Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Los recientes avances en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de pulmón se ha conseguido debido a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de la enfermedad y la identificación de biomarcadores que permiten tratamientos más específicos de cáncer. Uno de los ejemplos más conocidos de la terapia personalizada es el uso de inhibidores de tirosina quinasa, tales como gefitinib y erlotinib, para el éxito del tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas seleccionados en base a la específica
EGFR
mutaciones. Por lo tanto, la detección fiable de las mutaciones es crítica para la aplicación de terapia apropiada. En este estudio, hemos probado una estrategia de detección de mutaciones de dos niveles usando ensayos de PCR en tiempo real como un método de alta sensibilidad bien validado y la sonda de amplificación dependiente de ligado múltiplex (MLPA) a base de ensayo EGFRmut + como de segundo nivel estándar de sensibilidad Método. Una ventaja adicional del método aplicado MLPA es que permite la detección simultánea de las mutaciones de EGFR y el número de copia alteraciones (es decir, las amplificaciones) en
EGFR, MET
y
ErbB2
. Nuestro análisis mostró alta concordancia entre estos dos métodos. Con el uso de esta estrategia de dos niveles, a fin de determinar de forma fiable la frecuencia de
EGFR
mutaciones y
EGFR, MET
y
ErbB2
amplificaciones en más de 200 muestras de cáncer de pulmón. Además, aprovechando el número de copias simultáneas y pequeña mutación análisis, hemos demostrado una correlación muy fuerte entre las mutaciones de EGFR y amplificaciones EGFR y una exclusión mutua de las mutaciones de EGFR /amplificaciones con MET y amplificaciones ErbB2. Nuestros resultados demostraron la fiabilidad y utilidad de la estrategia de ensayo de dos niveles de EGFR
Visto:. Lewandowska MA, Czubak K, K Klonowska, Jozwicki W, Kowalewski J, P Kozlowski (2015) El uso de un período de dos estrategia por niveles de ensayo para la detección simultánea de Pequeño
las mutaciones de EGFR
y
EGFR
amplificación en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (2): e0117983. doi: 10.1371 /journal.pone.0117983
Editor Académico: Rafael Rosell, Instituto Catalán de Oncología, ESPAÑA
Recibido: 16 de mayo de 2014; Aceptado: January 5, 2015; Publicado: 26 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Lewandowska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación 2011/01 /B /NZ5 /02773 del Centro Nacional para la Ciencia (http://www.ncn.gov.pl /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. El tratamiento del cáncer de pulmón se basa tradicionalmente en una evaluación histopatológica que distingue dos tipos principales de cáncer de pulmón: cáncer de células pequeñas de pulmón (SCLC) y el cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC), el último de los cuales se puede subdividir en escamosas carcinoma de células, carcinoma de células grandes, adenocarcinoma y cánceres con histología mixta. los recientes progresos sustanciales en el tratamiento del cáncer de pulmón (especialmente adenocarcinomas) que se ha logrado gracias a los avances en el conocimiento de su patología; las opciones de tratamiento actuales incluyen agentes especializados basados en la presencia o ausencia de biomarcadores genéticos específicos ( "terapia personalizada"), tales como mutaciones en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (
EGFR
) [1] o ganar-de- translocaciones o inversiones de funciones que implican el linfoma anaplásico de la tirosina quinasa del receptor (
ALK
) [2].
Se ha demostrado que ciertas mutaciones somáticas en el dominio quinasa de
EGFR
sensibilizan cánceres a tratamiento con
EGFR
inhibidores específicos de la tirosina quinasa (TKIs), tales como erlotinib o gefitinib (revisado en [3]). Entre la sensibilización más común
EGFR
mutaciones son L858R en el exón 21 y deleciones en marco en el exón 19, que en conjunto representan más del 80-85% de todos los
EGFR
mutaciones. Sin embargo, la aparición de la mutación T790M en el exón secundario 20 hace que la resistencia adquirida a TKIs y hace que la progresión de los cánceres tratados con TKIs [4,5]. Por lo tanto, la detección fiable de
EGFR mutaciones
es un factor importante que permite que el tratamiento personalizado de pacientes con cáncer de pulmón.
