Extracto
La obesidad y la diabetes tipo 2 se asocian con un mayor riesgo para el desarrollo de ciertas formas de cáncer, incluyendo el cáncer de colon. La publicación de estudios epidemiológicos muy controvertidas en 2009 planteó la posibilidad de que el uso de los aumentos de insulina glargina analógicas aún más este riesgo. Sin embargo, no está claro cómo los efectos mitogénicos de insulina y análogos de insulina medidos
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correlacionan con estimulantes del crecimiento del tumor efectos
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. El objetivo de este estudio fue examinar los posibles efectos estimulantes del crecimiento de la insulina humana nativa, la insulina y el IGF-X10 1, que se consideran los controles positivos
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, en un modelo animal de corto plazo de la obesidad-una y el cáncer relevantes para la diabetes. Nos caracteriza la insulina y la expresión del receptor de IGF-1 y la respuesta al tratamiento con insulina, X10 y de IGF-1 en la línea celular de cáncer de colon murino (células MC38)
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y
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. Además, hemos examinado la farmacocinética y la farmacodinámica y monitoreados crecimiento de aloinjertos de células MC38 en ratones con obesidad inducida por dieta tratados con insulina humana, X10 y IGF-1. El tratamiento con X10 y el IGF-1 aumentó significativamente el crecimiento de los aloinjertos de células MC38 en ratones con obesidad inducida por la dieta y por lo tanto se puede concluir que las dosis supra-farmacológica del análogo de insulina X10, que es super-mitogénica
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y el aumento de la incidencia de tumores mamarios en ratas hembras en un estudio de toxicidad de 12 meses, también aumentan el crecimiento de los aloinjertos de tumores en un modelo animal de corto plazo
Visto:. Hvid H, Blouin MJ, Birman e, Damgaard J, Poulsen F, Fels JJ, et al. (2013) El tratamiento con insulina analógica X10 y el IGF-1 aumenta el crecimiento del cáncer de colon Los aloinjertos. PLoS ONE 8 (11): e79710. doi: 10.1371 /journal.pone.0079710
Editor: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Julio, 2013; Aceptado: September 24, 2013; Publicado: 18 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Hvid et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una subvención (TFF-116128) del Instituto canadiense de Investigación en Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos de intereses que informe: H Hvid, J Damgaard, JJ Fels, M Poulsen, C Fledelius Hansen y BF son empleados de Novo Nordisk y posee acciones en la compañía. M Pollak es un consultor de Novo Nordisk. Para todos los demás autores no existen conflictos de intereses que informar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La obesidad y la diabetes tipo 2 se asocian con un mayor riesgo de ciertas formas de cáncer, como el de mama, de páncreas y cáncer de colon [1] - [5]. estudios epidemiológicos muy controvertida sugirieron que el uso terapéutico de la insulina glargina análogo de insulina se asoció con un mayor riesgo de desarrollo de cáncer [6], [7], pero el ensayo ORIGEN proporcionado recientemente una fuerte evidencia de que este no es el caso [8]. Sin embargo, los estudios epidemiológicos publicados en 2009 y los siguientes debates pusieron de relieve la importancia de la evaluación de la seguridad preclínica de análogos de insulina. Por otra parte, los resultados tranquilizadores respecto a glargina no disminuyen la evidencia previa de una asociación entre la diabetes tipo 2 y aumento del riesgo o peor pronóstico de ciertos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon, y los mecanismos detrás de esta asociación sigue siendo un tema importante.
En este contexto, el análogo de insulina X10 es un ligando interesante. X10 se desarrolló como un análogo de insulina de acción rápida por sustitución de histidina en la posición B10 con ácido aspártico [9]. Esta sustitución de aminoácido solo aumentó la afinidad de unión de X10 al receptor de IGF-1 (IGF-1R) y el receptor de insulina (IR) de 3 a 5 veces y 2 veces, respectivamente [10], [11]. Por otra parte, X10 ha disminuido fuera de la tasa del IR en comparación con la insulina humana nativa (HI) que se traduce en la señalización sostenida del IR [12]. Recientemente, se demostró que X10 da como resultado la activación proporcionalmente más fuerte de los sitios de fosforilación en los dominios de membrana y yuxtaposición de cinasa de la IR que el dominio C-terminal [13]. Estas características de unión al receptor y X10-activación da un potencial de veces mayor que mitogénica 3-15 HI
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[14] y en una toxicidad crónica de 12 meses dosis supra-estudios farmacológicos de X10 aumentaron la incidencia de la tendencia espontánea tumores mamarios en ratas Sprague Dawley hembra [15]. Por lo tanto, un mayor desarrollo de X10 para uso clínico se interrumpió, pero los mecanismos detrás del aumento de la incidencia de tumores nunca se han aclarado por completo (ver [16] para una revisión detallada).
