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PLOS ONE: Endógeno MDM2-C humano es altamente expresado en cánceres humanos y funciona como un independiente de p53 Crecimiento Activator

2014/11/7


Extracto

cánceres humanos sobreexpresan
MDM2
, a través de una T para variación de G en un polimorfismo de un solo nucleótido en la posición 309 (
MDM2
SNP309), tienen p53 funcionalmente inactivado que no es efectiva degradada. También tienen una alta expresión de la transcripción empalmados alternativamente,
C-MDM2
. Por otra parte longitudinalmente
MDM2
transcripciones se expresan en muchas formas de cáncer humano y cuando se expresan de forma exógena se transforman células humanas. Sin embargo, ningún estudio hasta la fecha ha detectado endógenos isoformas de la proteína MDM2. Los estudios con la expresión exógena de variantes de empalme se han llevado a cabo con
MDM2-A
y
MDM2-B Opiniones, pero el
C-MDM2
isoforma se ha mantenido prácticamente sin explorar. Hemos abordado la influencia celular de forma exógena expresó MDM2-C, y preguntamos si la proteína endógena MDM2-C estaba presente en los cánceres humanos. Para detectar la proteína MDM2-C endógena, creamos un anticuerpo MDM2-C humana al empalme de unión de los exones epítopo cuatro y diez (C410) MDM2 y validado el anticuerpo con
in vitro
traducida larga duración en comparación con MDM2 MDM2 -DO. Curiosamente, hemos descubierto que MDM2-C co-migra con MDM2-FL en aproximadamente 98 kDa. Utilizando el anticuerpo C410 validado, se detectó alta expresión de endógeno MDM2-C en líneas celulares de cáncer humano y tejidos de cáncer humano. En el receptor de estrógeno positivo (ER +)
MDM2
G /G SNP309 línea celular de cáncer de mama, T47D, se observó un aumento de la proteína MDM2-C endógeno con el tratamiento con estrógenos. MDM2-C localizado en el núcleo y el citoplasma. Se examinó la actividad biológica de MDM2-C por exógenamente que expresa la proteína y observamos que MDM2-C no objetivo de manera eficiente para la degradación de p53 o reducir la actividad transcripcional de p53. exógenos expresión de MDM2-C en
p53
células cancerosas humanas-null aumento de la formación de colonias, lo que indica propiedades oncogénicas de p53-independiente. Nuestros datos indican un papel de MDM2-C que no requiere la inhibición de la p53 para aumentar la proliferación de células cancerosas y la supervivencia

Visto:. Okoro DR, Arva N, Gao C, Polotskaia A, Puente C, M Rosso , et al. (2013) endógeno humano MDM2-C se expresa altamente en cánceres humanos y funciona como un activador del crecimiento independiente de p53. PLoS ONE 8 (10): e77643. doi: 10.1371 /journal.pone.0077643

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América

Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: 12 de septiembre de 2013; Publicado: 11 Octubre 2013

Derechos de Autor © 2013 Okoro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia (MCB- 0.744.316), una donación de la Fundación de Investigación de cáncer de mama, y ​​una beca de la clínica traslacional Science Center (CTSC) TR000457 del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Tranlsational de los Institutos nacionales de Salud de J. Bargonetti. También fue posible en parte por un premio infraestructura para el Hunter College, el número de concesión MD007599 del Instituto Nacional de Salud para Minorías y Disparidades de Salud, un componente de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de NIMHD o NIH. HACER. fue apoyado en parte por un premio Imán CUNY y M. R. fue apoyada por el Programa SAM-lugar a Hunter College 3R25-GM060665. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la actividad oncogénica de MDM2 está asociada con la sobre expresión de la proteína MDM2 en los cánceres humanos [1-3]. Mientras que algunas isoformas de MDM2 pueden formar una asociación física directa con los demás p53 no lo hacen [3,4]. MDM2 regula la proteína p53 a través de proteasoma mediada por la degradación [5-10] y la represión transcripcional [5,11-14]. Esta actividad oncogénica mediada por p53 de MDM2 es mejor conocido como MDM2 funciones canónicas. Sin embargo, MDM2 también es conocida por poseer funciones independiente de p53 [15-19] que se hace referencia como mejor MDM2 funciones no canónicos.

