tuvo un mayor efecto en la inhibición de la fosforilación de FKHRL1 de un único agente. A continuación examinó la fosforilación de FKHRL1 en los tejidos tumorales mediante inmunohistoquímica (Fig. 7B y C). Resveratrol y TRAIL inhibieron los niveles citoplasmáticos de FKHRL1 fosforilado como se muestra en la Fig. 7B y cuantificado en la Fig. 7C. La combinación de resveratrol, más TRAIL tuvo un mayor efecto en la inhibición de los niveles de cytoplamic FKHRL1 fosforilada de un único agente. Estos datos sugieren que el resveratrol y TRAIL pueden inhibir la fosforilación de FKHRL1, que puede resultar en su translocación nuclear y la activación.

(A), la inhibición de la fosforilación FKHRL1 por resveratrol. Se realizó análisis de transferencia de Western para medir la expresión de fosfo-FKHRL1 en los tejidos tumorales derivadas de control y /o los ratones tratados con fármaco en la semana 6. (B), inmunohistoquímica examen de fosfo-FKHRL1. La inmunohistoquímica se realizó para medir la expresión de fosfo-FKHRL1 en los tejidos tumorales derivadas de control, resveratrol y /o ratones tratados mapa en la semana 6. (C), la cuantificación de células FKHRL-positivas en los tejidos tumorales. (D), la actividad de unión FKHRL1-DNA. Los extractos nucleares se prepararon a partir de tejidos tumorales derivadas de ratones control y tratados con fármaco. ensayo gelshift se realizó para medir la actividad de unión FKHRL1-DNA como se describe en Materiales y Métodos.

A continuación examinó la actividad de unión mediante un ensayo de gelshift (Fig. 7D) FKHRL1-DNA. Los extractos nucleares se prepararon a partir de tejidos tumorales derivadas de resveratrol y /o los ratones tratados con TRAIL. datos gelshift revelaron que TRAIL y actividades de unión de ADN FKHRL1-resveratrol mejorada. La combinación de resveratrol y TRAIL tuvo significativamente más actividad de unión FKHRL1-ADN de un único agente. En conjunto, estos datos sugieren que el resveratrol y TRAIL pueden inhibir la fosforilación de FKHRL1 que conduce a su translocación nuclear mejorada y ADN vinculante actividades.

Discusión

Recientemente hemos demostrado que el resveratrol induce la apoptosis en TRAIL células LNCaP resistente a TRAIL PC-3 células sensibles, y sensibiliza
in vitro
través de la activación de múltiples vías de señalización [14], [15]. Resveratrol inducida por apoptosis involucra la mitocondria, como se demostró por una caída en el potencial de membrana mitocondrial y la activación de la caspasa-3 y caspasa-9 tanto en las células PC-3 y LNCaP de cáncer de próstata [14], [15]. la expresión inducida por resveratrol de las proteínas pro-apoptóticos (Bax, Bak, PUMA, Noxa y Bim), receptores de muerte (TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5), y inhibió la expresión de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 y Bcl-X
L) y los PAI (XIAP y survivin). En nuestro estudio reciente, el resveratrol regula la expresión de TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27
/KIP1 y ciclina D1 a través FOXO factores de transcripción
in vitro
, y la inhibición de FKHRL1, FKHR y AFX por RNAi bloquearon estos afectos de resveratrol [40]. En el presente estudio, hemos validado nuestro
in vitro
resultados y demostró que el resveratrol y solo RUTA inhibieron el crecimiento de xenoinjertos PC-3, metástasis y angiogénesis a través de la activación de factores de transcripción FoxO. Curiosamente, la combinación de resveratrol y TRAIL tuvo mayor efecto sobre la inhibición del crecimiento del tumor, la metástasis y la angiogénesis que cualquier agente solo.