En los últimos 10 años, se han utilizado numerosos métodos con diferentes sensibilidades y especificidades para detectar
EGFR
mutaciones en muestras de cáncer. Estos métodos incluyen la secuenciación de Sanger, el polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) [6], co-amplificación en desnaturalización inferior de temperatura-PCR (COLD PCR) [7], inmunohistoquímica con
EGFR
-mutation anticuerpos específicos [8] , péptido ácido nucleico-ácido nucleico bloqueado (PNA-LNA) ensayos de fijación PCR, PCR en tiempo real (RT-PCR) métodos [9] y la próxima generación de secuenciación [10]. Sin embargo, ninguno de los métodos que se han utilizado hasta ahora son ideales, y cada uno de estos métodos tiene limitaciones que en su mayoría se relacionan con las siguientes características de las muestras de cáncer: (i) diversifiqué tipos de muestras tumorales disponibles para el análisis (quirúrgicos, hacer una biopsia), (ii) la contaminación con células normales, (iii) la heterogeneidad genética de los tumores, (v) la frecuencia de baja frecuencia de las mutaciones analizadas, (iv) la degradación de ADN, y (v) el daño o la modificación de ADN [los dos últimos factores que también se aplican a las muestras, fijado en formol e incluidos en parafina (FFPE), que son las muestras más frecuentemente disponibles]. Los más graves problemas derivados de las limitaciones de los análisis de muestras de tumores son los errores positivos y falsos negativos que pueden conducir a errores de clasificación y el tratamiento inadecuado de cáncer. Por lo tanto, para reducir la fracción de muestras mal clasificadas, recientemente se ha propuesto en la guía basada en la evidencia de tres sociedades profesionales (Colegio de estadounidenses patólogos, Asociaciones Internacionales para el Estudio del Cáncer de Pulmón y la Asociación de Patología Molecular) que, si es posible,
EGFR
pruebas de mutación deben llevarse a cabo con dos métodos (una estrategia de ensayo de dos niveles). Esta guía representa las pruebas de cáncer de pulmón molecular del estado de la técnica y se publicó conjuntamente en tres revistas [11-13]. Por simplicidad nos referiremos posteriormente únicamente a [11]. Este método de dos niveles se debe basar en diferentes principios de detección de mutaciones y debe cubrir los diferentes rangos de sensibilidad, que consiste en los métodos estándar de sensibilidad y de alta sensibilidad.
En este estudio, hemos probado más de 200 muestras de NSCLC con el uso de dos métodos complementarios, un ensayo de RT-PCR comercial utilizado habitualmente (un método de alta sensibilidad) [9] y una nueva sonda de amplificación dependiente de ligado múltiplex (MLPA) a base de EGFRmut + ensayo (un estándar de sensibilidad, el método de segundo nivel ) [14]. Nuestro análisis mostró una alta concordancia entre estos dos métodos y así demostrado la fiabilidad y utilidad de la EGFRmut + ensayo como un método de segundo nivel para
EGFR
pruebas de mutación. Con el uso de estos métodos, que caracteriza y se estimó la frecuencia de somáticas
EGFR
mutaciones en un conjunto de muestras de cáncer de pulmón por el centro de Polonia. Una ventaja adicional del ensayo EGFRmut + es que permite un análisis de la mutación y la determinación del número de copias relativo (es decir, detección de amplificación) en paralelo. Se utilizó este enfoque para encontrar una correlación muy fuerte entre los
EGFR
amplificación y la ocurrencia de
EGFR
mutaciones y determinar la frecuencia aproximada de alelos mutantes en las muestras analizadas.