La sobre-expresión de MDM2 debido a un polimorfismo de un solo nucleótido de timina a guanina (T a G) en la posición 309 de la
MDM2
gen (
MDM2
SNP309) se asocia con un aumento de la incidencia de cáncer y la agresividad [20-23]. Este
MDM2
cambio SNP309 nucleótido aumenta la afinidad de unión para el factor de transcripción constitutiva, Sp1 [21]. Las células homocigotos para el G /G
MDM2
SNP309 han mejorado
MDM2
de transcripción y proteínas de alta MDM2 niveles. MDM2 sobre-expresión en los cánceres a menudo se acompaña con la sobreexpresión de corte y empalme alternativo
MDM2
transcripciones [3,24-28]. Más del 40 humana empalmados alternativamente y de forma aberrante
se ha informado de MDM2
transcripciones, sin embargo no todos son el resultado de buena ósea de eventos de splicing alternativo [29]. No obstante, el
MDM2
variantes de empalme representan la diversidad potencial que está de acuerdo con las conclusiones de la Enciclopedia de Elementos de ADN (ENCODE) Consorcio del Proyecto. ENCODE destaca previamente no reconocidos elementos reguladores candidatos, y los mensajes codificados, en el genoma humano [30]. La diversidad de
mdm2
empalmado mensajes codificados a partir de dos promotores independientes tiene la capacidad de aumentar el proteoma cáncer humano [31]. Por lo tanto, no es sorprendente que
MDM2
células SNP309 demostrar una mayor diversidad en sus empalmados alternativamente
MDM2
transcripciones con la expresión sustancial de la
MDM2-C Versión taquigráfica [32].

A pesar de que más del 40
MDM2
se han identificado transcripciones empalmados alternativamente [29], sólo cinco, (
MDM2-A
través de

MDM2-E) se ha demostrado para expresar la proteína
in vitro
[3]. La expresión de estos cinco
mdm2
transcripciones hace que las células NIH3T3 para formar focos asociado a tumor [3]. Sin embargo, sólo dos isoformas de la proteína MDM2,-A y B, se han estudiado ampliamente por sus funciones biológicas. La expresión exógena de MDM2-A [33,34], o MDM2-B en ratones [35], aumenta la formación de tumores en un
p53
-null, o el fondo de p53 comprometida causando un espectro tumoral alterado. Sin embargo, la función biológica de MDM2-C sigue sin determinarse.

Nos preguntamos si las células cancerosas que expresan altos niveles de
C-MDM2
ARNm expresado proteína MDM2-C endógena. La hipótesis de que
C-MDM2
altos niveles de transcripción codificados a partir del alelo G
MDM2
SNP309 en los cánceres humanos daría lugar a altos niveles de proteína MDM2-C endógena y conferirían funciones oncogénicas. Las células con MDM2 sobre-expresión a través del G /G
MDM2
SNP309 tiene la proteína p53 estable, que es co-localizada con p53 en la cromatina [14]. Por lo tanto, la hipótesis de que MDM2 sobre-expresión a través del G /G SNP309 podría producir una isoforma de la proteína MDM2-C que no degradaría p53. Por lo tanto, nos dispusimos a determinar la función celular de forma exógena expresada MDM2-C. También nos preguntamos si las células cancerosas que expresan altos niveles de la proteína MDM2-C endógena de
C-MDM2
ARNm, también expresado.

expresión endógena de la proteína MDM2-C nunca ha sido detectado debido a la ausencia de anticuerpos que detectan específicamente las isoformas de MDM2 hechos de los ARNm empalmados alternativamente. La
MDM2-C
transcripción no contiene los exones 5 a 9, que codifica una parte del dominio de unión de p53. Hemos creado un anticuerpo específico diseñado para detectar los aminoácidos codificados por los exones que flanquean MDM2-C 4 y 10, que nombramos C410. El uso de este anticuerpo MDM2 se observó altos niveles basales de proteína MDM2-C endógena en varios MDM2 sobre-expresión de líneas celulares de cáncer y tejidos. También se observó que, en presencia o ausencia de p53, de forma exógena expresada MDM2-C promueve el aumento de la formación de colonias. En conjunto, nuestros resultados indican que endógeno MDM2-C se expresa en tipos de cáncer y que las funciones de MDM2-C de forma independiente de p53 para promover la tumorigénesis.