Los estudios previos en animales utilizando genética o inducida por la dieta modelos de obesidad o diabetes han correlacionado hiperinsulinemia con aumento de la formación de lesiones preneoplásicas inducidas químicamente en el colon [17], [18], el crecimiento de tumores de colon inducido químicamente [19], [20], así como el crecimiento de los aloinjertos de células de cáncer de murino [21 ] - [25]. En modelos de ratas con inducción química de cáncer, el tratamiento con un mayor crecimiento de los tumores a la insulina inducida por azyoxymethane de colon [26] y 7,12-dimetilbenz (a) antraceno inducida por tumores mamarios [27]. También se ha demostrado que la infusión constante de insulina a ratas durante 12 h aumento de la proliferación de cáncer de colon células epiteliales [28], y las dosis supra-farmacológicas de HI o glargina durante 18 semanas aumentó la proliferación de las células epiteliales de colon y la formación de lesiones preneoplásicas, pero no dio lugar a la formación de tumores [29]. En los estudios de seguridad, que tradicionalmente se realizan como estudios de carcinogenicidad o estudios de toxicidad crónica de 6-24 meses de duración en ratones o ratas [30], no se observó aumento en la incidencia de tumores en ratas Sprague Dawley y ratones NMRI tras el tratamiento con dosis relativamente bajas de glargina y HI para un máximo de 24 meses [31]. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el tratamiento con altas dosis de X10 de 12 meses aumentó la incidencia de tumores mamarios en los mamarias ratas hembra Sprague Dawley de tumor propensos [32]. Mientras que las recomendaciones para los estudios de seguridad de la insulina y análogos de insulina se basan en la práctica científica bien validado, desarrollado originalmente para los estudios de mutágenos, los datos existentes sugiere que un promotor del crecimiento del tumor efecto de la insulina y análogos de insulina es una preocupación más relevante, que preocupación por el aumento de la iniciación del tumor, a través de un aumento de la tasa de mutación causada por una proliferación aumentada, como también se sugiere anteriormente [33]. El coste-efectividad de los programas de cribado para diferentes tipos de cáncer hace hincapié en que no es raro que los adultos, incluidos los diabéticos, para tener premalignas sin detectar cáncer en etapas tempranas [34], [35]. Por tanto, es relevante para explorar cómo el tratamiento con insulina y análogos de insulina influye en el comportamiento de los cánceres existentes, y para hacer esto en modelos animales de diabetes o la obesidad combinada con resistencia a la insulina, ya que estos factores se conocen factores de riesgo para el desarrollo del cáncer.
el objetivo del estudio fue examinar la posible tumor (células MC38) que promueven el crecimiento efecto del tratamiento con HI, X10 y el IGF-1 en un modelo de aloinjertos de cáncer de colon murino establecido en ratones con obesidad inducida por dieta (DIO) y la resistencia a la insulina. Por lo tanto, se caracterizó la línea celular MC38 utilizado para los estudios de aloinjertos ampliamente y se realizó una serie de experimentos con animales para obtener una estimación fiable de la posible incidencia de tumores que promueve el crecimiento del HI, X10 y el IGF-1
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.
