Extracto
modelos ortotópico de varios tipos de tumores son ampliamente utilizados en experimentos terapéuticos antitumorales en estudios preclínicos. Sin embargo, hay algunas maneras de controlar adecuadamente efecto terapéutico en modelos de tumores ortotópico, especialmente para tumores invisibles desde el exterior. En este estudio tuvo como objetivo establecer un método de imagen no invasivo bioluminiscente semi-cuantitativo de seguimiento de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de esófago. Se confirmó que la línea celular de cáncer de esófago TE8 implanta de forma ortotópica en el esófago abdominal del
nu /nu
ratones (n = 5) desarrollado no sólo un tumor principal en el sitio implantado, sino también metástasis en los ganglios linfáticos locales y peritoneal diseminaciones dentro de 6 semanas después de la inoculación. Hemos establecido una línea celular que expresa de forma estable TE8 el gen de la luciferasa de luciérnaga (TE8-Luc). Hemos demostrado que las células TE8-Luc implantaron subcutáneamente en
nu /nu
ratones (n = 5) creció con el tiempo hasta 5 semanas después de la inoculación. El volumen del tumor se correlaciona fuertemente con la intensidad luminiscente emitida desde el tumor, que se cuantificó utilizando el sistema de imágenes IVIS. A continuación, mostró que las células TE8-Luc implantados ortotópicamente en el esófago abdominal del ratón (n = 8) también formado un tumor y que la intensidad luminiscente de un tumor tal, como se detecta por IVIS, aumentado con el tiempo hasta 7 semanas después de la inoculación y por lo tanto era probable que refleje la progresión tumoral. Por tanto, proponemos que este modelo ortotópico de cáncer de esófago, monitoriza utilizando el sistema de imágenes no invasiva semi-cuantitativa IVIS, serán útiles para los experimentos terapéuticos in vivo contra el cáncer de esófago. Se espera que esta configuración experimental para contribuir al desarrollo de nuevas tecnologías terapéuticas para el cáncer de esófago en los estudios preclínicos
Visto:. Kuroda S, T Kubota, Aoyama K, Kikuchi S, H Tazawa, Nishizaki M, et al. (2014) Establecimiento de un método no invasivo semi-cuantitativa bioluminiscente de imágenes para el seguimiento de un cáncer de esófago modelo de ratón ortotópico. PLoS ONE 9 (12): e114562. doi: 10.1371 /journal.pone.0114562
Editor: Sunil Singhal, Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Agosto, 2014; Aceptado: 11 de noviembre de 2014; Publicado: December 10, 2014
Derechos de Autor © 2014 Kuroda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la subvención-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes y Tecnología, Japón (TF) y subvenciones de el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón (TF). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer esofágico es uno de los tipos más comunes de cáncer en el mundo. Histológicamente, carcinoma de células escamosas de más del 90% de los cánceres en Japón, mientras que las cuentas de adenocarcinoma de más de la mitad de los cánceres en los EE.UU. El pronóstico del cáncer de esófago es bastante pobre entre los cánceres del tracto gastrointestinal, tales como el cáncer gástrico y el cáncer de colon como los cánceres de esófago son propensos a la metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión directa de los órganos circundantes. A pesar de los avances en el diagnóstico precoz y en el desarrollo de técnicas y dispositivos quirúrgicos, así como en la quimioterapia, la radioterapia y su combinación, cáncer de esófago aún no ha sido superado satisfactoriamente y este es un campo en el que se espera que los nuevos agentes terapéuticos eficaces para desarrollarse en un futuro próximo [1] -. [3] |
En el campo del descubrimiento de fármacos, modelos de tumores ortotópico son, sin duda, mejores modelos que los modelos subcutáneos para la evaluación de la eficacia terapéutica de nuevos fármacos, ya que reflejan una mejor evolución de la enfermedad de los tumores originales [4], [5]. Una variedad de modelos de tumor ortotópico se han usado en estudios en animales, incluyendo los modelos de cáncer de colon, de páncreas, hígado, pulmón, próstata, células renales, vejiga, mama, melanoma y tumores cerebrales [6]. Sin embargo, sólo hay unos pocos informes de modelos ortotópico de cáncer de esófago a pesar de la necesidad urgente de un modelo de este tipo. La falta de un modelo ortotópico de cáncer de esófago parece ser debido a los problemas de ubicación y el tamaño del esófago, además de la dificultad técnica de establecer un modelo ortotópico anatómica.