Resultados

MDM2 sobre-expresión de las células tienen altos niveles de transcripciones MDM2-C

Muchas líneas celulares de cáncer humano sobre-expresan la proteína MDM2 y se han utilizado para los estudios anteriores MDM2 [14,21,32,36,37]. Utilizamos estas líneas celulares para examinar la relación de
C-MDM2
transcripciones de larga duración
MDM2
transcripciones. Las líneas celulares examinadas incluyen dos expressors altos MDM2: células SJSA-1 de tipo salvaje
p53 Opiniones y sobre-expresión de MDM2 debido a
amplificación de MDM2
gen (y el
MDM2
alelos SNP309 T /T) y las células Manca de tipo salvaje
p53 Opiniones y sobre-expresión de MDM2 de la
MDM2
SNP309 G /G alelos. También se incluyen dos expressors bajas MDM2: la línea celular K562 que es
p53
-null y tiene un
MDM2
SNP309 T /G alelos y las células ML-1 con p53 de tipo salvaje y
MDM2
alelos SNP309 T /T.

La transcripción de
C-MDM2
se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y análisis de transferencia Northern (ver Figura 1 y Figura S1). La cuantificación del total de
MDM2
transcripciones, por el norte de blot, mostró el mayor nivel de
MDM2
transcripciones en células SJSA-1, que contienen 25 copias del
MDM2 gen
[37]. Un alto nivel de
MDM2
la transcripción también se observó en las células Manca. Para cuantificar específicamente las transcripciones que contienen los exones 6 y 7, se llevó a cabo QRT-PCR cuantitativa con una sonda a la unión exón 6-7 (ver Figura 1B sonda en barras negras y verdes Figura 1C). Para cuantificar específicamente
C-MDM2
transcripciones, se utilizó un cebador directo PCR diseñado para reconocer el exón 4 y el exón 10, la unión (denominado 4:10) y un cebador inverso al exón 12 (Figura 1B, ver cebadores en rojo, y la figura 1C barras grises). En las células Manca, se detectó la expresión de bajo nivel de la
MDM2 Versión taquigráfica que contiene los exones 6 y 7, de aquí en adelante referido como un
MDM2 Versión taquigráfica de longitud completa (Figura 1C). Es importante destacar que las células Manca tenían una expresión de alto nivel de la
MDM2-C Versión taquigráfica que resulta en una disminución de la relación de larga duración a
MDM2-C Versión taquigráfica (Figura 1C, MANCA comparar negro a gris bar). Esto fue en contraste con
MDM2
transcripción en células SJSA-1, que produjo niveles similares de
C-MDM2
y
MDM2
de larga duración transcripciones (Figura 1C, SJSA -1 comparar negro de barras grises). Los bajos niveles de
MDM2
transcripciones fueron producidos en células K562 y por lo tanto se utilizaron estas células como la línea celular normalizador. células ML-1 mostraron
MDM2
los niveles de transcripción similares a K562. Esto indicó que la sobre-expresión de la proteína MDM2 en las células SJSA-1 y células Manca correlacionados con altos niveles de la
MDM2-C
transcripción. Por otra parte, las células Manca tuvieron la mayor proporción de
C-MDM2
de larga duración transcripción. Este resultado puede ser debido a la
MDM2
SNP309 G /G genotipo que dirige la transcripción a partir del promotor inducible P2
.

A. La cuantificación utilizando la imagen J tras el análisis de transferencia Northern de ARN de las muestras no tratadas MANCA, SJSA-1, ML-1 y células K562. Un
MDM2
sonda de ADN para el exón 12 se generó por PCR y radiomarcado con α
32P dCTP. Los niveles de transcripción se compararon con K562 para la expresión basal y normaliza los niveles de ARN a
GAPDH
. Se muestra un promedio de cuatro experimentos independientes. Las barras de error indican el error estándar.

B. Esquemática de
MDM2
mensajes detecta usando una sonda Taqman para los exones 6 y 7 (6-7 sonda) o cebador directo para 04:10 y cebador para la 12 inversa (4: 10-12 cebador) para
MDM2-C
.

C. QRT-PCR con 4:10 adelante y marcha atrás exón 12 vs. sonda TaqMan para el exón 6 y 7 de
MDM2
se realiza para detectar
C-MDM2
y
MDM2
(con los exones 6 y 7) transcripciones. El
se detectaron MDM2-C
transcripciones a través de Syber verde y
MDM2 gratis (con los exones 6 y 7) se detectaron las transcripciones a través de la tecnología Taqman. Los niveles de transcripción se compararon con K562 para la expresión basal y normaliza los niveles de ARN a
GAPDH
. Se muestra un promedio de tres experimentos independientes. Las barras de error indican el error estándar.