Materiales y Métodos
Selección y tratamiento del CPNM muestras para el análisis molecular
Se revisaron retrospectivamente una cohorte de 239 pacientes con CPNM confirmado histológicamente diagnosticados desde 2011 hasta 2012 en el Centro de Oncología Franciszek Lukaszczyk en Bydgoszcz (centro de Polonia). La edad de los pacientes varió de 35 a 81. Un total de 239 especímenes que aprobó las medidas de control de calidad (análisis microscópico y el contenido de la calificación del tumor, así como el análisis de ADN cualitativa y cuantitativa) se obtuvieron después de 143 cirugías, 91 aspiración con aguja fina ( FNA) procedimientos, y 5 de ultrasonido endobronquial (con) los procedimientos PA guiada guiada aspiración con aguja transbronquial o muestras de líquido pleural. Las muestras fueron teñidas con hematoxilina y eosina para el análisis cualitativo y cuantitativo de las células tumorales en el material analizado (incluyendo macrodissection en muestras marcadas). La calificación de material biológico para el análisis molecular se basó en las escalas cualitativas y cuantitativas anteriormente descritos para citológico [9] y histológico material de [15]. consentimiento informado por escrito para las pruebas genéticas, aprobado por el Centro de Oncología F. Lukaszczyk en Bydgoszcz se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el comité de ética local, Comité de Bioética de Ludwig Rydygier Collegium Medicum en Bydgoszcz, Universidad Nicolás Copérnico en Torun . Los datos se analizaron de forma anónima.
aislamiento de ADN
aislamiento de ADN se realizó después de la macrodissection de una región indicada por el pathomorphologist. ADN genómico se aisló a partir de tejido FFPE adenocarcinoma o frotis citológicos usando un kit QIAamp FFPE Mini (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. Nos resuspendieron el sedimento en 180 l de tampón de lisis de tejido con 20 l de proteinasa K, y se agitan con vórtex y continuamente dimos el sedimento celular a intervalos cortos durante una noche de incubación a 56 ° C. La cantidad y calidad del ADN se evaluaron mediante análisis NanoDrop absorbancia y la electroforesis en gel de agarosa.
análisis de la mutación por PCR en tiempo real
El método RT-PCR utiliza sondas de mutación específica para evaluar 29 mutaciones puntuales , incluyendo la mutación T790M (EGFR-RT52; Entrogen, Inc., Tarzana, CA). A la cantidad de ADN de 200 a 650 ng era adecuado para la detección de 29 mutaciones en las muestras de interés; las de control interno VIC sondas fluorescentes y
EGFR
sondas fluorescentes se marcaron tinte FAM. Las curvas de amplificación fueron evaluados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
La mutación y el análisis de amplificación mediante MLPA análisis
MLPA se realizó con el uso de un EGFRmut + ensayo de diseño personalizado, que ha sido previamente se describe en mayor detalle [14]. Este ensayo permite simultáneamente la detección de oncogénicos
EGFR
mutaciones y un análisis del número de copias (detección de amplificación) de
EGFR
,
MET
, y
ErbB2
. Todos los reactivos excepto la mezcla de sondas EGFRmut + se adquirieron forma MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos (www.mlpa.com). Las reacciones de MLPA se llevaron a cabo de acuerdo a las recomendaciones generales del fabricante (MRC-Holland), como se ha descrito anteriormente en [16,17]. Brevemente, 5 l de ADN genómico (a una concentración de aproximadamente 20 ng /nl) se incubó a 98 ° C durante 5 min, se enfrió a temperatura ambiente y se mezcla con 1,5 l de EGFRmut mezcla + sondas y 1,5 l de tampón de SALSA hibridación. Después, la reacción se desnaturalizó a 95 ° C durante 2 min y se hibridó a 60 ° C durante 16 h. Las sondas hibridadas se ligaron a 54 ° C durante 15 min mediante la adición de 32 l de mezcla de ligación. Después de la inactivación por calor, la reacción de ligación se enfrió a temperatura ambiente, se mezcló con 10 l de mezcla de PCR (polimerasa, dNTPs, y los cebadores universales, uno de los cuales fue marcado con fluoresceína) y se sometió a amplificación por PCR durante 35 ciclos. Los productos de MLPA se diluyeron posteriormente 20x en formamida HiDi contiene GS Liz600, que fue utilizado como un estándar de tamaño de ADN, y se separó mediante electroforesis capilar (polímero POP7) en un aparato ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems). La electropherograms obtenidos fueron analizados utilizando el software v1.91 GeneMarker (2.4.0). Las intensidades de señal (alturas de pico) fueron recuperados y trasladados a hojas de Excel preparados (disponibles bajo petición). Para cada muestra individual, la intensidad de la señal de cada sonda se divide por la intensidad media de la señal de las sondas de control para normalizar los valores obtenidos y para igualar la carrera-ejecutar variación, y luego el valor normalizado para cada pico se dividió por un correspondiente valor en las muestras de referencia y multiplicado por 2. el resultado final MLPA de cada muestra se presenta en la barra-trama, en la que las barras muestran el valor del número de copias relativo de las sondas posteriores.