La disponibilidad de un método para evaluar la eficacia terapéutica es otro problema cuando se utiliza un modelo ortotópico. Aunque la tasa de supervivencia o el peso corporal se ha utilizado comúnmente para evaluación, estos parámetros no reflejan directamente la eficacia terapéutica debido a la influencia de una serie de otros factores en tal eficacia. Unos modalidades de diagnóstico se han utilizado como métodos no invasivos para el control de un modelo ortotópico, como la resonancia magnética (MRI) [7], [8] y emisión de positrones (PET) /tomografía computarizada (CT) [9 ], [10]. Además, el uso de la proteína fluorescente verde (GFP) - [4], [11] y luciferase- [12], [13] las líneas de células que expresan haber proporcionado un enfoque interesante para el desarrollo de una técnica de imagen no invasiva
Aquí mostramos el establecimiento de un modelo original ortotópico de cáncer de esófago en ratones, que se desarrolló metástasis en los ganglios linfáticos locales y diseminaciones peritoneales además del tumor principal. Usando este modelo se confirmó que el sistema de imágenes IVIS (Xenogen, Alameda, CA) fue apropiada y útil como método de monitorización no invasiva para la progresión tumoral en este modelo.
Materiales y Métodos
el protocolo experimental animal fue aprobado por el Comité de Ética de experimentación Animal de la Universidad de Okayama, y todos los ratones utilizados en este estudio fueron anestesiados con ketamina /xilacina o isoflurano /oxígeno para los experimentos y la eutanasia con dislocación cervical bajo anestesia.
líneas celulares y cultivos celulares
El esófago línea de carcinoma de células escamosas humano, TE8 (RIKEN BRC Cell Bank, Japan) se cultivó en medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), 100 unidades /ml la penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. TE8 transfectadas con el plásmido vector de luciferasa de luciérnaga (pGL-Control-RSVneo) (amablemente proporcionado por el Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Universidad de Osaka, Osaka, Japón) y se clonaron por dilución limitante (TE8-Luc) se cultivó como se describe para el anterior pero con TE8 la adición de 0,2 mg /ml de geneticina (G418) (Life Technologies, 10131-027) al medio. El nivel medio de actividad luciferasa por 5.0 × 10
4 células TE8-Luc fue 1462 unidades relativas de luz (RLU).
modelo de tumor subcutáneo
células TE8-Luc (2 × 10
6 células /ratón) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de cinco 5-6 semanas de edad BALB /c
nu /nu
ratones. El diámetro perpendicular de cada tumor se midió una vez a la semana hasta 5 semanas después de la inoculación del tumor. El volumen del tumor se calculó utilizando la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) =
a
×
b
2 × 0,5, donde
a
es el diámetro más largo,
b
es el diámetro más corto, y 0,5 es una constante para calcular el volumen de un elipsoide.
ortotópico modelo de cáncer de esófago
hembra BALB /c
nu /nu
ratones (5-6 semanas de edad) fueron fijadas en una posición supina. Una incisión en la piel 7 a 10 mm de largo se hizo en el medio de la parte superior del abdomen de la apófisis xifoides. El hígado fue levantado y el estómago se tira hacia abajo con pinzas de modo que el esófago abdominal podría ser visto. Una jeringa de 1 ml con una aguja 31 de calibre, en el que las células se suspendieron TE8 o TE8-Luc en Matrigel a una concentración de 2 × 10
6 células /20 l, se insertó en la pared anterior del estómago y luego subserosally movido hacia el esófago abdominal través de la unión esophagastric. a continuación, se inyectaron lentamente las células. Por último, el abdomen se cerró con suturas (Película S1).