D. QRT-PCR del ARN utilizando la tecnología Taqman de genes diana de p53,
p21
y
puma
después del tratamiento con el daño del ADN 8μM etopósido durante 3 horas. Los datos de cada línea celular se presenta como normalizado a su propia muestra de control sin tratar para la activación de plegado y normalizado para los niveles de ARN a
GAPDH
. Se muestra un promedio de tres experimentos independientes. Las barras de error indican el error estándar.

Con el fin de ver si el
MDM2
de cuerpo entero para
C-MDM2
relación de transcripción influyó en la respuesta a p53, se compararon la activación de dos genes diana de p53,
p21
y
puma
. Se han tratado K562, ML-1, SJSA-1 y Manca células con etopósido para iniciar una respuesta al daño del ADN, y supervisado
p21
y
puma
la activación de QRT-PCR (Figura 1D). Como era de esperar, el
p21
y
puma
genes fueron activadas en
p53
-null células K562. En las células SJSA-1 y Manca, que tienen p53 de tipo salvaje y de alta MDM2, la
p21
y la activación de genes comprometida
puma
genes demostró en comparación con la activación detectado en las células ml-1 , con células Manca que demuestran la actividad menos p53 (Figura 1D).


Mdm2
empalmados alternativamente productos como
MDM2-B Opiniones aumentar después de daño en el DNA [38-40]. Para determinar si el
MDM2-C
transcripción fue inducida por p53, las células tratadas con etopósido se analizaron mediante qRT-PCR para
MDM2-C
. Las células ML-1 respondieron al tratamiento etopósido con un fuerte incremento de la
C-MDM2
los niveles de transcripción (Figura S2, barra roja). El compromiso de la activación mediada por p53 de
MDM2-C
se observó en las células SJSA-1 y Manca similares a la activación observada para comprometida
puma
(Figura S2 y la Figura 1D). Estos datos muestran que la actividad transcripcional de p53 se ve comprometida en la MDM2 sobre-expresión de las células y sus niveles basales de alta
MDM2-C
(especialmente en células Manca) era independiente de p53.

Validación de MDM2-C anticuerpo específico

Para determinar si el alto nivel de
C-MDM2
transcripciones en MDM2 sobre-expresión de las células se traduce en proteína, que genera una MDM2-C anticuerpo policlonal específico. Inmunizamos conejos con una secuencia de péptido que contiene la secuencia de aminoácidos del exón humano 4-10 nudo de empalme (Figura 2A). El péptido fue altamente inmunogénica y el anticuerpo fue validado para la especificidad utilizando
in vitro
proteínas MDM2 traducidas en en el extracto de germen de trigo. Tanto MDM2-C, y MDM2-FL, se pueden traducir
in vitro
en proteína [3,41]. La adición de
35S metionina en el sistema nos permitió detectar rápidamente las proteínas MDM2 etiquetados específicamente utilizando autorradiografía (Figura 2B). La
35S metionina marcada MDM2-C y las proteínas MDM2-FL migraron en SDS-PAGE en tamaños determinados previamente (descrito como más alto que los tamaños predichos de 36 kDa y 55 kDa, respectivamente) [41,42]. La movilidad más lenta de MDM2 en SDS-PAGE previamente se ha atribuido a la gran dominio ácida de la proteína [42].

A. Esquemática de longitud completa MDM2 (MDM2-FL) y MDM2-C. dominios funcionales bioquímicas de las proteínas retenidas 'se muestran como los códigos de color. La secuencia del péptido utilizado como inmunógeno que contiene el empalme de MDM2-C humana se muestra. Glicina (G) y cisteína (C) los residuos se añadieron a la N-terminal del péptido para facilitar la conjugación a una proteína inmunorreactiva, hemocianina de lapa californiana (KLH).

B.
35S metionina se utiliza como fuente de radiactividad a la etiqueta
en

in vitro
proteínas traducidas.
En

in vitro
traducciones de pcDNA3-MDM2-FL y pcDNA3- P2mdm2-C utilizando el TNT acopla sistema de extracto de germen de trigo. Resultando MDM2-FL y MDM2-C proteínas se sometieron a electroforesis en a10% de SDS-PAGE en una proporción de 5: 1: 1. El gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y exponer a una película para la detección significativa MDM2-C producto de proteína. Trigo lisado de germen sin ADN se utilizó como control negativo.