número de copias de EGFR análisis por PCR cuantitativa (qPCR) y las gotas de PCR digital (ddPCR)
el análisis qPCR se realizó con el uso de MESA VERDE qPCR Mastermix Plus para SYBR Ensayo (Eurogentec, Seraing, Bélgica), de acuerdo a las recomendaciones generales del fabricante. ddPCR se realizó con el uso del sistema QX200 y EvaGreen Supermix (Bio-Rad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones generales del fabricante, como se describió anteriormente [18,19]. El análisis ddPCR se realizó en un formato multiplex con el co-amplificación de control de amplificación y una de la prueba de amplicones en una reacción. Para conseguir la separación adecuada de los tipos de gotas, la intensidad de la señal de prueba y de control se diferencia por la longitud '' y los cebadores amplicones concentraciones. Para ambos métodos se utilizó el mismo conjunto de cebadores de PCR: (i) prueba de amplificación de
EGFR
exón 2: delantero GCAGTTGGGCACTTTTGAAG imprimación, cebador inverso TTCCAAATTCCCAAGGACCA (concentración en qPCR-300 nM, concentración en ddPCR-100 nM , la longitud de amplificación 83 pb); (Ii) prueba de amplificación de EGFR para el exón 18: hacia adelante TTGTGGAGCCTCTTACACCC imprimación, revertir CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGC imprimación (concentración en qPCR-300 nM, concentración en ddPCR-100 nm, la longitud de amplificación 64 pb); (Iii) control de amplificación: GCTGACCTGTTGGCTGAAAA cebador directo, revertir GAATCGCTGTGGCCTTGATG imprimación (concentración en qPCR-300 nM, concentración en ddPCR-200 nM; la longitud de amplificación 113 pb). Los amplicones o bien se superponen, o se encuentran en estrecha colaboración con las siguientes sondas de MLPA: EGFR_e2, EGFR_e18 y ctrl_1, respectivamente. La temperatura de recocido optimizado se fijó en 59 ° C y 58 ° C, en qPCR y ddPCR, respectivamente
Resultados
Las 239 muestras se analizaron como muestras ciegas por dos métodos:. (I) un ensayo comercial de RT-PCR (EGFR-RT52; Entrogen Inc.) que cubre 29 de las mutaciones oncogénicas más comunes en los exones 18, 19, 20 y 21 del
EGFR gratis (para más detalles, véase la página web de los fabricantes; http://www.entrogen.com/web2/egfr-mutation-analysis-kit) y (ii) un ensayo de diseño personalizado MLPA (EGFRmut +) que permite simultáneamente la detección de amplificaciones y pequeñas mutaciones en
(para más detalles véase [14]) (Fig. 1). En resumen, además de las sondas estándar dosis-sensibles (DS), el ensayo EGFRmut + también se compone de dos tipos de sondas de mutación sensible. (MS) sondas de mutación son sensibles a los tipos de sondas DS que son específicos de la secuencia de tipo silvestre, pero se solapan con los sitios de las siguientes mutaciones: G719A /S /C (G719X) en el exón 18 (sonda E18), in- deleciones de marco en el exón 19 (sonda e19), S768I y las inserciones en marco en el exón 20 (sonda e20-1), T790M en el exón 20 (sonda e20-2) y L858R en el exón 21 (sonda e21). La ocurrencia de una de estas mutaciones en una muestra analizada causa una disminución en la señal de la sonda MS- correspondiente. El ensayo EGFRmut + también contiene tres sondas de mutación sensible (MS +) que son específicos para secuencias mutantes. Las señales procedentes de estas sondas se producen sólo si la mutación correspondiente está presente. Dos de estas sondas reconocen las secuencias de los
EGFR
mutaciones más comunes (la más común deleción en marco en el exón 19, c.2235_2249del15 (sonda e19 +) y L858R (sonda e21 +)), y el tercero reconoce la mutación T790M, que se asocia con la resistencia TKI (sonda e20-2 +). Además, EGFRmut + contiene unas pocas sondas DS que son específicos, ya sea para
MET
o
ErbB2 Windows que permite amplificaciones de estos genes a detectar.