El uso de este método, las células fueron implantadas TE8 ortotópica en cinco ratones BALB /c
nu /nu
ratones. A las 4 semanas después de la inoculación del tumor, los cinco ratones fueron operados de nuevo para comprobar el desarrollo del tumor, y luego uno de los cinco ratones se sacrificaron y su tumor principal y un nodo linfáticos locales se recogieron para su examen histológico. A las 6 semanas después de la inoculación, los otros cuatro ratones se sacrificaron todo después de la re-laparotomía y la observación.
células TE8-Luc se implantaron en el esófago abdominal de ocho ratones BALB /c
nu /nu
ratones utilizando el mismo método. A las 3 semanas después de la inoculación tumoral, todos los ratones fueron operados para comprobar el desarrollo del tumor, y luego cinco de los ocho ratones, en los que se observó la formación de tumores en el esófago, se monitorizaron una vez a la semana utilizando el sistema de imágenes IVIS se describe a continuación hasta 7 semanas después de la inoculación del tumor.
IVIS imágenes
luciferina, el sustrato de la luciferasa, se inyectó intraperitonealmente en ratones a una dosis de 150 mg /kg de peso. Los ratones fueron anestesiados y colocados en la etapa de formación de imágenes del aparato de IVIS en el (modelo subcutáneo) abdominal o la posición supina (modelo ortotópico). Las imágenes se recogieron cada pocos minutos de 10 a 30 minutos después de la inyección luciferina utilizando el Sistema de IVIS Imaging (Xenogen, Alameda, CA), y los fotones emitidos desde el tumor y su entorno se cuantificaron utilizando Living imagen de software (Xenogen).
análisis estadístico
análisis de regresión lineal simple se realizó usando Microsoft Excel para examinar la correlación entre el volumen del tumor y la intensidad luminiscente, y el coeficiente de determinación, R
2, se calculó para evaluar la fuerza de la la asociación.
resultados
TE8 células se inyectan en el espacio subserosa del esófago abdominal de ratones BALB /c
nu /nu ratones
formaron un tumor (fig. 1A) en cuatro de los cinco ratones y desarrollado metástasis en los ganglios linfáticos locales (Fig. 1C) en dos de los cinco ratones a las 4 semanas después de la inoculación del tumor. A las 6 semanas después de la inoculación, otro ratón tenía hallazgos de diseminaciones peritoneal (Fig. 1E). La formación de un tumor principal (Fig. 1B) y las metástasis a los ganglios linfáticos locales (Fig. 1D) también fueron confirmados por los hallazgos histológicos. El tumor creció principal en el espacio submucoso a pesar de ser inyectado en el espacio subserosos, mientras que no invade la capa de la mucosa.
células A) TE8 implantado en el esófago abdominal formado un tumor en el sitio implantado (flecha blanca ) a las 4 semanas después de la inoculación del tumor. B) SE el señor tinción del tejido embebido en parafina del tumor principal (A) mostró que el tumor se había extendido en el espacio submucoso del esófago abdominal. (T: Tumor, L: Lumen, E: capa de epitelio, H: capa muscular) C) células TE8 implantados en el esófago abdominal desarrollados ganglios local de metástasis en los ganglios (punta de flecha blanca) a las 4 semanas después de la inoculación del tumor. D) H.E. tinción del tejido incluido en parafina de los ganglios linfáticos locales (C) indica histológicamente metástasis en los ganglios linfáticos. Las células implantadas TE8 E) diseminaciones peritoneales ortotópica también desarrollados (flechas negras) a las 6 semanas después de la inoculación del tumor. Las barras de escala; 2 mm (A, C, E), 500 m (B, D)
A continuación generamos células TE8-Luc, que expresan de forma estable el gen de luciferasa de luciérnaga, y implantado subcutáneamente estas células en ratones BALB /c
nu /nu
ratones. La luminiscencia de estas células se controló con el sistema de formación de imágenes IVIS para determinar si el volumen del tumor correlacionada con la intensidad luminiscente. células TE8-Luc formaron un tumor en los cinco ratones. A medida que los tumores crecieron, la intensidad luminiscente aumentó con el tiempo tal como se evaluó tanto visualmente (Fig. 2A) y cuantitativamente (Fig. 2B) (Fig. 2C). El volumen del tumor y la intensidad luminiscente estaban fuertemente correlacionadas entre sí (
2 = 0.9199 R) (Fig. 2D), lo que indica que la medición de la intensidad luminiscente es adecuado para la evaluación de la progresión tumoral.