C. La inmunoprecipitación de
35S metionina marcado radiactivo
en

in vitro
traducida MDM2-FL y proteínas MDM2-C utilizando MDM2 C410 y anticuerpos policlonales de suero pre-inmune. proporciones de proteína como se muestra en B se utilizaron en el ensayo de tirar hacia abajo. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE 10% transferido a una membrana de nitrocelulosa y expuestos a la película para la detección de proteínas. Esto es representativo de tres experimentos independientes.

D.
En

in vitro
traducida proteína producida en lisado de reticulocitos de conejo (RRL carriles 1 y 2) se compararon con la proteína traducida en el extracto de germen de trigo (WGE calles 3 y 4). Estas proteínas se detectaron, ya sea con 4B11 de anticuerpos (panel superior) o 2A9 (panel inferior). HRP-conjugado anti-ratón y anti-conejo se utilizaron como anticuerpos secundarios.

A fin de validar la especificidad del anticuerpo MDM2-C, se llevó a cabo un experimento de inmunoprecipitación del extracto de germen de trigo
in vitro
traducidas
35S radiomarcados productos de proteína MDM2-C y MDM2-FL. El anticuerpo policlonal de MDM2 C410 bajó MDM2-C (Figura 2C, comparar los carriles 3 y 8), pero no MDM2-FL (Figura 2C, comparar carriles 4 y 9). Por otra parte, MDM2-C y MDM2-FL
in vitro
proteínas traducidas se inmunoprecipitaron usando el anticuerpo policlonal MDM2 C410 y analizados por Western blot con MDM2 mezcla de anticuerpos monoclonales. Sólo se detectó la proteína MDM2-C (Figura S3, comparar los carriles 2 y 3).

Con el fin de abordar más a fondo la migración diferencial de la MDM2-C y MDM2-FL, se comparó la inmunorreactividad de
in vitro
proteínas traducidas realizadas tanto en los sistemas de extracto de germen de trigo (WGE) lisado de reticulocitos de conejo (RRL) y. Cuando las proteínas se traducen
in vitro
, son modificados después de la traducción de los factores representados en el sistema de extracto celular. Como se predijo, el anticuerpo monoclonal C-terminal 4B11 detecta isoformas MDM2-FL MDM2-C y mientras que el anticuerpo 2A9, apuntando a la región central, detectó sólo MDM2-FL (Figura 2D, comparar paneles superior e inferior para los carriles 1 y 3 en comparación con los carriles 2 y 4). Curiosamente, la MDM2-C producido en el sistema de RRL mamíferos resultó en alta expresión de tres especies diferencialmente que migran en la electroforesis en SDS-PAGE con una forma co-migrar con MDM2-FL a aproximadamente 98 kDa (Figura 2D, comparar carril 1 con el carril 2 ). Además, examinó las posibles modificaciones post-traduccionales de MDM2-C en las células humanas (y la migración de MDM2-C a aproximadamente 98 kDa) mediante la utilización de un
vitro
sistema de traducción HeLa en de Pierce (Figura 3A y 3B ). Es importante destacar que, en este sistema, también se detectó una forma de MDM2-C a aproximadamente 98 kDa. Nuestros datos indican claramente que algunos de la isoforma de proteína MDM2-C producido en este sistema humanos co-migra con MDM2-FL. Por lo tanto proporcionando pruebas de que la detección de MDM2 por anticuerpos que pueden interactuar con el de longitud completa y isoformas variantes de corte y empalme resultará en al menos algunos polipéptidos co-migración en una transferencia de Western. Curiosamente, utilizando el sistema de HeLa, que por primera vez, que se detectó algo de proteína MDM2-C en el peso molecular predicho de 36 kDa (Figura 3B carril 1).

La inmunoprecipitación usando MDM2 C410 y los anticuerpos en suero policlonal pre-inmunes con células HeLa
en

in vitro
traducido MDM2-C Extrae utilizando sueros inmunes pre, MDM2 C410 y N-20 policlonal anticuerpos. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE 10% por duplicado. A. Una mitad se tiñó con azul de Coomassie para la detección de proteínas. B. Las muestras de medio de gel se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y MDM2 se detectó con el anticuerpo monoclonal 4B11. Conjugado con HRP anti-ratón se utilizó como anticuerpo secundario. Las flechas representan la proteína MDM2-C.