A) Mapa de la
EGFR
gen con las posiciones de los amplicones de RT-PCR (EGFR-RT52) y sondas de MLPA (ensayo EGFRmut +) indica (líneas verticales virtud de la hoja). Los EGFRmut + sondas de mutación sensible se indican en rojo. Las posiciones de oncogénico
EGFR
mutaciones se indican sobre el mapa. B) Los resultados de RT-PCR que representan (desde arriba) (i) la muestra de referencia (una muestra con ninguna mutación o amplificación), (ii) una muestra con el más común deleción en marco en el exón 19 (c.2235_2249del15) , (iii) una muestra con tanto L858R en el exón 21 y T790M en el exón 20, y (iv) una muestra con una deleción en marco en el exón 19 (c.2235_2249del15) y
EGFR
amplificación. En cada gráfico, los resultados que se solapan de las 8 reacciones de RT-PCR que abarcan 29
se muestran EGFR
mutaciones. Las líneas rojas indican las curvas de amplificación específica positivos de
EGFR
mutaciones (señalado en el gráfico), y la línea de base de color verde representa la señal no amplificada debido a la falta de la mutación evaluado en la muestra analizada. C) electroferogramas MLPA de muestras analizadas por RT-PCR (panel B). Los ID de sonda se indican en la electropherograms. Los asteriscos indican las sondas de control; las puntas de flecha de color rosa indican una reducción de la señal de MS- sondas y el aumento de la señal de las sondas MS +, respectivamente; y las puntas de flecha negras indican las señales de
EGFR
sondas específicos de amplificarse. parcelas D) Bar correspondiente a la electropherograms que se muestran en el panel C y que representa el valor normalizado número de copias (eje y) de cada sonda (eje x). Las puntas de flecha de color rosa indican un valor de número de copia reducida de las sondas MS- y un valor incrementado el número de copias de la MS + sondas, respectivamente.
Características de las mutaciones detectadas
En total, se detectaron 30 mutaciones en 29 de las 239 muestras (12,1%). Tanto L858R y T790M fueron encontrados en una muestra. Entre las mutaciones identificadas fueron 16 deleciones en marco en el exón 19 (53%), 9 sustituciones L858R (30%), 2 sustituciones L861Q (7%), una sustitución de G719X, una inserción en marco en el exón 20 y una sustitución T790M (S1 Tabla; resume en la Tabla 1). Las mutaciones fueron mucho más frecuentes en las mujeres que en los hombres 22/68 7/142 (24,4% frente a 4,7%, respectivamente; p & lt; 0,0001). Una estratificación de la frecuencia de mutación por edad [& lt; 55 (13%), & gt; 55 (11,9%)] y el tipo de muestra [FFPE (11,9%), las muestras citológicas (12,5%)] no mostraron influencias significativas de estos factores en la frecuencia de mutación (Tabla 1). Tampoco se aprecia una disminución de la frecuencia de mutaciones en las muestras con un menor porcentaje de células tumorales (PTC). Tenga en cuenta sin embargo, que sólo una pequeña fracción (aproximadamente 5%) de las muestras analizadas tenían PTC≤30%.