Materiales y Métodos
experimentos con animales
Para examinar el efecto del tratamiento con HI, X10 y el IGF-1 en el crecimiento de los aloinjertos de tumores MC38 que llevamos a cabo cinco experimentos con animales idénticos. Nos hemos centrado en diferentes puntos finales en estos experimentos con animales y se controló el crecimiento del tumor en todos los experimentos, se realizaron ver la Tabla 1. Los experimentos con animales como se ha descrito recientemente [36]. En resumen, de sexo masculino C57BL /6 ratones fueron comprados a Laboratorios Jackson a la edad de 18 semanas en los ratones habían sido mantenidos en una dieta alta en grasas (dieta de roedores con un 60% de grasa kcal, D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, EE.UU.) desde la edad de 6 semanas. Para la caracterización del fenotipo metabólico en DIO-ratones (véase la Tabla 2), los parámetros metabólicos también se midieron en ratones delgados de la misma edad alimentados con una dieta de control, (dieta de roedores con 10 kcal% de grasa, D12450B, Dietas de Investigación) incluidos en tres de los experimentos. cuidado de los animales y los tratamientos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices y protocolos establecidos aprobados por el Instituto Davis Señora (protocolo#5951) y el Comité de Ética Animal de la Universidad McGill. Los animales fueron alojados un ratón por jaula, con acceso ad libitum al agua del grifo y la dieta alta o baja en grasa, respectivamente, a lo largo de los estudios. La temperatura en las salas de los animales se mantuvo a 20-25 ° C con un ciclo de luz /oscuridad de 14/10 horas. Los ratones se aclimataron durante 7-10 días antes de que se inician los procedimientos experimentales. Al día experimental 0, 2,0 × 10
5 (experimento A) o 5,0 × 10
5 (todos los demás experimentos) células MC38, por vía subcutánea en suspensión en 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se inyectaron (sc) en el flanco derecho de los ratones. Posteriormente, se inyectó cada ratón sc dos veces al día con vehículo (solución aqueos que contiene fosfato 7 mM, glicerol 150 mM, NaCl 22 mM y fenol 30 mM, pH 7,4), la insulina humana recombinante 600 nmol /kg, análogo de insulina X10 (análogo de insulina B10Asp) (Novo Nordisk A /S, Copenhague, Dinamarca) 600 nmol /kg o IGF-1 humano (Increlex, IPSEN Pharma GmbH, Ettlingen, Alemania) 600 nmol /kg recombinantes. El tamaño de los aloinjertos de tumor se midió tres veces por semana y el volumen calculado utilizando la siguiente fórmula: longitud x anchura
2 × 0,52. Con base en los datos de volumen de tumor de cada ratón, se calculó el área bajo las curvas de crecimiento tumoral (AUC crecimiento del tumor). A la terminación de los experimentos, los ratones se anestesiaron con isoflurano. Se recogió sangre por punción cardiaca e inmediatamente después de la eutanasia por dislocación cervical, muestras del hígado, colon, músculo gemelo y los aloinjertos de células tumorales MC38 fueron disecados y se congelaron en nitrógeno líquido para la preparación posterior de lisado de tejido.
glucosa en la sangre y la HbA1C
Para controlar el efecto farmacodinámico de tratamiento con HI, X10 y el IGF-1, se midió la glucosa en sangre antes del tratamiento y 15 minutos, 1 hora, 2,5 horas y se 6 h después del tratamiento. La sangre se recogió por punción de la vena safena y la sangre de glucosa medido usando un OneTouch Ultra Glucómetro (LifeScan, Inc., Milpitas, CA, EE.UU.).
Los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) en la sangre de cesis y los ratones de control magra fueron medidos usando el kit de análisis de hemoglobina A1c Gen.3 Tina-quant y un instrumento Cobas 6000 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Recogida de muestras y mediciones de plasma de C-péptido, insulina humana, insulina X10 y IGF-1 humano
Antes se iniciaron experimentos, los niveles sistémicos de la insulina de ratón se midieron usando un insulina de rata /ratón ELISA kit (Millipore Corp., Bilerica, MA , EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Las muestras de plasma recogidas en la terminación de los experimentos se ensayaron para ratón C-péptido, la insulina humana, X10 análogo de insulina o IGF-1 humano. Ratón C-péptido se analizó con la rata /ratón C-péptido 2 kit ELISA (Millipore), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones plasmáticas de IGF-1 humano se midieron con el kit de ELISA IDS-iSYS IGF-1 (IDS inmunodiagnóstico, Fountain Hills, AZ, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Las muestras de plasma se analizaron para la insulina humana nativa utilizando una luminiscencia del oxígeno canalización de Inmuno-ensayo (LOCI-ensayo), como se describe anteriormente [37]. La insulina X10 se midió en plasma de ratón utilizando un ensayo de lavado-LOCI, como también se describe recientemente [38]. Ver Materiales S1 para obtener información detallada acerca de estos ensayos.