MDM2-C proteína se expresa de forma endógena

Mientras corte y empalme alternativo
MDM2
mensajes se han detectado en los cánceres, no hay documentación sobre polipéptidos producidos de forma endógena a partir de este tipo de mensajes . Se comparó la naturaleza co-migración de MDM2-C y MDM2-FL utilizando la variable de la inmunorreactividad de los extractos celulares de cáncer humano sondeadas con MDM2 C410 anticuerpo policlonal (para la detección de MDM2-C) a los mismos extractos sondadas con el ratón pan-reactiva MDM2 anticuerpo monoclonal 4B11 (para la detección de MDM2-C y MDM2-FL). Se observaron altos niveles de expresión de MDM2 en MANCA y extractos SJSA-1 de células con anticuerpo 4B11 (Figura 4A, carriles 9 y 10). Manca células producen la más alta expresión de MDM2-C cuando se detectó con C410 (Figura 4A, carril 1). El anticuerpo policlonal de MDM2 C410 apenas detecta MDM2-C en ML-1 en las células (Figura 4A, carril 3). Sin embargo, se reconoció la proteína MDM2-C en los extractos celulares a partir de células K562, que son células de genotipo G /T, así como en las células SJSA-1 que tienen una amplificación del gen (Figura 4A, carriles 2 y 4). La expresión de MDM2-C en las células ML-1 y células Manca correlacionado con la transcripción basal de
mdm2
de longitud completa y
MDM2-C
(comparar la Figura 1C a la figura 4A). Por razones que no están claras, una correlación específica entre los
MDM2
transcripciones y isoformas de la proteína MDM2 no era evidente para las células SJSA-1 y células K562. Esto puede haber sido debido a la proporción de proteína MDM2-FL a la variante de corte y empalme, y la posterior E3 ubiquitina ligasa degradación mediada por proteínas de MDM2 que reducían la estabilidad de proteínas.

A. El análisis de transferencia Western de extractos de células enteras a partir de: MANCA, SJSA-1, ML-1 y las células K562. los niveles de proteína MDM2-C se analizaron a través de anticuerpos en suero policlonal MDM2 C410 (C410, carriles 1-4) y MDM2 total se detectaron con el anticuerpo monoclonal 4B11 (carriles 9-12 y una larga exposición para el carril 12). Actina se utilizó como control de carga. suero policlonal inmune Pre se utilizó como control negativo. anti-ratón conjugado con HRP y anti-conejo se utilizaron como anticuerpos secundarios. Esto es representativo de tres experimentos independientes.

Bi. Manca células se lisaron ya sea como extractos de células enteras (WCE) o en citosólica compartments- celular (CITO) y la cromatina (CHR). Las proteínas se detectaron como en los niveles de proteína A. MDM2-C se analizaron a través de anticuerpos en suero policlonal MDM2 C410 (C410, carriles 1-3) y MDM2 total fue detectada con el anticuerpo monoclonal 4B11 (carriles 1-9 y una larga exposición para el carril 9).

Bii. Tubulina y Fibrillarin se utilizaron para mostrar fraccionamiento celular eficiente de extracto.

C. Girando el disco microscopía confocal de células Manca. Las células se fijaron, se permeabilizaron y se incubaron con p53, MDM2 C410 y anticuerpos policlonales de suero pre-inmune. Las láminas fueron incubadas con secundario de cabra conjugado con Alexa anti-conejo y cabra conjugado con FITC anti-ratón. DAPI se utilizó para teñir los núcleos celulares. Fotos fueron tomadas en la ampliación 60X. Las flechas indican las regiones de la proteína Mdm2-C de localización nuclear.