A) imágenes IVIS se obtuvieron una vez a la semana hasta 5 semanas después de la inoculación subcutánea de células TE8-Luc. B) se cuantificó la intensidad luminiscente de fotones emitidos de cada tumor en las imágenes en (A). Ratón numeración corresponde a la numeración en (A). C) El volumen del tumor se calculó también una vez a la semana. D) La correlación entre la intensidad luminiscente emitida desde cada volumen del tumor y el tumor se evaluó estadísticamente utilizando los datos de (B) y (C).
Finalmente, se determinó si las células TE8-Luc podríamos formar un ortotópico tumor que creció con el tiempo. Cinco de los ocho ratones BALB /c
nu /nu
ratones en los que se implantaron células TE8-Luc ortotópicamente en el esófago abdominal desarrollaron un tumor en el sitio implantado a las 3 semanas después de la inoculación del tumor, lo cual fue confirmado por la re-laparotomía . Estos cinco ratones fueron controlados por IVIS una vez a la semana, y los fotones emitidos desde el tumor y sus alrededores aumentaron con el tiempo tal como se evaluó tanto visualmente (Fig. 3A) y cuantitativamente (Fig. 3B).
A) imágenes IVIS se obtuvieron una vez a la semana a partir de 3 a 7 semanas después de TE8-Luc inoculación del tumor ortotópico en el esófago abdominal. B) se cuantificó la intensidad luminiscente de fotones emitidos por cada tumor y sus alrededores en las imágenes en (A). Ratón numeración corresponde a la numeración en (A).
Discusión
Furihata et al. [14] fueron los primeros en reportar el establecimiento de un modelo de inoculación de esófago ortotópico en ratones en 2001, en la que se abrió la pared anterior del estómago y se inyectaron células tumorales en el espacio de la submucosa del esófago abdominal directamente después de la laparotomía. En contraste, se inyectaron células en el espacio subserosos del esófago abdominal sin abrir el estómago. Aunque su método es teóricamente un método más ideal que el nuestro, nuestro método es más simple y es todavía un método aceptable porque los tumores formados usando nuestro método crecieron y la propagación en el espacio submucoso a pesar de ser inyectado en el espacio subserosos como los hallazgos histológicos en la fig. 1C muestran. Dos de cinco de nuestros ratones modelo desarrollado metástasis en los ganglios linfáticos locales y un ratón exhibió diseminaciones peritoneales. No se encontraron metástasis evidentes para el hígado, los pulmones o los ganglios linfáticos del mediastino. Con el fin de generar un modelo ortotópico de cáncer de esófago más invasivo, puede ser necesario utilizar células más invasivos [15] o para usar muestras de tumores clínicos que tienen un alto potencial invasivo [4].
Ohara et al. [16] estableció un modelo de ratón ortotópico interesante de cáncer de esófago cervical y torácica mediante la inyección de células tumorales en la luz del esófago a través de la boca. Si bien este método parece simple en que no se requiere la técnica quirúrgica, puede ser difícil juzgar si las células tumorales se inyectan con precisión en el esófago debido a que el procedimiento se realiza inevitablemente a ciegas. Sin embargo, este método puede tener una ventaja sobre nuestro método en que causa pobre ingesta oral, que refleja mejor la progresión del tumor original. En nuestro estudio, el peso corporal no disminuyó en absoluto hasta justo antes de la muerte, a pesar del gran crecimiento tumoral y la diseminación (datos no mostrados).