Cell Cultura y
células MC38 línea (célula de ratón descrita por Corbett et al. (1975) [39] y generosamente proporcionadas por el Dr. Pnina Brodt , McGill University, Montreal, QC) y las células MCF-7 (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), se cultivaron en medio DMEM que contenía 4,5 g /l de glucosa (Wisent Inc., Montreal, QC, Canadá) complementado con un 10% ( v /v) de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen) y 20 mg /ml de gentamicina (Sandoz Canadá, Boucherville, QC, Canadá) (es decir, medio de crecimiento). Las células usadas en los experimentos con animales se trataron con tripsina, se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en PBS (4 ° C) a una concentración de 5,0 × 10
6 células /ml y se mantuvieron en hielo hasta la inyección sc en los ratones. Para los experimentos de señalización células MC38 se cultivaron en medio de crecimiento durante dos días, hasta 80-90% de confluencia, los cultivos celulares se aclararon una vez en PBS (temperatura ambiente), y medio de inanición (similar a medio de crecimiento, excepto que sólo contenía 0,25% (v /v) de FBS y no rojo de fenol) se añadió durante 3 h. Después las células de hambre fueron tratados con insulina humana nativa, X10 o IGF-1 a concentraciones finales de 1 o 10 nM en medio de inanición. Exactamente 30 minutos después del tratamiento, las células se lavaron una vez en PBS (4 ° C) y se lisaron mediante la adición de tampón de lisis, tal como se describe anteriormente. Cada experimento de señalización compuesto se realizaron dos muestras replicadas por tratamiento y tres experimentos independientes. Las células MC38 utilizados para la caracterización de la expresión de IGF-1R IR y se cultivaron, se recogieron y se lisaron como se ha descrito para los experimentos de señalización anteriormente, excepto que no se mueren de inanición antes de la lisis.
Proliferación Celular
Efecto de los compuestos de ensayo sobre la proliferación fue evaluada con 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT) ensayos, esencialmente como se describe anteriormente [40]. En resumen, las células MC38 se sembraron en placas de 96 pocillos (5.000 células por pocillo) en medio de crecimiento. Después de incubación durante 1 día, se lavaron las células en PBS (temperatura ambiente), de hambre durante 3 h y después se trató con HI, X10 o IGF-1 en concentraciones de 0,001 a 1000 nm. Los datos para el número de células relativas de los tres experimentos repetidos, cada uno con cuatro muestras replicadas por condición, se utilizaron luego para adaptarse a las curvas de dosis-respuesta utilizando GraphPad Prism versión 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). experimentos de proliferación celular se realizaron con células MCF-7 tal como se describe para las células MC38, excepto que se sembraron 20.000 células por pocillo. Ver Materiales S1 y Figura S1 para obtener información adicional detallada sobre los experimentos de proliferación celular.
Preparación de tejidos y lisados de células y Western Blot
La lisis de congelado muestras de tejidos y cultivos de células en placas de Petri, centrifugar lisados, ensayo de la concentración de proteína, mezcla de células o tejidos lisados con tampón de carga 2X SDS, desnaturalización, SDS-PAGE en geles de 4-15 prefabricados% de gradiente (BioRad) y traslado a 0,45 micras membranas de nitrocelulosa se realizaron como se describe anteriormente [ ,,,0],36] Antes de Blot con anticuerpos primarios de las membranas de nitrocelulosa se bloquearon por incubación en solución salina tamponada con Tris con 0,05% (v /v) de Tween (TBS-T) con 5% (w /v) de albúmina de suero bovino (BSA) (cuando Blot con anticuerpos primarios-fosforilación específica) o TBS-T con 5% (w /v) de leche descremada (todos los demás anticuerpos primarios) durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron en TBS-T con 5% (w /v) de BSA y se realizó la incubación durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos de conejo siguientes, todos de señalización Cell Technology Inc., Boston, MA, EE.UU., se utilizaron:. Anti-fosfo-p70S6K (.. Thr389, gato sin 9205), anti-P-S6 (Ser235 /236, nº de cat . 2211), anti-fosfo-Akt (Ser473, cat. núm. 9271), anti-Akt (cat. núm. 9272), anti-fosfo-MAPK (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187, cat. núm. 4370) , anti-P-IRS-1 (Ser302, cat. no. 2384), anti-IRβ (cat. no. 3025), anti-IGF-1Rβ (cat. no. 3018), anti-beta-actina (cat. no. 4967). La incubación con el anticuerpo secundario (peroxidasa de rábano picante conjugado de cabra anti-IgG de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU., cat. No 5401) y la visualización de las bandas de proteínas se realizaron como se describe anteriormente [36]. La intensidad de bandas de proteína se cuantificó usando el software ImagePro (BioRad). en cada celda experimento de señalización, las intensidades de banda se normalizaron a la media de las muestras tratadas con vehículo. bandas de IR y el IGF-1R en el hígado, colon muscular y aloinjertos de células MC38 se normalizaron en el sentido de intensidades de las bandas en las muestras de hígado y músculo, respectivamente.