La alta expresión de MDM2-C en las células Manca sugirió que la proteína sería claramente detectable en los compartimentos celulares. Se examinó la localización de endógeno MDM2-C usando métodos de fraccionamiento celular (Figura 4B) y disco giratorio microscopía confocal (Figura 4C). El uso de métodos de fraccionamiento de la cromatina, que hemos detectado MDM2-C en el citoplasma y en la cromatina (Fig. 4BI, carriles 1-3) y la mayoría de las isoformas de MDM2 detectados con 4B11 estábamos en el citoplasma (Fig. 4BI, carriles 7-9 ). Exógena expresada isoformas MDM2-A y MDM2-B han sido previamente demostrado que la exposición de localización nuclear [43] a pesar del hecho de que las regiones que codifican las señales de localización nuclear y exportación de MDM2 se empalman a cabo. Del mismo modo, MDM2-C, que también tiene estas regiones empalmados a cabo, localizada en el citoplasma y núcleo de estas células hematopoyéticas (comparar DAPI y área manchada anticuerpo en la Fig. 4Ci-iii sondeó con C410 y Fig 4Cvi-viii probaron con pre-inmune suero de conejo). células Manca expresan altos niveles de proteína p53 de tipo salvaje [14], y se observó un poco de co-localización de las proteínas p53 y MDM2-C en el citoplasma y el núcleo, como se indica por el color amarillo de combinación (Fig. 4CV). Si bien la importancia de la co-localización no se entiende inmediatamente, creemos que es una observación importante. Las flechas rojas apuntan a una fuerte tinción de anticuerpos que representa una observación consistente de la proteína localizada en áreas nucleares discretos (Figs. 4Ciii y 4CV). Dado que las células hematopoyéticas Manca son pequeñas y no tienen mucho citoplasma, que era posible que lo que parecía citoplasmática estaba en la periferia del núcleo. Por lo tanto, hemos examinado la localización MDM2-C en las células epiteliales de cáncer de mama y también observamos nuclear y citoplasmática MDM2-C localización (Figura 5C).

A. células MCF-7 y T47D se cultivaron y se trataron con 10 nM de estrógenos (E2) durante cinco días. Las células fueron lisadas y las proteínas se analizaron mediante transferencia de western. anticuerpo anti-conejo suero policlonal MDM2 C410 se utilizó para la detección de proteínas. suero policlonal Pre-inmune se utilizó para detectar la señal de fondo. anti-ratón conjugado con HRP y anti-conejo se utilizaron como anticuerpos secundarios. Actina se utilizó como control de carga. Esto es representativo de tres experimentos independientes.

Bi. células MCF-7 y T47D se lisaron para células enteras o extractos de fraccionamiento de la cromatina. 50? G de las muestras se resolvieron mediante 10% SDS-PAGE y MDM2 C410 sueros policlonales (carriles 1 - 6) y el anticuerpo monoclonal MDM2, 4B11 (carriles 13 - 18) fueron utilizados para la detección de proteínas. Pre inmune se utilizó para detectar la señal de fondo (carriles 7 - 12). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron los mismos que en A.

Bii. Tubulina y Fibrillarin se utilizaron para determinar la pureza de fraccionamiento.

C. Spinning microscopía de disco de las células MCF-7 y T47D. Las células se cultivaron en cubreobjetos y se trataron con 10 nM E2 durante cinco días. Las células se fijaron y se incubaron con anticuerpo p53 y el anticuerpo policlonal de Mdm2 C410 para la detección de proteínas. suero pre-inmune se utilizó como control negativo para la tinción. Las láminas fueron incubadas con secundario de cabra conjugado con Alexa anti-conejo y cabra conjugado con FITC anti-ratón. DAPI se utilizó para teñir los núcleos. Las células se visualizaron en la ampliación 60X. Las flechas representan las regiones de localización MDM2-C.

MDM2-C aumenta con el tratamiento con estrógenos y se localiza en distintos focos puntiformes en el citoplasma y núcleo de las células de cáncer de mama ER +

MDM2 es elevada después del tratamiento de estrógenos de receptor de estrógeno positivo (ER + ) células de cáncer de mama [36]. Además,
mdm2
caída en tratados de estrógeno células de cáncer de mama da lugar a una disminución en la proliferación, proporcionando así evidencia de la importancia de MDM2 en el crecimiento de células de cáncer de mama. La sobreexpresión de MDM2 se asocia con un aumento de
MDM2
empalmados variante transcripciones [3,24-28]. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de la proteína MDM2-C en dos líneas celulares de cáncer de mama ER +, MCF-7 y T47D, que poseen diferentes genotipos para
MDM2
SNP30
9 gratis (T /G frente a G /G, respectivamente) y
p53 gratis (de tipo salvaje frente al mutante, respectivamente). Se observó un ligero aumento de la proteína MDM2-C después de tratamiento con estrógenos de las células MCF-7 y T47D (carriles Figura 5A 2 y 4). La razón de la diferencia en el peso molecular de las isoformas de MDM2-C podría ser debido a diferencias en las modificaciones post-traduccionales en lisados ​​de células enteras. El suero anticuerpo policlonal inmune pre fue utilizado como un control de fondo para el anticuerpo C410 MDM2 y dio como resultado prácticamente ninguna detección de la proteína (Figura 5A carriles 5-8). Además, en las células T47D, la
MDM2-C
mensaje se aumentó dos veces después de tratamiento con estrógenos (datos no mostrados). Fraccionado las células y se analizaron las fracciones citoplasmáticas y de la cromatina para la proteína MDM2-C (Fig. 5BI para C410, conejo pre inmunológico y el ratón monoclonal 4B11 la reactividad y la Fig. 5Bii para los marcadores de pureza fracción). La fracción citoplásmica no contenía la cromatina, como es evidente por la ausencia de tinción fibrillarin y cada fracción mostró un poco de proteína reactiva MDM2-C (Fig. 5BI carriles 2 y 5). Curiosamente, la fracción de la cromatina de las células MCF-7 mostró una fuerte especies reactivas MDM2-C y menos proteína reactiva 4B11 (Fig. 5BI, comparar los carriles 3 y 15).

