Extracto
Antecedentes
Los rápidos diagnósticos fiables de las mutaciones del ADN son altamente deseables en la investigación y ensayos clínicos. El desarrollo actual en este campo va simultáneamente en dos direcciones: 1) métodos de alto rendimiento, y 2) ensayos de portátiles. Los enfoques no enzimáticos son atractivos para ambos tipos de métodos, ya que permitirían la detección rápida y relativamente barato de los ácidos nucleicos. microscopía de fluorescencia moderna está teniendo un enorme impacto en la detección de biomoléculas con una resolución previamente inalcanzable. Sin embargo, no hay métodos sencillos para detectar el ADN de una manera no enzimática mediante microscopía de fluorescencia y análogos de ácidos nucleicos se han propuesto hasta ahora.
Métodos y Resultados
Aquí mostramos una nueva enzima libre abordar de manera eficiente para detectar mutaciones cancerosas. Este ensayo incluye enriquecimiento objetivo específico del gen, seguido de recocido a oligonucleótidos que contienen ácidos nucleicos bloqueados (LNA) y, finalmente, la detección por microscopía de fluorescencia. El LNA que contiene sondas de visualización de alta afinidad de unión y especificidad de ADN que contienen mutaciones, que permite la detección de la abundancia mutación con un colorante intercalante EvaGreen. Se utilizó una segunda sonda, lo que aumenta el número total de pares de bases con el fin de producir una señal de fluorescencia mayor mediante la incorporación de más moléculas de colorante. De hecho se muestra aquí que el uso de colorantes y sondas LNA EvaGreen, ADN genómico que contiene
BRAF V600E
mutación se pudo detectar por microscopía de fluorescencia a bajas concentraciones femtomolares. En particular, este fue de al menos 1000 veces por encima del límite de detección potencial.
Conclusión
En general, el nuevo ensayo describimos podría convertirse en un nuevo enfoque para el diagnóstico rápido, fiable y libre de la enzima de cáncer u otras dianas de ADN asociados. Es importante destacar que la estequiometría de tipo salvaje y mutante objetivos se conserva en nuestro ensayo, lo que permite una estimación precisa de la abundancia mutante cuando se cumple el requisito del límite de detección. Mediante microscopía de fluorescencia, este enfoque presenta la oportunidad de detectar el ADN en la resolución de una sola molécula y directamente en la muestra biológica de elección
Visto:. Miotke L, Maity A, Ji H, J Brewer, Astakhova K (2015 ) Enzyme-Free detección de mutaciones en el ADN sintético cáncer usando sondas de oligonucleótidos y microscopía de fluorescencia. PLoS ONE 10 (8): e0136720. doi: 10.1371 /journal.pone.0136720
Editor: Thomas Abraham, Pennsylvania State Hershey Facultad de Medicina de Estados Unidos