In vitro
resveratrol downregulated las expresiones de Bcl-2 y Bcl -X
L y upregulated la expresión de p53, Bax, Bak, PUMA, Noxa, y Bim en mRNA y los niveles de proteína en células de cáncer de próstata [41]. También hemos demostrado que el resveratrol upregulated la expresión, fosforilación, y la acetilación de p53 en las células LNCaP dependientes de andrógenos [41]. La capacidad de resveratrol para regular la transcripción de genes también fue evidente ya que causó la acetilación de la histona H3 y H4 en células LNCaP [41]. Además, el tratamiento de las células LNCaP con resveratrol resultó en la translocación de Bax y p53 a las mitocondrias, la producción de especies reactivas del oxígeno, la caída en el potencial de membrana mitocondrial, la liberación de proteínas mitocondriales (citocromo c, Smac /DIABLO y Omi /HtrA2), y la activación de caspasa-3 que conduce a la apoptosis [41]. Por otra parte, la supresión de genes Bax y Bak completamente inhibida resveratrol inducida por el citocromo c y la liberación de Smac /DIABLO en fibroblastos de embriones de ratón [42]. En el presente estudio, el tratamiento de ratones con xenotransplantes de resveratrol resultó en la regulación negativa de Bcl-2 y sobre regulación de Bax. La combinación de resveratrol, más TRAIL fue más eficaz en la regulación de miembros de la familia Bcl-2 que un único agente. Nuestros publicados anteriormente
in vitro
datos están de acuerdo con
in vivo
estudios actuales que demuestran que el resveratrol puede participar vía intrínseca de las células de la apoptosis mediante la regulación de la expresión de Bcl-2 de proteínas.

factores de transcripción son FOXO supresores de tumores que son inactivados en la mayoría de los cánceres humanos, debido a la sobreactivación de la vía PI3K /AKT [43]. proteínas FOXO pueden regular una variedad de genes que influyen en la proliferación celular, la supervivencia, el metabolismo y la respuesta al estrés [19], [20], [44]. factores de transcripción FoxO están regulados por síntesis, acetilación, fosforilación y ubiquitinación en tres niveles diferentes: la localización subcelular, estabilidad y actividad transcripcional [19], [20], [44]. Tras la activación de la señalización de PI3K /AKT, Foxos se someten a la fosforilación de AKT mediada, que promueve la unión a 14-3-3, exportación nuclear a través de CRM1 y secuestro citoplásmica. En condiciones de estrés o en ausencia de factores de crecimiento o supervivencia, cuando se inhibe la vía PI3K /AKT, proteínas FOXO translocan al núcleo celular, donde sus funciones transcripcionales pueden ser ejecutados [45]. Una segunda capa reguladora es FOXO acetilación por p300, la CBP (proteína de unión a CREB) y PCAF (P300 /factores asociados al PFC) en respuesta al estrés oxidativo o la unión al ADN [46], [47], [48], seguido de desacetilación por clase I y II de la histona deacetilasa [48], [49], [50], incluyendo Sirt1, el NAD
+ - deacetilasa dependiente codificada por el gen de la levadura ortholog de la longevidad Sir2 [51]. Recientemente hemos demostrado que la inhibición de /AKT vía mejorada FOXO-DNA PI3K de unión y la actividad transcripcional [40], [52]. Además, la fosforilación mutante deficiente de FOXO mejorada FOXO actividad y apoptosis de la transcripción inducida por resveratrol. modificación post-traduccional de las proteínas FOXO es un mecanismo importante que regula la capacidad de los diferentes factores de transcripción para activar conjuntos de genes distintos, que participan en la inhibición del ciclo celular [53], la apoptosis [54], la defensa contra el estrés oxidativo y la reparación del ADN [55]. La actividad de unión de ADN mejorada también sirve para limitar la disponibilidad de proteínas FOXO para la fosforilación por AKT [46]. En el presente estudio, hemos demostrado que la apoptosis inducida por resveratrol en células de cáncer de próstata a través de la activación de factores de transcripción FOXO. Del mismo modo en otro estudio, hemos demostrado que la inhibición de los factores de FOXO de transcripción por shRNA bloqueado upregulation resveratrol inducida de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/Kip1 y apoptosis, y la inhibición resveratrol inducida de la ciclina D1 en el cáncer de próstata células
in vitro
[40]. Nuestros datos sugieren que el resveratrol induce la detención del ciclo celular y apoptosis mediante la regulación de factores de transcripción FOXO en células de cáncer de próstata.

El FOXO factores de transcripción se han demostrado para ser activado constitutivamente en diversos tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de próstata [39] , [56]. Foxos se muestran para contribuir al desarrollo y /o progresión de malignidad mediante la regulación de la expresión de genes implicados en el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, la angiogénesis y la metástasis [39], [56].

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