Para determinar si el tratamiento con estrógenos influyó en la localización de MDM2-C en las células MCF-7 y T47D, que lleva a cabo immunoflouresence. La MDM2-C en las células MCF-7 se detectó en un patrón de punteado difuso y citoplasmática y la localización nuclear antes y después del tratamiento con estrógenos (Figs. 5Cii y 5Cvii). A pesar de muy poco p53 detectable en las células MCF-7 (Figs. 5Civ y 5Cix), la p53 citoplásmica apareció para co-localizar con la MDM2-C, como se detectó co-tinción como una señal de mezcla de color amarillo (Figs. 5CV y 5Cx ).

La visualización de MDM2-C por immunoflouresence en las células T47D, antes y después de tratamiento con estrógenos, muestra tinción similar a células MCF-7 (Fig. 5Cxii y 5Cxvii). Sin embargo, las células T47D no demostraron co-localización de p53 mutante y MDM2-C (Fig. 5Cxv y 5Cxx). La razón de esta diferencia en la co-localización de células MCF-7 y las células T47D podría estar en el hecho de que estas líneas celulares tienen de tipo salvaje frente a proteínas p53 mutantes, respectivamente. Muchos expresaron exógenamente MDM2 empalmados isoformas no interactúan con p53 [43,44] y son conocidos para empalmar a cabo la mayoría del dominio de unión de p53 [29]. Hemos observado que las células T47D expresan p53 mutante predominantemente nuclear (Fig. 5Cxiv y 5Cxix), mientras que las células MCF-7 células expresan bajos niveles de p53 de tipo salvaje citoplasmáticas y nucleares [45].

MDM2-C es altamente expresado en liposarcoma o tejidos de carcinoma de mama

La expresión de alto MDM2 se observa a menudo en los liposarcomas y se utiliza actualmente como un biomarcador de diagnóstico del cáncer [46-49]. Estábamos interesados ​​en examinar si el anticuerpo C410 sería útil examinar MDM2-C como biomarcador liposarcoma en muestras de pacientes. Se utilizó la inmunohistoquímica (IHC) para detectar la expresión de MDM2-C en el tejido liposarcoma humano a partir de muestras de pacientes humanos. Para dos de los tres conjuntos de muestras analizadas, se observó tinción positiva para MDM2-C (imagen representativa se muestra en la Figura 6A). El suero inmune pre detecta baja tinción de fondo y cuando se examinaron los tejidos lipoma, sólo se detectó tinción positiva baja MDM2-C. Hemos iniciado estudios similares utilizando tejido de cáncer de mama micro-arrays y hemos detectado MDM2-C en los carcinomas ductales invasivos (Figura 6B). El uso de inmunohistoquímica, se observó un patrón de tinción similar de los tejidos positivos con MDM2 C410 y anticuerpo 4B11 MDM2 (Fig. 6Bii y 6Bii), mientras que IgG de ratón no dio como resultado la tinción de tejidos (Fig. 6Biii).

A. La inmunohistoquímica de lipoma y liposarcoma tejidos utilizando MDM2 C410 y anticuerpos policlonales de suero pre-inmune. Se utilizaron anticuerpo secundario biotinilado, ABC y DAB Reactivo de Vector Labs. Se obtuvieron imágenes a 20x y 40x. H & amp; E se refiere al hematoxilina y eosina tinción de contraste. Actina se utilizó como control de carga.

Apoyo a la Información
Figura S1.

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