Comparación de los métodos de detección de mutaciones de RT-PCR y MLPA
No es hay un método estándar de oro para la detección de mutaciones en muestras de cáncer, en los que una mutación particular puede dar cuenta de una fracción muy baja de ADN analizadas. Por lo tanto, para evaluar la calidad del ensayo EGFRmut + basado en MLPA, lo comparamos con el método de RT-PCR utilizado rutinariamente y bien validado. Una comparación directa de los resultados de RT-PCR y MLPA mostró una muy alta concordancia entre estos dos métodos (98,7% resultados concordantes), así como 100% de especificidad (no hay falsos positivos) y% de sensibilidad 90 (27 de las 30 mutaciones detectadas) de la prueba EGFRmut +. Entre las 3 mutaciones que no fueron detectados por el ensayo de EGFRmut + eran dos casos con la sustitución L861Q, que no está cubierta por las sondas EGFRmut + (Fig. 1A), y una mutación G719X en una muestra mínima PTC (15%). Además, entre las muestras analizadas por MLPA eran 4 duplicados ciegos con 3 mutaciones diferentes. En todos los casos, los resultados de las muestras duplicadas fueron concordantes. Por otra parte, hay que señalar que las sondas MS + (señal de ocurrencia) detectar mutaciones más fácilmente y con una confianza más alta que MS- sondas (disminución de la señal). Las sondas MS + permite la detección de mutaciones confianza, incluso cuando esas mutaciones representan una fracción muy pequeña del ADN analizado (~ 10%) en las muestras con PTC≤30%. Por ejemplo, la mutación L858R, que está cubierto por ambas sondas MS + y S-, en tres muestras, no se pudo detectar por una disminución en la señal de la sonda MS- pero no se detectó fácilmente por la ocurrencia de una señal de baja pero clara de la sonda de MS +. La menor sensibilidad de las sondas MS- produce fundamentalmente debido a la variación relativamente alta de la señal de las sondas DS en muestras de cáncer. La mayor variación de la señal MLPA en muestras de cáncer se ha observado anteriormente y los resultados en su mayoría de la heterogeneidad genética de las muestras de cáncer [20] y la calidad más baja y la degradación frecuente de muestras de ADN aisladas de tejidos FFPE [21-25].
la amplificación de EGFR, erbB2 y MET y su relación con la frecuencia de mutación
la ventaja adicional del ensayo MLPA es que, además de la detección de mutaciones, sino que también proporciona información acerca de un número de copias relativo de todas las secuencias de sondas /analizados . Permite una estimación aproximada de la fracción de mutaciones detectadas en las muestras analizadas y permite la detección de cambios de número de copias (amplificaciones) en los genes analizados:
EGFR
,
MET
y
ErbB2
. Definir relativa número de copias 3-4 como una "ganancia" y ≥4 como una "ampliación", se identificaron 12 muestras (5%), 17 (7%) y, 2 (1%) con una ganancia y 7 (3%) , 11 (5%) y, 3 (1%) muestras con amplificaciones de
EGFR
,
MET
, y
erbB2
, respectivamente (Tabla S1 y Fig. 2 ). La distribución de la amplitud del número de copias fue similar para los 3 genes, con los más grandes amplificaciones de más de 10 copias. Al igual que en el caso de las mutaciones, se observó una frecuencia mucho más alta de
EGFR
ganancias /amplificaciones en las mujeres que en los hombres (18% frente al 2%, respectivamente; p & lt; 0,0001). Una tendencia similar se observó para no
MET gratis (13% versus 11%, respectivamente), y un revertida, pero se observó una tendencia significativa no para
ErbB2 gratis (1% frente al 3%).
A) Ejemplos de
EGFR gratis (muestras v-vi),
MET
(muestras VII-VIII) y
erbB2 gratis (muestras ix-x) amplificación detectado por el ensayo de EGFRmut +. B) Características de las muestras con
EGFR
,
MET Opiniones y
ErbB2
ganancias /amplificaciones. Las muestras muestran en la Fig. 1D (ii-iii) y la fig. 2A (vi-x) se indican en la primera columna. El sexo y
EGFR
estado de la mutación de cada muestra se indican en la segunda y la tercera columnas, respectivamente. Las columnas 4-6 muestran los valores de número de copias de
EGFR
,
MET
y
ErbB2
, respectivamente. Las células de color azul oscuro indican amplificaciones (número de copias ≥4), y las células de color azul claro indican aumentos (número de copias 3-4). C) La frecuencia de
EGFR
mutaciones en las muestras con
EGFR
amplificación,
EGFR
ganancia y normal
EGFR
número de copias.
Como se muestra en la Fig. 2, las ganancias y amplificaciones de
EGFR
,
MET
y
ErbB2
eran mutuamente excluyentes. Sin embargo, se observó muy fuerte asociación entre la aparición de
EGFR
mutaciones y
EGFR
amplificación (prueba de Chi cuadrado para la tendencia; p & lt; 0,0001). Todas menos una muestra de cáncer (90%) con
EGFR
amplificación y 7 de cada 12 muestras (58%) con
EGFR
ganancia tenían un
EGFR
mutación.