Quatromoni et al. [17] informó recientemente inmunoterapia basada en adenoviral eficaz contra el cáncer de esófago, en el que un modelo de ratón ortotópico de cáncer de esófago estableció en la unión gastroesofágica usando la misma técnica que mostramos en se utilizó la película. En este modelo, los tumores crecieron con el tiempo confinado en el sitio de la inyección del tumor sin invasión directa de la mucosa esofágica. Sin embargo, los tumores no causar obstrucción de la luz del esófago y ninguna evidencia de ratones tenían disfagia y pérdida de peso significativa. Estas características son similares a los que mostramos en nuestro estudio.
Por el contrario, Gros et al. [18], [19] estableció un modelo de ratón de cáncer de esófago ortotópico usando una línea celular de cáncer de esófago altamente agresivo de la misma manera como el nuestro, en el que se detectan la diseminación metastásica en el hígado y los pulmones, así como a los ganglios linfáticos usando alta resolución imagen con GFP y por resonancia magnética, mientras que no fueron capaces de detectar metástasis en el hígado u otros órganos por la imagen de la luciferasa en nuestro estudio. Estos informes de Quatromoni et al. y Gros et al., incluyendo nuestro estudio, sugieren que el modelo de cáncer de esófago ortotópico establecido en la unión gastroesofágica y su método de creación es universal y reproductiva, y que este modelo puede causar la progresión del tumor, que está cerca de la práctica clínica real, tales como metástasis a los ganglios linfáticos, el peritoneo y el hígado u otros órganos además del crecimiento local del tumor.
a diferencia de los modelos subcutáneos, es difícil de analizar con precisión la progresión del tumor en modelos de tumores ortotópico. Aunque la tasa de supervivencia y el peso corporal se utilizan comúnmente como métodos de evaluación en estudios ortotópico, estos parámetros no reflejan directamente la eficacia terapéutica, ya que muchos otros factores también influyen en los resultados. El uso de células tumorales marcadas con el gen reportero de la luciferasa y bioluminiscente de imágenes, que actualmente es un método muy usado en el campo de la investigación, nos permite controlar el crecimiento del tumor de forma no invasiva in vivo, especialmente en los tejidos profundos [13]. Por lo tanto, lo que originalmente se establecieron células TE8-Luc que fueron establemente transfectadas con el gen de la luciferasa de luciérnaga y utilizados para la monitorización no invasiva.
En nuestro estudio, utilizando el sistema de imágenes IVIS, la intensidad luminiscente de fotones emitida desde tumores subcutáneos TE8-Luc fuertemente correlacionados con el crecimiento del tumor. Basándose en este hecho, por lo que es probable que un aumento en la intensidad luminiscente en un modelo ortotópico en el tiempo refleja con precisión la progresión tumoral. De hecho, en un estudio previo en el que cuantitativamente supervisó la eficacia terapéutica en este modelo ortotópico usando el sistema de imágenes IVIS, el cambio en la intensidad luminiscente parecía reflejar con precisión la eficacia terapéutica [20]. Por lo tanto, el método que se describe en el presente estudio para el establecimiento de un modelo de cáncer de esófago ortotópico en ratones y para la monitorización no invasiva con el sistema de formación de imágenes IVIS es un método muy útil y practicable, y se espera que contribuya al desarrollo de la novela tecnologías terapéuticas para el cáncer de esófago.
Apoyo a la Información
película S1. .
Cómo hacer un modelo de ratón ortotópico de cáncer de esófago
doi: 10.1371 /journal.pone.0114562.s001 gratis (MPG)
Reconocimientos
Los autores agradecen a Tomoko Sueishi y Tae Yamanishi por su excelente apoyo técnico.