ensayo del contenido de triglicéridos en el hígado lisado preparado a partir de muestras de hígado de ratones delgados y cesis se realizó utilizando un kit de ensayo colorimétrico de triglicéridos (Cayman Chemical Company, Ann Arbor , MI, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SAS versión 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.). En todos los análisis observaciones se supone que son independientes entre animales o unidades experimentales de cultivo celular. Además, los datos se supone que siguen una distribución normal y tener la homogeneidad de la varianza. Para cumplir con estos supuestos, los datos se transformaron utilizando el logaritmo natural cuando sea necesario. Los datos con un valor residual normalizado numérico & gt; 3,0. Se consideraron como valores atípicos, como se sugirió anteriormente [41], y el análisis estadístico se realizó con y sin estos valores atípicos (véase más adelante)
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datos de señalización se analizaron mediante un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de comparaciones por pares entre cada tipo de tratamiento y de control utilizando múltiples pruebas t con corrección Dunnetts. Por otra parte, en cada nivel de dosis, una comparación directa del tratamiento con HI y HI X10 y con IGF-1 se realizó mediante pruebas t de Student. Los datos que describen IR y la expresión de IGF-1R en diversos tejidos de ratón se analizaron en un ANOVA de una vía seguido de comparaciones por pares entre los tejidos utilizando múltiples t-test con corrección de Bonferroni.
El efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor en cada de los cinco experimentos con animales fueron analizados en un ANOVA de una vía seguido por comparación del par de cada tratamiento con vehículo usando múltiples pruebas t con corrección de Dunnetts para cada uno de los dos puntos finales de crecimiento tumoral; el volumen del tumor final y el área bajo las curvas de crecimiento tumoral (AUC crecimiento del tumor). Los resultados de este análisis para cada experimento, es decir, los valores medios para cada tratamiento, los intervalos de confianza del 95% y el pliegue del cambio de cada tratamiento respecto al vehículo, se muestran en la Tabla 3.
Para examinar tratamiento efectos relacionados con la PI en el crecimiento tumoral en los cinco experimentos con animales, que para cada punto final (volumen final de tumores y el crecimiento del tumor AUC) combinaron todos los datos en un conjunto de datos y las analizaron en un modelo lineal mixto con el tratamiento como una variable explicativa y experimentar fija como efecto aleatorio. No se encontró interacción significativa entre el tratamiento y el experimento para el cualquiera de los dos resultados (volumen final de tumores y el crecimiento del tumor AUC). Para explorar más a fondo las diferencias entre los tratamientos, las comparaciones por pares de cada tipo de tratamiento se realizaron utilizando múltiples t-test con corrección Bonferonni. No se observaron valores atípicos entre las 131 observaciones de volumen final del tumor, mientras que un valor atípico fue identificado entre las 131 observaciones de las AUC el crecimiento del tumor. La exclusión de este valor atípico era necesario para cumplir con los supuestos detrás de los modelos estadísticos y no cambió el resultado global del análisis. El volumen final del tumor y el tumor AUC media de crecimiento para cada tratamiento en los cinco experimentos, incluyendo los intervalos de confianza del 95% y doble cambio de cada tratamiento en relación con el grupo tratado con vehículo se muestran en la Tabla 3.
Resultados
Las células MC38 son sensibles a la insulina, X10 y el IGF-1