Un examen cuidadoso de los resultados de MLPA con
EGFR amplificaciones
(ver ejemplos en la Fig. 1 y Fig. 2) indica que la disminución de la señal de las sondas MS- y el aumento de la señal de las sondas MS + (fracción de copias mutadas) es aproximadamente el mismo o incluso mayor que el aumento en
EGFR
número de copias. Este resultado sugiere que todas las copias amplificadas de
EGFR
en las muestras mutantes contienen la mutación (es decir, que sólo el alelo mutante se somete a amplificación) y que las mutaciones se producen como un evento de activación temprana, haciendo
EGFR
amplificación beneficioso para el cáncer. Nótese que todas las muestras contienen una cierta cantidad de ADN normal, lo que puede aplanar el número de copias cambios observados y enmascarar el efecto en las muestras con un menor nivel de amplificación.
Esta observación nos llevó a secuenciar los exones 18-21 (que codifica el dominio tirosina quinasa) en las muestras con
EGFR
ganancias /amplificaciones en la que no se conoce ningún
EGFR
mutación se encontró. El análisis de la secuencia no reveló nuevas variantes de secuencias que podrían ser mutaciones oncogénicas o gatillo
EGFR
amplificación.
Replicación del análisis del número de copias de EGFR (detección de amplificación) con el uso de qPCR y ddPCR
Para confirmar los resultados de
EGFR
copiar análisis del número de reanalyzed un panel de muestras de cáncer, incluyendo todas las muestras con
EGFR
amplificación, con el uso de qPCR y ddPCR. Ambos métodos se basan en principios completamente diferentes que MLPA. El qPCR es un método que utiliza la cuantificación en tiempo real de producto de PCR, lo más comúnmente utilizado para la verificación de las variantes de número de copias, identificados en tanto normal (no cáncer) y las muestras de cáncer (por ejemplo, [26,27]). El ddPCR es un nuevo método de cuantificación, basándose en el recuento absoluto de moléculas ensayadas y de DNA de referencia, clonalmente amplificados en miles de agua-en-aceite de gotas de tinta de reacciones (emulsión de PCR). La utilidad de ddPCR con el colorante EvaGreen dsDNA vinculante para la estimación del número de copias precisa Recientemente se ha demostrado en varios estudios [18,19,28]. Con el uso tanto de qPCR y ddPCR, las señales de dos de ensayo amplicones, que se encuentra en el exón 2 y el exón 18 de
EGFR
, se analizaron respecto a la señal de control de amplificación (correspondiente a MLPA ctrl_1 sonda). El análisis realizado mostró que los resultados de ambos qPCR y ddPCR se correlacionan muy bien con los valores de número de copia relativos, determinada con el uso de MLPA (coeficiente de correlación R = 0,941 y R = 0,927, respectivamente), y que las señales de las muestras con
EGFR
de amplificación fueron bien separada de las señales de las muestras sin amplificación (S1 Fig.). Se ha de señalar sin embargo, que no puede excluirse que algunas muestras con valores de número de copias en el límite pueden ser mal clasificados. Algunas discrepancias en los valores de señal absolutos, determinados por MLPA, y los métodos de referencia pueden resultar de diferentes conjuntos de regiones de control utilizados para la normalización y del hecho de que MLPA es un método multiplex y mide el número de copias en múltiples puntos en un gen de interesar. Se obtuvieron resultados similares para
MET
y
ErbB2 gratis (datos no mostrados).
Discusión
Es bien conocido que la frecuencia de
EGFR
mutaciones difiere sustancialmente entre las poblaciones humanas. La frecuencia de mutación es más alta en los asiáticos (45-52%); menor en los europeos (24%), los afroamericanos (20%) y los hispanos (17%); y la más baja en los australianos blancos (7%) ([11,29] y las referencias dentro). También entre los europeos, diferentes frecuencias de
fueron reportados EGFR mutaciones
: por ejemplo, 17% en España [30] y el 10% en el sur de Alemania [31]. En este estudio, basado en un análisis exhaustivo de un número considerable de muestras de adenocarcinoma de pulmón, que caracteriza y se determinó la frecuencia de
EGFR
mutaciones en pacientes de Polonia (12,1%). Nuestro análisis mostró una frecuencia mucho más alta (4,8x) de
EGFR
mutaciones en las mujeres que en los hombres (24% vs. 5%, respectivamente). Se ha observado una tendencia similar para
EGFR
ganancias /amplificaciones, que mostraron una mayor representación excesiva (9x) en las mujeres que en los hombres (18% frente a 2%, respectivamente). A pesar de que la mayor frecuencia de
EGFR
mutaciones en las mujeres que en los hombres se ha observado muchas veces antes, la sobrerrepresentación de los
EGFR
mutaciones en las mujeres observada en nuestro estudio es, según nuestro conocimiento, una del más alto reportado hasta el momento (con exclusión de los estudios con un número muy pequeño de muestras /mutaciones) ([11,29] y las referencias dentro). La información sobre-población específica y la frecuencia característica de las mutaciones son factores epidemiológicos importantes que pueden influir en la aplicación de los procedimientos de diagnóstico y tratamiento adecuados óptimas para la población en particular.
moleculares diagnósticos de cáncer abordan material tumoral heterogénea diversificada sobre una base diaria. ADN se aísla de los tumores resecados quirúrgicamente (frescas o FFPE) y de aguja fina y las células en forma de aguja de aspiración transbronquial ecografía endobronquial. Cada una de estas muestras histológicas o citológicas pueden tener diferentes y, a veces muy bajo PTC, y que a menudo muestran un nivel sustancial de la degradación del ADN (en especial las muestras FFPE). Además, la fijación en formol puede dañar el ADN y dar lugar a modificaciones de secuencia. Todos estos factores causan diferentes tipos de artefactos que pueden conducir a ambos resultados falsos positivos y falsos negativos.
En este estudio, hemos probado un ensayo EGFRmut + MLPA (un método estándar de sensibilidad) como un segundo método de nivel y se compara nuestros resultados con los de un ensayo de RT-PCR comercial bien validado (un método de alta sensibilidad). Estos dos métodos se basan en principios completamente diferentes. En RT-PCR, la detección de mutaciones se basa en la hibridación de sondas de mutación específica TaqMan, pero en MLPA, la detección de mutaciones se basa en la ligadura y la posterior amplificación de tipo salvaje o sondas de mutación específica. Nuestros resultados indican que EGFRmut + es un ensayo robusto que muestra una alta reproducibilidad, especificidad y sensibilidad. Un pequeño número de mutaciones no detectadas o bien no estaban cubiertas por las sondas de MLPA (n = 2) o se ha producido en una muestra mínima de PTC (n = 1). El ensayo EGFRmut + nos permitió detectar mutaciones en todos los tipos de muestras citológicas (e histológico; fresca y congelada FFPA) y nos permitió detectar mutaciones en muestras con diferentes PTCs (20-90%). Sin embargo, hay que señalar que las sondas MS + permiten más robusto de detección de mutaciones de MS- sondas hacen y que la calidad de los resultados de MLPA es generalmente menor para las muestras de cáncer que para las muestras de ADN de la línea germinal. La calidad inferior de cáncer de MLPA resultados se debe a las características antes mencionadas de las muestras de cáncer y se ha informado y discutido anteriormente [23-25,32]. Los factores adicionales que hacen que el ensayo MLPA atractivo como de segundo piso
EGFR
método de detección de mutaciones son la baja cantidad de ADN (50-100 ng) necesarios para el análisis (no se requiere la extracción de la muestra adicional o preparación, y el misma muestra de ADN puede ser utilizado tanto para la RT-PCR y análisis MLPA), un corto tiempo de vuelco (& lt; 2 días), y de bajo costo (aproximadamente $ 5 más el costo inicial de la síntesis de la sonda, aproximadamente $ 3,000). En el caso de los ensayos utilizados rutinariamente, el costo de la síntesis de la sonda puede ser ignorado porque la cantidad de las sondas sintetizadas es suficiente para cientos de miles de análisis.
Además de
EGFR
detección de mutaciones , el ensayo EGFRmut + también permite la detección de
EGFR
,
MET
y
erbB2
amplificación.